人乳头瘤病毒16型DNA疫苗和基因佐剂及其应用

具体实施方式

以下将结合附图和实施例对本发明进行详细说明，其中实施例仅仅是说明而非限定的作用，本领域技术人员完全可以在以下披露的具体实施例的技术上作出改进，但是不超过本发明权利要求的范围或者本发明精神之内所作出的改进都会落入本发明的保护范围。

本发明采用PCR及基因克隆等分子生物学方法获得消除转化活性及保留并强化免疫活性的，具有SEQ NO.1所示的核苷酸序列的HPV16mE7抗原基因，然后将mE7与结核分枝杆菌热休克蛋白基因HSP70融合，得到mE7/HSP70融合抗原基因，再将mE7及mE7/HSP70基因插入真核表达载体VR1012，获得VR1012-mE7及VR1012-mE7/HSP70。同时采用PCR及基因克隆等分子生物学方法将含人白细胞介素-2信号肽(IL-2sig)的人IL-15成熟蛋白的cDNA基因序列插入真核表达载体VR1012，获得可高水平分泌表达IL-15的VR1012-IL-2sig/IL-15，作为疫苗的基因佐剂，然后进行动物免疫实验以评价mE7及mE7/HSP70DNA疫苗及IL-2sig/IL-15基因佐剂的免疫学活性。

实施例1.抗原基因mE7基因的改造方法：

从基因Bank内检索获得本领域技术人员公知的野生型人乳头瘤病毒16型E7基因序列(HPV16E7)，然后以HPV16E7基因为基础，对其同时进行多项改造：首先对E7基因进行多位点的定点突变，在E7基因的锌指结合区引入两个点突变C61G和C93G；在Rb结合区DLYCYEQ引入三个点突变，使DLYCYEQ突变为DGYGYGQ，然后再对E7基因进行“切割”后重排(Gene shuffling)，切点选两个，一个位于E7蛋白激酶识别位点处的两个丝氨酸之间(31S/32S)，另一个位于E7蛋白的第一个锌指结合区内的第60位及61位氨基酸之间(60K/61C)，将E7基因“切割”成三段，依次命名为a、b、c，然后按abbc规律重新排列，这样即可以保留天然E7蛋白所有可能存在的抗原表位，特别是CTL表位。为了提高该疫苗将来在人群的免疫保护效率，分别在上述改造后E7基因的5’及3’端添加了已被证实可被HLA*A0201呈递的E7_81-93及E7_11-20的CTL表位基因序列，添加的表位基因与E7蛋白序列之间用AAY连接，最后，按照哺乳动物偏爱的密码子对经上述改造后的E7基因进行密码子优化，基因合成法获得改造后的E7基因，命名为mE7。改造后E7基因的基因序列及氨基酸序列见序列表中的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

实施例2.重组mE7表达质粒的构建方法

通过实施例1改造后的HPV16E7基因命名为mE7具有SEQ ID NO.1的序列，采用基因合成法获得含mE7基因的克隆质粒Puc-mE7。按图1显示策略将mE7基因重组入VR1012真核表达质粒：首先根据mE7基因序列设计上游引物：mE7-5’：CGAGTCGTGCGGCCGCCACCATGGATCTGC和下游引物mE7-3’：GCTCTAGAGCTTAGGTAGTCTCGGGCTGCAG。上下游引物5’端3’端分别设计有NotI及XbaI酶切位点。以Puc-mE7质粒为模板进行PCR扩增mE7基因，反应条件为：95℃预变性300s，然后进行25个循环扩增反应：94℃变性60s，60℃复性60s，72℃延伸60s，最后72℃延伸300s。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，可见大小约500bp的特异性扩增片段，这与mE7基因的预期长度相符，获得含终止密码的mE7基因片段。用NotI和XbaI分别对PCR扩增得到含终止密码的mE7进行双酶切，回收双酶切的PCR片段，定量。同时用NotI及XbaI双酶切VR1012真核表达质粒载体，电泳后回收线性化的载体片段，定量。按4∶1的摩尔比加入上述制备的mE7基因片段和线性化的载体，T4连接酶16℃连接过夜，转化感受态大肠杆菌DH5α，挑克隆，质粒提取后，用NotI及XbaI双酶法进行鉴定后，，送A&B公司采用双脱氧核杆酸终止法测序结果显示插入序列为mE7基因序列，获得VR1012-mE7重组质粒。

实施例3.重组mE7/HSP70融合抗原基因表达质粒的构建方法

按图2所示策略将mE7/HSP70基因重组入VR1012真核表达质粒：为了获得mE7基因与分枝结核杆菌热休克蛋白基因HSP70的融合抗原基因mE7/HSP70，首先构建不含终止密码的mE7的疫苗用表达载体，具体步骤如下：根据mE7基因序列设计上游引物：mE7-5’：CGAGTCGTGCGGCCGCCACCATGGATCTGC及下游引物mE7-3’N：GCTCTAGAGCGGTAGTCTCGGGCTGCAG，上下游引物5′端3′端分别设计有NotI及XbaI酶切位点。按实施例2所述方法，获得不含终止密码的mE7的表达载体VR1012-mE7(N)，用于构建mE7/HSP70融合基因。然后根据分枝结核杆菌HSP70cDNA序列，设计上下游引物：HSP-5’：GCTCTAGACATGGCTCGTGCGG和HSP-3’：CGGGATCCTCACTTGGCCTCCC-3’，PCR法扩增HSP70基因，上下游引物5’和3’端分别设计有XbaI和BamHI酶切位点。以PGEM-HSP70质粒为模板，用pfuDNA聚合酶行PCR扩增，反应条件为95℃预变性300s，然后进行25个循环扩增反应：94℃变性60s，56℃复性60s，72℃延伸120s，最后72℃延伸300s，扩增产物电泳后可见大小约1800bp的特异性扩增片段，与HSP70基因的理论值相符。XbaI和BamHI双酶切后回收HSP70的PCR扩增片段，定量。同时取2μg的VR1012真核表达质粒进行NotI及BamHI双酶切反应，制备线性化的粘末端的载体片段。然后按照4∶4∶1的摩尔比加入NotI及XbaI双酶切的无终止密码子的mE7PCR扩增片段、XbaI和BamHI双酶切处理的HSP70的PCR扩增片段及NotI及BamHI双酶切处理的VR1012载体片段，T4连接酶连接过夜，转化感受态大肠杆DH5α菌，挑克隆，小量提取质粒后，用NotI及BamHI双酶法进行鉴定，结果表明重组质粒酶切后释放出的片段约2358bp，与mE7/HSP70融合基因的理论值大小相符，测序后序列与SEQ ID NO.3所示的序列相同。通过上述方法获得的mE7/HSP70融合基因全长为2358bp，其N端的1-471bp为mE7基因序列，中间为GCTCTAGAC(472-480bp)的连接片断，连接片段之后为分枝结核杆菌HSP70cDNA序列HSP70基因(481-2358bp)。mE7/HSP70融合基因序列见SEQ ID NO.3。

实施例4.人IL-15佐剂基因真核表达质粒的构建方法

人全长IL-15基因的N端为信号肽序列，编码长为48AA或21AA的导肽，含48AA的信号肽的IL15蛋白主要是以外泌形势表达。天然IL-15蛋白的分泌能力很低，为了获得有效的IL-15分泌表达，采用人IL-2的信号肽替换了天然IL-15的信号肽序列。按图3所示策略将IL-2sig/IL-15基因重组入VR1012真核表达质粒，构建含人IL-2信号肽的IL-15真核表达质粒及含IL-15信号肽的IL-15真核表达质粒，并对两者在真核细胞内的分泌表达作了检测和比较，择优选用。含有人IL-2信号肽的人IL-15成熟蛋白的cDNA基因序列的pCI-IL15质粒为模板，用pfuDNA聚合酶PCR扩增IL-2sig/IL-15基因，上游引物含PstI酶切位点，序列为5-5’：CAACTGCAGAACCATGTACAGGATGCAACTC；；下游引物含BamHI酶切位点，序列为IL15-3’：CGCGGATCCTCAAGAAGTGTTGATGAAC。反应条件为：95℃预变性300s后进入25个循环：94℃变性60s，59℃复性60s，72℃延伸60s，最后72℃延伸300s。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，可见大小约410bp的特异性扩增片段，与预期长度相符。琼脂糖凝胶电泳后回收PCR扩增片段，纯化后定量。然后于40μl的双酶切体系中，加入5μg的PCR扩增产物，10u的PstI及BamHI限制性内切酶，37℃孵育2h，回收酶切后的PCR扩增片段，定量。取2μg的VR1012真核表达质粒，于40μl的PstI及BamHI双酶切体系中，酶切4h后，回收线性化的载体片段。按5∶1的摩尔比加入上述制备的PCR扩增片段和线性化的载体片段，T4连接酶连接过夜，转化感受态大肠杆菌DH5α，挑克隆，小量提取质粒后，用PstI及BamHI双酶法进行酶切鉴定，结果显示重组VR1012-IL-2sig/IL-15的表达质粒酶切后释放出的片段长约420bp，与IL-2sig/IL-15的理论值大小相符，测序后证明序列正确，序列与SEQ ID NO.4.所示的IL-2sig/IL-15序列一致。

实施例4.质粒DNA的大量制备和纯化方法

碱裂解法大量提取重组质粒及对照质粒，然后采用聚乙二醇8000法对质粒进行纯化，琼脂糖凝胶电泳判断超螺旋闭合环状质粒DNA的百分比占质粒总量的90％以上，OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值在1.8和1.9之间。用生理盐水缓冲液稀释至1-2μg/μl，-20℃贮存备用。

实施例5.mE7及mE7/HSP70重组质粒表达检测方法(Western blot)

采用脂质体法转染Cos-7细胞：Cos-7细胞接种于35mm培养皿，各取2μg的表达质粒，5μl Liporfectamine2000(Invitrogen)按试剂盒说明书转染90％融合度COS-7细胞，37℃，5％CO₂培养48h，收获转染细胞。裂解后进行10％SDS-PAGE电泳，转膜，1％BSA-PBST封闭过夜后分别用1∶500稀释的HPV16E7兔多克隆抗血清和1∶1000抗结核分枝杆菌HSP71单克隆抗体4℃孵育过夜，洗涤后加入1∶5000稀释的HRP标记的羊抗鼠或羊抗兔IgG室温摇动孵育1h，充分洗涤后，加ECL反应液作用1min，感光后进行显影与定影处理。杂交结果如附图4A显示，VR1012-wtE7重组质粒转染组可见大小约为19kD特异性杂交带，与文献报道一致。VR1012-mE7重组质粒转染组可见相对分子量约为24kD特异性杂交带，与理论值基本一致。VR1012-mE7/HSP70重组质粒转染组可见大小约为90kD特异性杂交带，空载体转染组为阴性。抗结核分枝杆菌HSP71单克隆抗体杂交结果如附图4B所示，VR1012-mE7/HSP70重组质粒转染组可见大小约为90kD特异性杂交带，其它载体转染组为阴性。表明E7和HSP70基因获得了正确表达。

实施例6.人IL-15基因重组质粒的表达检测及高分泌表达IL-15佐剂基因质粒的筛选

采用双抗夹心ELISA法

1).各取2μg的VR1012-IL-2sig/IL-15和VR1012-IL-15质粒，采用脂质体法转染COS-7细胞，37℃，5％CO₂培养48h后，收获细胞培养上清。2ml的转染细胞培养上清经30kDa截留分子量的超滤离心管离心分离浓缩得到含有分子量为14-30kDa的蛋白溶液。

2).向已经包被好抗体的酶标板加入上述转染细胞培养上清浓缩液100μl，每份样品都作复孔，按试剂盒(R&D，D1500)说明书，对样品的IL-15进行定量检测。结果如附图5所示，两种质粒均能分泌表达IL-15，但VR1012-IL-2sig/IL-15的表达效率明显高于VR1012-IL15因此采用VR1012-IL-2sig/IL-15重组表达质粒作为基因佐剂协同mE7/HSP70基因疫苗免疫，以增强疫苗的免疫活性。

实施例7.Elispot法检测不同免疫组小鼠脾细胞中HPV16E7特异性的CD8⁺T细胞的数目

取5-6周龄的雌性C57BL/6小鼠，随机分为6组，分别用于VR1012(Control)，VR1012-IL-2sig/IL-15(IL-15)，VR1012-wtE7(wtE7)，VR1012-mE7(mE7)，VR1012-mE7/HSP70(mE7/HSP70)和VR1012-mE7/HSP70+VR1012-IL-2sig/IL-15(mE7/HSP70+IL-15)的质粒免疫，免疫接种的前一天，先后间隔1h于免疫接种部位-小鼠左右小腿后肌各垂直注射50μl的0.5％的布比卡因。戊巴比妥(75mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠后，每种质粒的免疫剂量为100μg/鼠，免疫3次，间隔一周，最后一次免疫一周后，取鼠脾细胞，按Mouse IFN-γElispot Kit试剂盒(BD，551083)说明书的要求及方法，分析各组特异性的分泌IFN-γCD8⁺T的活化情况，方法如下：

1).用50μl的10μg/ml大鼠抗小鼠IFN-γ抗体包被96孔板(MAIPS45)，4℃孵育过夜。

2).弃包被液，每孔加入250μl的PBST(0.5％Tween-20)洗板2次，然后每孔加入200μl的完全IMDM培养基，37℃孵育1h。

3).红细胞裂解法分离制备小鼠脾细胞，调整细胞浓度为10×10⁶/ml。

4).铺板：将刺激后的脾细胞系列稀释后，加入封闭后的包被板内，每组的细胞设置1×10⁶、5×10⁵和2.5×10⁵三个梯度，每个梯度设三个复孔，各组加入50IU/ml IL-2和5μg/ml E7_49-57肽，37℃，5％CO₂孵育40h。

5).取出96孔板，弃培养液，0.5％PBS-T洗板5次，0.05％PBS-T洗板1次。

6).每孔内加入100μl的2μg/ml的生物素标记的抗鼠IFN-γ(BD：51-1818KZ)检测抗体，4℃孵育过夜。

7).弃检测抗体，0.05％PBST洗6次。

8).稀释SP-HRP至250ng/ml，每孔加100μl，室温孵育1小时。

9).0.05％PBST洗3次，PBS洗3次。

10).每孔加入新鲜配制的100μlAEC底物溶液，室温孵育5min，显色后用去离子水终止反应，凉干后于ImmunoSpot Analyzer上扫描分析。

结果如附图6所示，mE7基因免疫诱发产生特异性CD8⁺T细胞的能力显著高于野生型E7基因，mE7/HSP70基因免疫组可诱发较高水平的分泌IFN-γ的CD8⁺T细胞，协同IL-15基因佐剂免疫可进一步显著增加分泌IFN-γ的CD8⁺T的数目。选取诱发产生特异性CD8⁺T细胞能力最强的两组mE7/HSP70及mE7/HSP70+IL-15组进行体内抗瘤活性的检测。

实施例8.mE7/HSP70DNA疫苗及与IL-15基因佐剂协同免疫后的抗移殖瘤免疫活性分析

5-6周龄的雌性C57BL/6小鼠，随机分为4组，分别用于VR1012(Control)，VR1012-IL-2sig/IL-15，VR1012-mE7/HSP70(mE7/HSP70)和VR1012-mE7/HSP70+VR1012-IL-2sig/IL-15(mE7/HSP70+IL-15)的质粒免疫，免疫方法同前，免疫2次，间隔一周，第二次免疫7天后，用7×10⁴的HPV16E6E7阳性的肿瘤细胞系TC-1皮下接种攻击，通过视诊和触诊观察记录肿瘤生长状况，每周观察2次。结果如附图7所示，mE7/HSP70单独及协同IL-15免疫组于接种后45天时100％小鼠均未成瘤，空载及IL-15组则于2周内全部成瘤。实验结果表明mE7/HSP70DNA疫苗单独免疫及与IL-15佐剂基因协同免疫均可诱发机体产生免疫预防保护反应，对随后接种的肿瘤细胞进行有效的免疫排斥，完全阻止移殖瘤的形成。

实施例9.肿瘤细胞接种后再进行mE7/HSP70DNA疫苗及与IL-15基因佐剂协同免疫的抗移殖瘤免疫活性分析

5-6周龄的雌性C57BL/6小鼠，随机分为4组，每组小鼠4-7只不等，具体数目参见图9，分别用于VR1012(Control)，VR1012-IL-2sig/IL-15，VR1012-mE7/HSP70(mE7/HSP70)和VR1012-mE7/HSP70+VR1012-IL-2sig/IL-15(mE7/HSP70+IL-15)的质粒免疫，皮下接种7×104的TC-1肿瘤细胞，模拟机体的荷瘤状态，三天后开始免疫，免疫方法同前，免疫2次，间隔一周，观察记录肿瘤生长情况。实验结果如附图8及附图9所示，免疫各组于接种后的9天开始成瘤，45天时空载及IL-15免疫组小鼠全部成瘤，瘤体积渐增，平均体积分别为2070和2191mm²；E7/HSP70组部分鼠全程无瘤，部分成瘤后又完全消退，部分瘤体积缓慢增大，45天仅50％的小鼠移殖瘤阳性，平均瘤体积仅为376mm²；协同IL-15组部分鼠成瘤后又完全消退，部分鼠全程无瘤，45天时成瘤小鼠的肿瘤完全消退，小鼠无瘤率高达100％。结果表明单独mE7/HSP70DNA疫苗免疫对肿瘤生长的具有明显抑制作用，协同IL-15基因佐剂联合免疫可进一步提高mE7/HSP70DNA疫苗的抗瘤活性，其诱发的免疫排斥反应可完全清除体内预先接种的肿瘤细胞，而且该保护作用是持久的。

                                      序列表

<110>中国医学科学院基础医学研究所

<120>人乳头瘤病毒16型DNA疫苗和基因佐剂及其应用

<130>

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>474

<212>DNA

<213>人乳头瘤病毒16型(HPV16)

<400>1

atggatctgc ttatgggaac tctgggcatc gtctgtccaa tcgccgctta catgcatggg     60

gacactccaa ccctgcacga atacatgctg gatctgcagc ccgagaccac cggcctctac    120

ggttacgggc agctgaacga tagcagcgaa gaggaagacg aaattgacgg ccccgccggc    180

caggcagagc cagatagggc ccactacaac atcgtgacat tttgctgcaa gtctgaggaa    240

gaggacgaga tcgacggtcc cgccggtcag gcagagcctg atagagccca ttacaatatc    300

gtgacattct gttgtaaagg ggattccact ctgcggttgt gcgtgcagtc cacccacgtc    360

gacattagaa ccctggaaga cctcctcatg gggaccttgg gcatcgtgtg ccctatcgga    420

agccagaagc ctgctgccta ctacatgctc gatctgcagc ccgagactac ctaa          474

<210>2

<211>156

<212>PRT

<213>人乳头瘤病毒16型(HPV16)

<400>2

Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Ala Ala Tyr

1               5                   10                  15

Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln

            20                  25                  30

Pro Glu Thr Thr Gly Leu Tyr Gly Tyr Gly Gln Leu Asn Asp Ser Ser

        35                  40                  45

Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp

    50                  55                  60

Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Ser Glu Glu Glu

65                  70                  75                  80

Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His

                85                  90                  95

Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Gly Asp Ser Thr Leu Arg Leu

            100                 105                 110

Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu

        115                 120                 125

Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Gly Ser Gln Lys Pro Ala

    130                 135                 140

Ala Tyr Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr

145                 150                 155

<210>3

<211>2358

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

atggatctgc tcatgggcac cctgggcatc gtgtgcccaa tcgccgctta catgcatggg     60

gacactccaa ccctgcacga atacatgctg gatctgcagc ccgagaccac cggcctctac    120

ggttacgggc agctgaacga tagcagcgaa gaggaagacg aaattgacgg ccccgccggc    180

caggcagagc cagatagggc ccactacaac atcgtgacat tttgctgcaa gtctgaggaa    240

gaggacgaga tcgacggtcc cgccggtcag gcagagcctg atagagccca ttacaatatc    300

gtgacattct gttgtaaagg ggattccact ctgcggttgt gcgtgcagtc cacccacgtc    360

gacattagaa ccctggaaga cctcctcatg gggaccttgg gcatcgtgtg ccctatcgga    420

agccagaagc ctgctgccta ctacatgctc gatctgcagc ccgagactac cgctctagac     480

atggctcgtg cggtcgggat cgacctcggg accaccaact ccgtcgtctc ggttctggaa     540

ggtggcgacc cggtcgtcgt cgccaactcc gagggctcca ggaccacccc gtcaattgtc     600

gcgttcgccc gcaacggtga ggtgctggtc ggccagcccg ccaagaacca ggcagtgacc     660

aacgtcgatc gcaccgtgcg ctcggtcaag cgacacatgg gcagcgactg gtccatagag     720

attgacggca agaaataeac cgcgccggag atcagcgccc gcattctgat gaagctgaag     780

cgcgacgccg aggcctacct cggtgaggac attaccgacg cggttatcac gacgcccgcc     840

tacttcaatg acgcccagcg tcaggccacc aaggacgccg gccagatcgc cggcctcaac     900

gtgctgcgga tcgtcaacga gccgaccgcg gccgcgctgg cctacggcct cgacaagggc     960

gagaaggagc agcgaatcct ggtcttcgac ttgggtggtg gcactttcga cgtttccctg    1020

ctggagatcg gcgagggtgt ggttgaggtc cgtgccactt cgggtgacaa ccacctcggc    1080

ggcgacgact gggaccagcg ggtcgtcgat tggctggtgg acaagttcaa gggcaccagc    1140

ggcatcgatc tgaccaagga caagatggcg atgcagcggc tgcgggaagc cgccgagaag    1200

gcaaagatcg agctgagttc gagtcagtcc acctcgatca acctgcccta catcaccgtc    1260

gacgccgaca agaacccgtt gttcttagac gagcagctga cccgcgcgga gttccaacgg    1320

atcactcagg acctgctgga ccgcactcgc aagccgttcc agtcggtgat cgctgacacc    1380

ggcatttcgg tgtcggagat cgatcacgtt gtgctcgtgg gtggttcgac ccggatgccc    1440

gcggtgaccg atctggtcaa ggaactcacc ggcggcaagg aacccaacaa gggcgtcaac    1500

cccgatgagg ttgtcgcggt gggagccgct ctgcaggccg gcgtcctcaa gggcgaggtg    1560

aaagacgttc tgctgcttga tgttaccccg ctgagcctgg gtatcgagac caagggcggg    1620

gtgatgacca ggctcatcga gcgcaacacc acgatcccca ccaagcggtc ggagactttc    1680

accaccgccg acgacaacca accgtcggtg cagatccagg tctatcaggg ggagcgtgag    1740

atcgccgcgc acaacaagtt gctcgggtcc ttcgagctga ccggcatccc gccggcgccg    1800

cgggggattc cgcagatcga ggtcactttc gacatcgacg ccaacggcat tgtgcacgtc    1860

accgccaagg acaagggcac cggcaaggag aacacgatcc gaatccagga aggctcgggc    1920

ctgtccaagg aagacattga ccgcatgatc aaggacgccg aagcgcacgc cgaggaggat    1980

cgcaagcgtc gcgaggaggc cgatgttcgt aatcaagccg agacattggt ctaccagacg    2040

gagaagttcg tcaaagaaca gcgtgaggcc gagggtggtt cgaaggtacc tgaagacacg    2100

ctgaacaagg ttgatgccgc ggtggcggaa gcgaaggcgg cacttggcgg atcggatatt    2160

tcggccatca agtcggcgat ggagaagctg ggccaggagt cgcaggctct ggggcaagcg    2220

atctacgaag cagctcaggc tgcgtcacag gccactggcg ctgcccaccc cggcggcgag    2280

ccgggcggtg cccaccccgg ctcggctgat gacgttgtgg acgcggaggt ggtcgacgac    2340

ggccgggagg ccaagtga                                                  2358

<210>4

<211>414

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt     60

gcaggcgcca actgggtgaa tgtaataagt gatttgaaaa aaattgaaga tcttattcaa    120

tctatgcata ttgatgctac tttatatacg gaaagtgatg ttcaccccag ttgcaaagta    180

acagcaatga agtgctttct cttggagtta caagttattt cacttgagtc cggagatgca    240

agtattcatg atacagtaga aaatctgatc atcctagcaa acaacagttt gtcttctaat    300

gggaatgtaa cagaatctgg atgcaaagaa tgtgaggaac tggaggaaaa aaatattaaa    360

gaatttttgc agagttttgt acatatcgtc caaatgttca tcaacacttc ttga          414