原小檗碱(protoberberine)类生物碱在制备抗耐药菌药物中的用途

具体实施方式

用于本发明的原小檗碱(protoberberine)类生物碱可以按现有文献记载的生物碱提取分离方法制备。如下面表1所示的化合物1至6可以从岩黄连中制得。但是，这些实施仅以例示方式提供，而不起限定作用。

表1.原小檗碱(protoberberine)类生物碱1至6的化学结构

表2.MRSA菌株对抗生素的药敏试验结果

表3.岩黄连单体化合物1-6抑制MSSA和MRSA的MIC(mg/ml)

实施例1：从岩黄连全草中提取分离单体生物碱1至6

取岩黄连(Corydal is saxicola Bunt.)干燥全草粗粉1kg于室温下用0-5％硫酸5L浸渍48小时后过滤，滤液加氯化钠至浓度为10％，再用饱和氢氧化钠调至PH10，氯仿萃取，回收氯仿得总碱浸膏。将此浸膏用丙酮搅拌，静置、过滤，回收丙酮得丙酮可溶物14g和不溶物20g。取丙酮可溶物进行低压硅胶柱层析，用石油醚∶乙酸乙酯＝15∶1～3∶1梯度洗脱得化合物3(0.08g)、4(0.2g)和5(0.4g)；丙酮不溶物进行低压硅胶柱层析，用石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇梯度洗脱＝6∶1∶0.1～5∶1∶1得化合物1(0.1g)、2(1.53g)、6(0.08g)和小檗碱(0.01g)。

实施例2：单体化合物1至6的理化和波谱数据

黄连碱(Coptisine)(1)

黄色棱状晶体，C₁₉H₁₄NO₄⁺，mp 217-218℃。ESI MS(positive ion mode)m/z：320。¹H NMR(DMSO-d₆，400MHz)：δ_H 9.84(1H，s，H-8)，8.90(1H，s，H-13)，7.98(1H，d,J＝8.4Hz，H-11)，7.81(1H，d，J＝8.6Hz，H-12)，7.74(1H，s，H-1)，7.00(1H，s，H-4)，6.52(2H，s，OC^O-9，10)，6.11(2H，s，OCH₂O-2，3)，4.79(2H，dd，J＝6.3，5.9Hz，H-6)，3.19(2H，dd，J＝6.3，6.0Hz，H-5)；¹³C NMR(DMSO-d₆，100MHz)：δ_C105.1(d，C-1)，147.2(s，C-2)，149.6(s，C-3)，108.0(d，C-4)，130.4(s，C-4a)，26.1(t，C-5)，55.0(t，C-6)，143.9(d，C-8)，120.2(s，C-8a)，143.5(s，C-9)，147.4(s，C-10)，120.7(d，C-11)，120.8(d，C-12)，132.4(s，C-12a)，121.5(d，C-13)，136.7(s，C-13a)，111.4(s，C-13b)，101.8(t，OCH₂O-2，3)，104.2(t，OCH₂O-9，10)。

脱氢阿朴卡维丁(Dehydroapocavidine)(2)

黄色无定形固体，C₂₀H₁₈N0₄⁺。ESI MS(positive ion mode)m/z：336；¹H NMR(DMSO-d₆，400MHz)：δ_H 9.90(1H，s，H-8)，8.02(1H，d，J＝9.0Hz，H-12)，7.95(1H，d，J＝9.0Hz，H-11)，7.31(1H，s，H-1)，6.89(1H，s，H-4)，6.53(2H，s，OCH₂O-9，10)，4.76(2H，m，H-6)，3.84(3H，s，OCH₃-13)，3.06(2H，m，H-5)，2.92(3H，s，CH₃)；¹³CNMR(DMSO-d₆，100MHz)：δ_C 114.4(d，C-1)，146.3(s，C-2)，149.0(s，C-3)，115.5(d，C-4)，130.1(s，C-4a)，26.5(t，C-5)，56.7(t，C-6)，142.9(d，C-8)，117.8(s，C-8a)，144.4(s，C-9)，146.8(s，C-10)，119.3(d，C-11)，120.1(d，C-12)，131.7(s，C-12a)；132.5(s，C-13)，136.2(s，C-13a)，110.8(s，C-13b)，56.5(q，OCH₃-3)，104.6(t，OCH₂O-9，10)，18.2(q，CH₃-13)。

刺罂粟碱(Stylopine)(3)

黄色晶体，Mp 203-204℃，[α]_D²³+305°(c，0.6，CHCl₃)，C₁₉H₁₇NO₄，ESI MS(positive ion mode)m/z：：324；¹H NMR(C₅D₅N，400MHz)：δ_H 6.94(1H，s，H-1)，6.82(1H，d，J＝7.9Hz，H-12)，6.70(1H，d，J＝7.9Hz，H-11)，6.63(1H，s，H-4)，5.97(2H，d，J＝5.4Hz，OCH₂O-2，3)，5.95(2H，d，J＝5.4Hz，OCH₂O-9，10)，4.11(1H，d，J＝15.3 Hz，H-8a)，3.43(1H，br.s，H-13a)，3.38(1H，d，J＝15.3Hz，H-8P)，3.07(1H，in，H-13a)，2.72(1H，m，H-13β)，2.46-3.08(4H，m，H-5，H-6)；¹³C NMR(C₅D₅N，100MHz)δ_C：107.0(d，C-1)，143.8(s，C-2)，146.5(s，C-3)，117.5(d，C-4)，128.3(s，C-4a)，29.9(t，C-5)，51.4(t，C-6)，53.3(t，C-8)，117.7(s，C-8a)，146.8(s，C-9)，145.5(s，C-10)，107.0(d，C-11)，121.5(d，C-12)，129.2(s，C-12a)，36.9(t，C-13)，60.0(d，C-13a)，131.5(s，C-13b)，101.2(t，OCH₂O-2，3)，101.6(t，OCH₂O-9，10)。

阿朴卡维丁Apocavidine(4)

黄色晶体，C₂₀H₂₃NO₄，mp 175℃。ESI MS(positive ion mode)m/z：：341；¹HNMR(C₅D₅N，400MHz)：δ_H 6.92(1H，s，H-4)，6.86(1H，d，J＝7.9Hz，H-11)，6.78(1H，d，J＝7.9Hz，H-12)，6.76(1H，s，H-1)，5.97(2H，d，J＝17.8Hz，OCH₂O-9，10)，4.18(1H，d，J＝15.3Hz，H-8α)，3.77(3H，s，OCH₃)，3.68(1H，d，J＝4.1Hz，H-13a)，3.49(1H，d，J＝15.3Hz，H-8β)，3.03(1H，dd，J＝4.0，6.8Hz，H-13)，2，37-3.35(4H，m，H-5，6)，1.09(3H，d，J＝6.8Hz，CH₃-13)；¹³C NMR(C₅D₅N，100MHz)δ_C：110.0(d，C-1)，147.5(s，C-2)，145.2(s，C-3)，112.4(d，C-4)，128.3(s，C-4a)，29.2(t，C-5)，51.4(t，C-6)，53.8(t，C-8)，117.1(s，C-8a)，146.0(s，C-9)，143.3(s，C-10)，112.5(d，C-11)，123.5(d，C-12)，136.2(s，C-12a)，39.0(d，C-13)，63.7(d，C-13a)，129.4(s，C-13b)，102.2(t，OCH₂O-9，10)，56.2(q，OCH₃)，18.8(q，CH₃-13)。

脱氢卡维丁Dehydrocavidine(5)

黄色无定形固体，C₂₀H₁₈N0₄⁺，mp 273-274℃。ESI MS(positive ion mode)m/z：350；¹H NMR(DMSO-d₆，400MHz)：δ_H 9.87(1H，s，H-8)，8.02(1H，d，J＝9.0Hz，H-12)，7.80(1H，d，J＝9.0Hz，H-11)，7.11(1H，s，H-1)，6.89(1H，s，H-4)，6.39(2H，s，OCH₂O-9，10)，4.64(2H，m，H-6)，3.72(3H，s，OCH₃-13)，3.06(2H，m，H-5)，2.82(3H，s，CH₃)；¹³C NMR(DMSO-d₆，100MHz)：δ_C114.4(d，C-1)，146.3(s，C-2)，149.0(s，C-3)，115.5(d，C-4)，130.1(s，C-4a)，26.5(t，C-5)，56.7(t，C-6)，143.0(d，C-8)，117.8(s，C-8a)，144.4(s，C-9)，146.8(s，C-10)，120.4(d，C-11)，120.1(d，C-12)，131.7(s，C-12a)；132.5(s，C-13)，136.2(s，C-13a)，110.8(s，C-13b)，55.8(q，OCH₃-3)，102.9(t，OCH₂O-9，10)，18.0(q，CH₃-13)。

Thalifaurine(6)

黄色晶体，C₁₉H₁₆NO₄⁺，mp 257-259℃。ESI MS(positive ion mode)m/z：322；¹HNMR(DMSO-d₆，400MHz)：δ_H 9.64(1H，s，H-8)，8.82(1H，s，H-13)，7.81(1H，d，J＝8.6Hz，H-12)，7.74(1H，s，H-1)，7.00(1H，s，H-4)，6.71(1H，s，H-9)，6.70(1H，s，H-12)，6.42(2H，s，OCH₂O-10，11)，4.78(2H，dd，J＝6.2，6.0 Hz，H-6)，3.19(2H，dd，J＝6.3，6.0Hz，H-5)；¹³C NMR(DMSO-d₆，100MHz)：δ_C 112.6(d，C-1)，148.1(s，C-2)，145.6(s，C-3)，114.3(d，C-4)，127.7(s，C-4a)，28.9(t，C-5)，56.5(t，C-6)，144.5(d，C-8)，118.2(s，C-8a)，113.7(s，C-9)，147.9(s，C-10)，148.5(d，C-11)，113.4(d，C-12)，140.9(s，C-12a)，131.3(d，C-13)，146.2(s，C-13a)，121.7(s，C-13b)，56.3(q，OCH₃)，101.5(t，OCH₂O-10，11)。

实施例3：用作药敏试验的临床耐药菌株MRSA的筛选

1.试验材料

抗菌素药敏纸片(中国药品生物制品检定所)，MH琼脂(杭州天和微生物试剂有限公司)。

2.标本来源

从我院临床标本中分离筛选4株细菌标本，编号为MRSA321、MRSA40、MRSA45、MRSA55，冰箱-20℃下保存备用。

3.细菌鉴别

依据《全国临床检验操作规程》及本领域技术人员公知的细菌鉴别方法对上述标本细菌进行分离、培养，经鉴定为金黄色葡萄球菌(SA)，并按公知的抗菌素药敏常规测试方法(K-B纸片法)，参照美国临床试验室标准委员会(NCCLS)2004年标准进行耐药菌鉴定，头孢西丁对该标本的抑菌圈均≤19mm，故视为耐药SA菌株(MRSA)。

4.药敏试验

进一步用K-B纸片法，按照我国卫生部于2000年5月1日颁布实施的《纸片法抗菌药物敏感试验标准》(SAST)常规操作，用MH琼脂培养基于35℃培养17小时，测定4株MRSA对常用抗菌素的敏感性，结果见表2。

实施例4：化合物1至6对耐药菌株MRSA的抗菌活性测定

1.试验材料

培养基：MH肉汤(杭州天和微生物试剂有限公司)；受试药：化合物1至6样品(由岩黄连中提取分离得到)，溶剂：DMSO(分析纯)，蒸馏水；标准金黄色葡萄球菌(MSSA)：ATCC25923(中国药品生物制品检定所)，耐药菌(MRSA)：MRSA321、MRSA40、MRSA45、MRSA55；对照药：小檗碱、氨苄西林和万古霉素。

2.药液制备

用电子分析天平称取各受试药品5mg，以无菌DMSO配成5mg/ml溶液作为原药溶液。

3.菌液的制备

用接种环把菌株接种在MH琼脂平板上，置于35℃恒温箱中培养24h，再用接种环把菌株转移至试管中，用无菌生理盐水配成10⁶cfu/ml作测定MIC用。

4.测定药物抑制MRSA的最小抑菌浓度(MIC)

采用公知的二倍稀释法，取10支无菌试管编号并置于试管架上，在每支试管中加入1ml MH肉汤培养基，取原药液1ml与第一支试管摇匀，继而吸取1ml加入第二支试管中，依次类推稀释至第十管，弃去1ml，除第十管不加菌液外，其余都加0.1ml稀释为10⁶CFU/ml菌液摇匀，置培养箱中于35℃培养24小时，按本领域技术人员公知方法进行受试药物活性评价，所得测定结果见表3。