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2014-10-22
专利权的转移 IPC(主分类):A61K36/481 变更前: 变更后: 登记生效日:20140919 申请日:20060821
专利申请权、专利权的转移
2012-04-25
授权
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2012-03-14
专利申请权的转移 IPC(主分类):A61K36/481 变更前: 变更后: 登记生效日:20120120 申请日:20060821
专利申请权、专利权的转移
2010-09-22
专利申请权的转移 IPC(主分类):A61K36/481 变更前: 变更后: 登记生效日:20100816 申请日:20060821
专利申请权、专利权的转移
2009-10-28
实质审查的生效
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2008-02-27
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技术领域
本发明属医药技术领域,具体地说,本发明涉及一种防治更年期综合症和/或骨质疏松症的药用组合物、提取物及其制备方法。
背景技术
更年期综合征是一种发病率高、危害性大的常见病。在我国更年期人口中,更年期精神神经症状发生率高达75.1%,在绝经前已达高峰,持续7年左右;血管舒缩功能失调发生率为40.9%,高峰年龄50岁以后,持续6年左右。目前研究的资料表明,99%的妇女在更年期及更年期后可出现骨质疏松症,也称为原发性骨质疏松症。该症是一种以骨量减少、骨组织微细结构退化为特征的,致使骨的脆性增加以及易于发生骨折的全身性的骨骼疾病。随着世界人口趋于老龄化,骨质疏松症及骨质疏松性骨折的发病人口呈迅速上升的趋势。根据我国2000年人口普查的结果,预测我国患原发性骨质疏松症的人数约为0.88亿,约占全国总人口的6.97%,预计到2010年将达到1.14亿,占总人口的百分数8.2%。雌激素替代疗法(Hormone Replacement Therapy,HRT)是目前治疗更年期综合症及骨质疏松的主要手段,疗效较好,但临床结果表明,患者长期应用雌激素替代疗法后会引起严重的副作用,包括子宫出血,刺激乳腺细胞、子宫内膜增生,增加乳腺癌、子宫内膜癌发病率等严重不良反应。防治更年期综合症及骨质疏松已成为当代医药学研究的重点和热门领域之一。
发明内容
中医理论认为,更年期症状主要是由于肾气渐衰,冲任二脉虚惫,导致阴阳失调,气血两虚而引起,表现为头昏耳鸣、心悸失眠、烦躁易怒或抑郁焦虑,潮热汗出等症状。本发明用于防治更年期综合症和/或骨质疏松症,由传统复方当归补血汤加味而成。当归补血汤是中医临床常用的补益气血的方剂,由金元四大家之一李东垣创立,首载于其医学名著《内外伤辩惑论》(公元1247年),其功能是补气生血,广泛用于气血两虚之低热、面赤、面色萎黄、神疲乏力等症。李东垣道:“该方可为益气生血之剂,称之有形之血,生于无形之气”。现代临床及药理研究表明,当归补血汤对心、肝等机体损伤有保护作用,能增强肌体免疫功能、抗贫血、改善血液流变学、提高机体应激水平等,用于免疫性全血细胞减少症、再生障碍性贫血、过敏性紫癜、血管神经性头痛、血虚便秘等,但迄今未见单用该方预防和治疗更年期综合症和/或骨质疏松症的研究报道和临床应用实例。本发明的发明人发现,在传统组合物当归补血汤的基础上,选用中药淫羊藿与当归补血汤组方,在预防和治疗更年期综合症和/或骨质疏松症方面效果优异,可以有效促进MG-63骨细胞的增殖、分化,增加受雌激素影响的基因在MCF-7细胞的表达水平,且不刺激乳癌细胞的增殖。此外,中药淫羊藿与当归补血汤组方,经过优化提取、浓缩、精制后,相比传统组合物,预防和治疗更年期综合症作用显著增强,作用机制明确,且具有剂型先进,给药剂量小,患者适应性好等特点。
本发明的目的是利用我国传统中医药理论和中药材,研制开发一种疗效确切,副作用小,适合更年期妇女预防和治疗更年期综合症和/或骨质疏松症的药用组合物及其提取物。
一、药材成分与配比(重量)
本发明涉及一种预防和治疗更年期综合症和/或骨质疏松症的药用组合物,其特征在于制成该组合物所含药效成分的原料由当归、黄芪和淫羊藿组成,其重量比为:当归1~50份,黄芪1~100份,淫羊藿0.1~100份。
其中所用当归为伞形科植物当归(Angelica sinensis(Oliv.)Diels)的干燥根。黄芪为豆科植物蒙古黄芪(Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao)或膜荚黄芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.)的干燥根。淫羊藿为小檗科(Berberidaceae)植物淫羊藿(Epimedium brevicornum Maxim.)、箭叶淫羊藿(Epimedium segittatum(Sitb.et Zucc.)Maxim.)、柔毛淫羊藿(Epimedium pubescens Maxim.)、巫山淫羊藿(Epimediumwushanense Maxim.)或朝鲜淫羊藿(Epimedium korearum Nakai)的干燥地上部分。有关伞形科、豆科、小檗科的科学定义和范畴,参见《中国高等植物科属词典》(修订版)(侯宽昭编,北京:科学出版社,1984.12)。按照中医传统用药习惯,这些材料还包括经过酒制、蜜制等炮制方法制成的各种炮制品。
除当归、黄芪、淫羊藿外,本发明的药用组合物还可以包含选自生地黄、葛根、赤芍和骨碎补等不影响疗效的其他成分。优选地,本发明的药用组合物由当归、黄芪、淫羊藿组成。
优选地,本发明的药用组合物中当归、黄芪和淫羊藿的重量比为:当归1~20份,黄芪20~100份,淫羊藿1~100份。
进一步优选地,本发明的药用组合物中所述原料的重量比为:当归10份,黄芪50份,淫羊藿50份。
本发明还涉及上述药用组合物的提取物的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)取当归、黄芪、淫羊藿粉碎成粉末;
(2)称取当归、黄芪,以4~12倍水或任意比例乙醇水溶液提取1~3次,每次0.5~2小时,合并提取液,浓缩得浸膏I;
(3)称取淫羊藿,以4~12倍50~95%乙醇水溶液提取1~3次,每次0.5~2小时,合并提取液,浓缩得浸膏II;
(4)取浸膏I、II,合并,混匀,干燥,得到所述药用组合物的提取物。
本发明也涉及药用组合物的提取物的另一种制备方法,其特征在于步骤如下:
(1)取当归、黄芪、淫羊藿粉碎成粉末;
(2)称取当归、黄芪,淫羊藿,混合均匀,以4~12倍水或任意比例乙醇水溶液提取1~3次,每次0.5~2小时,合并提取液,浓缩得到浸膏;
(3)取浸膏混匀,干燥,得到所述药用组合物的提取物。
本发明还涉及药用组合物在制备一种药物中的应用,所述药物可以有效促进MG-63人成骨细胞的增殖、分化,增加受雌激素影响的基因在MCF-7细胞的表达水平,且不刺激乳癌细胞的增殖。
本发明还涉及用本发明的方法制备的提取物在制备一种药物中的应用,所述药物可以有效促进MG-63人成骨细胞的增殖、分化,增加受雌激素影响的基因在MCF-7细胞的表达水平,且不刺激乳癌细胞的增殖。
本发明还涉及药用组合物在制备用于预防和治疗更年期综合症和/或骨质疏松药物中的应用。
本发明还涉及用本发明的方法制备的提取物在制备用于预防和治疗更年期综合症和/或骨质疏松药物中的应用。优选地,所述药物为胶囊、片剂或软胶囊剂型。
本发明还涉及一种预防和治疗更年期综合症的药用组合物,其特征在于:该药用组合物由当归、黄芪和淫羊藿提取物组成,其重量比为:当归多糖:1~20%;黄芪多糖:20~60%;黄芪乙醇提取物:1~20%;淫羊藿提取物:20~80%。优选地,各组分的重量配比为:当归多糖:8%;黄芪多糖:46%;黄芪乙醇提取物:6%;淫羊藿提取物:40%。
本发明还涉及一种药用组合物的制备方法,其包括混合当归多糖、黄芪多糖、黄芪乙醇提取物和淫羊藿提取物。优选地,其中当归多糖、黄芪多糖、黄芪乙醇提取物和淫羊藿提取物的重量比为:当归多糖:1~20%;黄芪多糖:20~60%;黄芪乙醇提取物:1~20%;淫羊藿提取物:20~80%。进一步优选地,其中当归多糖、黄芪多糖、黄芪乙醇提取物和淫羊藿提取物的重量比为8%∶46%∶6%∶40%。
在上述制备方法中,当归多糖的制备方法为:取当归粉碎成粉末,以水提取,减压浓缩,将浓缩液加入乙醇,收集所得沉淀,干燥后得到当归多糖;黄芪多糖和黄芪乙醇提取物的制备方法为:取黄芪粉碎成粉末,以水提取,减压浓缩,将浓缩液加入乙醇,收集所得沉淀,干燥后得到黄芪多糖;剩余醇液挥干乙醇后以水重新溶解,过大孔树脂柱,水洗,再用乙醇洗脱,收集醇洗脱液,浓缩干燥后得到黄芪乙醇提取物;淫羊藿提取物的制备方法为:取淫羊藿粉粹成粉末,以乙醇水溶液提取,,浓缩干燥后得淫羊藿提取物。
本发明还涉及一种组合物,它包含淫羊藿提取物与当归多糖、黄芪多糖、黄芪乙醇提取物,用于预防和治疗更年期综合症,有效增加受雌激素影响的基因在MCF-7细胞的表达水平、或者提高免疫水平。
本发明进一步涉及所述药用组合物在制备用于预防和治疗更年期综合症药物中的应用。优选地,所述药物为胶囊、片剂或其他剂型。
二、制备方法
1.组合物提取物的制备:按照上述材料和配伍比例组成的当归补血汤及衍生方用于预防和治疗更年期综合症和/或骨质疏松症的目的时,可以直接用水煎法或酒浸法制成汤剂或酒剂直接服用,也可以先用水或用含量为1%~100%的醇类(甲醇、乙醇等)、酮类(丙酮等)或酯类(乙酸乙酯等)提取后,或以超临界CO2流体萃取法提取后,再混入水或酒提物中,将其制成浸膏、膏滋、颗粒剂或胶囊等制剂后服用。其中最优选的提取方法是水提取。具体方法如下:
(1)取当归、黄芪、淫羊藿粉碎成粉末;
(2)称取当归、黄芪,以4~12倍水或任意比例乙醇水溶液提取1~3次,每次0.5~2小时,合并提取液,浓缩得浸膏I;
(3)称取淫羊藿,以4~12倍30~95%乙醇水溶液提取1~3次,每次0.5~2小时,合并提取液,浓缩得浸膏II;
(4)取浸膏I、II,合并,混匀,干燥,得本发明提取物。或
(1)取当归、黄芪、淫羊藿粉碎成粉末;
(2)称取当归、黄芪、淫羊藿粉末,混合均匀,以4~12倍水或任意比例乙醇水溶液提取1~3次,每次0.5~2小时,合并提取液,浓缩得浸膏;
(3)取浸膏混匀,干燥,得本发明提取物。
2.当归多糖的制备
取当归药材粉碎成粉末,以4~12倍水提取1~3次,每次0.5~2小时,合并提取液,减压浓缩。将浓缩液加入2~6倍50~95%乙醇,收集所得沉淀,干燥后得到当归多糖。
优选地,取当归药材1kg粉碎成粉末,以8倍水提取2次,每次1小时,合并提取液,减压浓缩,将浓缩液加入4倍95%乙醇,收集所得沉淀,干燥后得到当归多糖。
3.当归乙醇提取物
取当归药材粉碎成粉末,以95%乙醇浸泡过夜,使其充分溶胀,再以95%乙醇渗漉至洗脱液无明显颜色(约3~6倍保留体积),渗漉液减压浓缩后得当归乙醇提取物。
4.黄芪多糖黄芪乙醇提取物的制备
取黄芪药材粉碎成粉末,以4~12倍水或提取1~3次,每次0.5~2小时,合并提取液,减压浓缩。将浓缩液加入2~6倍50~95%乙醇,收集所得沉淀,干燥后得到黄芪多糖,产率大约9.2%。剩余醇液挥干乙醇后以水重新溶解,过大孔树脂柱。水洗约2~4倍柱体积,再用50%~95%乙醇洗脱2~4倍柱体积,收集醇洗脱液,浓缩干燥后得到黄芪乙醇提取物。
优选地,取黄芪药材1kg粉碎成粉末,以8倍水或提取2次,每次1小时,合并提取液,减压浓缩,将浓缩液加入4倍95%乙醇,收集所得沉淀,干燥后得到黄芪多糖;剩余醇液挥干乙醇后以水重新溶解,过大孔树脂柱,水洗约3倍柱体积,再用70%乙醇洗脱3倍柱体积,收集醇洗脱液,浓缩干燥后得到黄芪乙醇提取物。
5.淫羊藿提取物的制备
取淫羊藿药材粉粹成粉末,以4~12倍30~95%乙醇水溶液提取1~3次,每次0.5~2小时,合并提取液,浓缩干燥后得淫羊藿提取物。
优选地,取淫羊藿药材1kg粉粹成粉末,以8倍70%乙醇水溶液提取2次,每次1小时,合并提取液,浓缩干燥后得淫羊藿提取物。
为得到优化后的提取物配比,根据更年期综合症特点,选择雌激素样作用和免疫活性两个药理指标,采用如下药效学实验进行筛选和活性检测,包括测量MCF-7细胞ERE-Luc活性,测量T细胞增殖与巨噬细胞免疫活性等。
附图说明
图1显示黄芪和当归的组合物对MCF-7细胞生长的影响。
图2显示当归、黄芪和淫羊藿的组合物对MCF-7细胞生长的影响。
图3显示黄芪和当归的组合物对MG-63细胞生长的影响。
图4显示当归、黄芪和淫羊藿的组合物对MG-63细胞生长的影响。
图5显示当归多糖、黄芪多糖、黄芪乙醇提取物和淫羊藿提取物的正交试验结果。
图6显示加入不同量淫羊藿后对9号组合物的雌激素样作用的结果。
图7显示含有当归多糖、黄芪多糖、黄芪乙醇提取物和淫羊藿提取物的组合物的T淋巴细胞增殖试验的结果。
图8显示含有当归多糖、黄芪多糖、黄芪乙醇提取物和淫羊藿提取物的组合物的巨噬细胞吞噬活性试验结果。
具体实施方式
现结合实施例,对本发明作详细的描述:
实施例1:组合物提取物的制备
【处方】当归200g 黄芪1000g 淫羊藿1000g
【制法】以上3味,粉碎为粗粉。取当归、黄芪两味,置于20L提取器中,加水16kg,充分搅拌浸泡,加热提取1小时,趁热过滤,残渣再用8kg水加热提取1小时,趁热过滤,合并滤液。滤液浓缩至1.05~1.1比重的稠浸膏,得浸膏I。再取淫羊藿粗粉1000g,置于10L提取器中,加入70%乙醇8L,充分浸泡后加热回流提取1小时,趁热过滤,残渣再用6L70%乙醇加热提取1小时,趁热过滤,合并滤液。滤液60℃减压回收浓缩至1.05~1.1比重的稠浸膏,得浸膏II。取浸膏I、II,合并,充分混匀后干燥,得本发明提取物1。
实施例2:组合物提取物的制备
【处方】当归200g 黄芪1000g 淫羊藿1000g
【制法】以上3味,粉碎为粗粉。取当归、黄芪、淫羊藿三味药材,混合均匀,置于20L提取器中,加水17.6kg,充分搅拌均匀,加热提取1小时,趁热过滤,残渣再用11kg水回流加热提取1小时,趁热过滤,合并滤液。滤液浓缩为1.05~1.1比重的稠浸膏,取浸膏充分混匀后干燥,得本发明提取物2。
实施例3:组合物提取物的制备
【处方】当归200g 黄芪1000g 淫羊藿1000g
【制法】以上3味,粉碎为粗粉。取当归、黄芪、淫羊藿三味药材,混合均匀,置于20L提取器中,加70%乙醇17.6kg,充分搅拌均匀,加热回流提取1小时,趁热过滤,残渣再用11kg乙醇回流加热提取1小时,趁热过滤,合并滤液。滤液减压回收浓缩为1.05~1.1比重的稠浸膏,取浸膏充分混匀后干燥,得本发明提取物3。
实施例4:组合物提取物的制备
【处方】当归200g 黄芪1000g 淫羊藿1g
【制法】以上3味,粉碎为粗粉。取当归、黄芪、淫羊藿三味药材,混合均匀,置于10L提取器中,加水7.2kg,充分搅拌均匀,加热提取1小时,趁热过滤,残渣再用6kg水加热提取1小时,趁热过滤,合并滤液。滤液减压回收得稠浸膏,取浸膏充分混匀后干燥,得本发明提取物4。
实施例5:组合物提取物的制备
【处方】当归10g黄芪1000g 淫羊藿1000g
【制法】以上3味,粉碎为粗粉。取当归、黄芪、淫羊藿三味药材,混合均匀,置于20L提取器中,加70%乙醇15L,充分搅拌均匀,加热回流提取1小时,趁热过滤,残渣再用10L乙醇回流加热提取1小时,趁热过滤,合并滤液。滤液减压回收浓缩为稠浸膏,取浸膏充分混匀后干燥,得本发明提取物5。
实施例6:组合物提取物的制备
【处方】当归50g黄芪100g 淫羊藿1000g
【制法】以上3味,粉碎为粗粉。取当归、黄芪、淫羊藿三味药材,混合均匀,置于50L提取器中,加70%乙醇24L,充分搅拌均匀,加热回流提取1小时,趁热过滤,残渣再用15L乙醇回流加热提取1小时,趁热过滤,合并滤液。滤液减压回收浓缩为稠浸膏,取浸膏充分混匀后喷雾干燥,得本发明提取物6。
实施例7:组合物提取物的制备
【处方】当归100g 黄芪500g 淫羊藿500g
【制法】以上3味,粉碎为粗粉。分置于10L提取器中,分加70%乙醇1,5,5升,加热提取1小时,趁热过滤,残渣再用乙醇回流加热提取1小时,趁热过滤,合并滤液滤液浓缩。三种提取物混合后干燥,得本发明提取物7。
实施例8:组合物提取物的制备
【处方】当归100g 黄芪500g 淫羊藿提取物10g
【制法】以上3味,粉碎为粗粉。取当归、黄芪二味药材,混合均匀,置于50L提取器中,加70%乙醇24L,充分搅拌均匀,加热回流提取1小时,趁热过滤,残渣再用15L乙醇回流加热提取1小时,趁热过滤,合并滤液。滤液减压回收浓缩为稠浸膏,取浸膏充分混匀后喷雾干燥,得当归黄芪提取物。另取淫羊藿提取物,加入当归黄芪提取物,混匀,得本发明提取物8。
实施例9:组合物提取物的制备
【处方】当归100g 黄芪500g 淫羊藿苷1g
【制法】以上3味,粉碎为粗粉。取当归、黄芪二味药材,混合均匀,置于50L提取器中,加70%乙醇24L,充分搅拌均匀,加热回流提取1小时,趁热过滤,残渣再用15L乙醇回流加热提取1小时,趁热过滤,合并滤液。滤液减压回收浓缩为稠浸膏,取浸膏充分混匀后喷雾干燥,得当归黄芪提取物。另取淫羊藿苷,加入当归黄芪提取物,混匀,得本发明提取物9。
实施例10:组合物提取物的制备
【处方】当归100g 黄芪500g 淫羊藿500g赤芍100g
【制法】以上4味,粉碎为粗粉。取当归、黄芪、淫羊藿三味药材,混合均匀,置于20L提取器中,加70%乙醇17.6kg,充分搅拌均匀,加热回流提取1小时,趁热过滤,残渣再用11kg乙醇回流加热提取1小时,趁热过滤,合并滤液。滤液减压回收浓缩为1.05~1.1比重的稠浸膏,取浸膏充分混匀后干燥,得本发明提取物10。
实施例11:组合物提取物的制备
【处方】当归100g 黄芪500g 淫羊藿500g葛根500g
【制法】以上4味,粉碎为粗粉。取当归、黄芪、淫羊藿三味药材,混合均匀,置于20L提取器中,加70%乙醇17.6kg,充分搅拌均匀,加热回流提取1小时,趁热过滤,残渣再用11kg乙醇回流加热提取1小时,趁热过滤,合并滤液。滤液减压回收浓缩为1.05~1.1比重的稠浸膏,取浸膏充分混匀后干燥,得本发明提取物11。
实施例12:组合物提取物的制备
【处方】当归100g 黄芪500g 淫羊藿500g生地黄100g
【制法】以上4味,粉碎为粗粉。取当归、黄芪、淫羊藿四味药材,混合均匀,置于20L提取器中,加70%乙醇12kg,充分搅拌均匀,加热回流提取1小时,趁热过滤,残渣再用8kg乙醇回流加热提取1小时,趁热过滤,合并滤液。滤液减压回收浓缩为1.05~1.1比重的稠浸膏,取浸膏充分混匀后干燥,得本发明提取物13。
实施例13:组合物提取物的制备
【处方】当归100g 黄芪500g 淫羊藿500g葛根500g赤芍100g生地黄100g骨碎补100g
【制法】以上7味,粉碎为粗粉。取当归、黄芪、淫羊藿三味药材,混合均匀,置于20L提取器中,加70%乙醇17.6kg,充分搅拌均匀,加热回流提取1小时,趁热过滤,残渣再用11kg乙醇回流加热提取1小时,趁热过滤,合并滤液。滤液减压回收浓缩为1.05~1.1比重的稠浸膏,取浸膏充分混匀后干燥,得本发明提取物13。
实施例14:组合物胶囊的制备
【处方】实施例1-13中组合物提取物300g
【制法】上述组合物提取物加入淀粉等辅料,置于沸腾制粒机中混合、干燥、制粒,将所得颗粒装入1号硬明胶胶囊中,每粒0.3g,分装100粒,即得。其它项目应符合中华人民共和国药典2000年版胶囊剂项下的有关规定。
实施例15:组合物片剂的制备
【处方】实施例1-13中组合物提取物100g
【制法】上述组合物提取物加入淀粉等辅料,置于沸腾制粒机中混合、干燥、制粒,将所得颗粒压片,每片0.2g,分装500片,即得。其它项目应符合中华人民共和国药典2000年片剂项下的有关规定。
实施例16:组合物软胶囊的制备
【处方】实施例1-13中组合物提取物100g
【制法】上述组合物提取物粉未,加入植物油等辅料,混合、压成软胶囊,每片0.5g,共分装500粒,即得。其它项目应符合中华人民共和国药典2000年软胶囊项下的有关规定。
实施例17:药效学试验
本发明用于防治更年期综合症和/或骨质疏松,进行了如下药效学试验,包括测量MCF-7细胞增殖和ERE-Luc活性,测量MG-63细胞增殖与分化等。
一、组合物的雌激素样作用
1.细胞培养条件
MCF-7(含有ERE基因)细胞培养在MEM培养基,含10%胎牛血清、青霉素50U/ml、庆大霉素50μg/ml、0.1mM氨基酸和1.0mM丙酮酸钠,培养箱温度37℃,含5%CO2, 95%空气。实验之前3天改变为无酚红MEMα培养基,含2%活性炭/葡聚糖处理的胎牛血清。
2.对MCF-7细胞生长的影响
细胞种在96孔板(Falcon,BD Labware,NJ,USA),细胞密度约1x103细胞/孔,过夜让细胞贴壁,从第二天开始加药,每24小时加药一次,加药之前更换培养液。加药三次后取样,样品进行MTT测定。每孔加0.02mg MTT,37℃培养4小时,每孔加150μl DMSO溶解形成的呋喃结晶,在570nm用Opsys Microplate Reader(ThermoLabsystems,MA,USA)测定光密度。实验资料以三次实验的平均值,每次平行做三个孔。试验结果见图1、2。
3.对雌激素反应组件-荧光素酶(ERE-luciferase)活性的影响
细胞接种在24孔板(Falcon,BD Labware,NJ,USA),细胞密度约5x104细胞/孔,过夜让细胞贴壁,从第二天开始加药,每24小时加药一次,加药之前更换培养液。加药二次后取样,样品进行荧光素酶活性测定(Fluostar Optima,BMG Labtechnology)。实验资料以三次实验的平均值,每次平行做三个孔。试验结果见图1、2。
以上结果表明:古方当归补血汤的雌激素样活性在当归∶黄芪=1∶5时表现最佳,使ERE-Luc活性显着增加(图1)。在当归补血汤配伍淫羊藿后,其雌激素样作用进一步显着加强,当归∶黄芪∶淫羊藿=1∶5∶5时效果与对照药β-雌二醇接近;但与β-雌二醇显著增加乳癌细胞增殖明显不同,三味中药配伍所得组合物对乳癌细胞几乎没有促增殖作用(图2)。以当归∶黄芪∶淫羊藿=1∶5∶5配伍,表现出良好的雌激素样活性和极低的癌细胞增殖副作用。
二、组合物的抗骨质疏松作用
1.细胞培养条件
MG-63细胞培养在MEM培养基,含10%热失活牛血清、青霉素50U/ml、庆大霉素50μg/ml、0.1mM氨基酸和1.0mM丙酮酸钠,培养箱温度37℃,含5%CO2,95%空气。
2.对MG-63细胞生长的影响
试验方法同MCF-7细胞MTT试验,试验结果见图3、4。
3.MG-63细胞碱性磷酸酶(ALP)活性测定
细胞接种在24孔板(Falcon,BD Labware,NJ,USA),细胞密度约3x103细胞/孔,过夜让细胞贴壁,从第二天开始加药,加药之前更换培养液。每加药24小时后取样,所有样品用PBS洗二次,并保存在-80℃冰箱。每孔在室温加200μl细胞裂解缓冲液(0.1%Triton X-100in PBS),冰冻裂解,收集细胞裂解液,14,000rpm离心5min,上清液用来测定蛋白浓度以及进行碱性磷酸酶活性测定。每100μl样品加100μl磷酸对硝基苯酯(p-nitro-phenyl phosphate)底物溶液,37℃孵育30min,加100μl 2N NaOH终止反应。在405nm用OpsysMicroplate Reader(Thermo Labsystems,MA,USA)测定光密度。试验结果见图3、4:
以上结果表明:古方当归补血汤的促骨细胞增殖、分化作用在当归∶黄芪=1∶5时表现最佳,使MG-63细胞表现出显着的增殖、分化作用(图3)。在当归补血汤配伍淫羊藿后,其促进骨细胞增殖分化作用进一步显着加强(图4),当归∶黄芪∶淫羊藿=1∶5∶5时,在促进骨细胞增殖、分化方面均与对照药β-雌二醇接近,结果表明:本组合物可以刺激骨细胞增殖和分化,而没有引致乳癌细胞增殖,表现出良好的抗骨质疏松作用。
实施例18:含有当归多糖、黄芪多糖、黄芪乙醇提取物和淫羊藿提取物的药用组合物的制备
(1)当归多糖的制备
取当归药材1kg粉碎成粉末,以8倍水提取2次,每次1小时,合并提取液,减压浓缩。将浓缩液加入4倍95%乙醇,收集所得沉淀,干燥后得到当归多糖。
(2)黄芪多糖黄芪乙醇提取物的制备
取黄芪药材1kg粉碎成粉末,以8倍水或提取2次,每次1小时,合并提取液,减压浓缩。将浓缩液加入4倍95%乙醇,收集所得沉淀,干燥后得到黄芪多糖。剩余醇液挥干乙醇后以水重新溶解,过大孔树脂柱。水洗约3倍柱体积,再用70%乙醇洗脱3倍柱体积,收集醇洗脱液,浓缩干燥后得到黄芪乙醇提取物。
(3)淫羊藿提取物的制备
取淫羊藿药材1kg粉粹成粉末,以8倍70%乙醇水溶液提取2次,每次1小时,合并提取液,浓缩干燥后得淫羊藿提取物。
(4)分别取当归多糖、黄芪多糖、黄芪乙醇提取物和淫羊藿提取物,按照重量比8%∶46%∶6%∶40%充分混匀后干燥,得含有当归多糖、黄芪多糖、黄芪乙醇提取物和淫羊藿提取物的药用组合物1。
实施例19:含有当归多糖、黄芪多糖、黄芪乙醇提取物和淫羊藿的药用组合物的制备
按照实施例17所述方法分别提取当归多糖、黄芪多糖、黄芪乙醇提取物和淫羊藿乙醇提取物,按照重量比1%∶9%∶20%∶70%充分混匀后干燥,得含有当归多糖、黄芪多糖、黄芪乙醇提取物和淫羊藿提取物的药用组合物2。
实施例20:药用组合物胶囊的制备
取实施例17-18中组合物提取物300g,加入淀粉等辅料,置于沸腾制粒机中混合、干燥、制粒,将所得颗粒装入1号硬明胶胶囊中,每粒0.3g,分装100粒,即得。其它项目应符合中华人民共和国药典2000年版胶囊剂项下的有关规定。
实施例21:药用组合物片剂的制备
取实施例1-2中组合物提取物100g,加入淀粉等辅料,置于沸腾制粒机中混合、干燥、制粒,将所得颗粒装压片,每片0.2g,分装500片,即得。其它项目应符合中华人民共和国药典2000年版片剂项下的有关规定。
实施例22:药效学试验
一、组合物的雌激素样作用
1.细胞培养条件
MCF-7(含有ERE基因)细胞培养在MEM培养基,含10%胎牛血清、青霉素50U/ml、庆大霉素50μg/ml、0.1mM氨基酸和1.0mM丙酮酸钠,培养箱温度37℃,含5%CO2,95%空气。实验之前3天改变为无酚红MEMα培养基,含2%活性炭/葡聚糖处理的胎牛血清。
2.对雌激素反应组件-荧光素酶(ERE-luciferase)活性的影响
细胞种在24孔板(Falcon,BD Labware,NJ,USA),细胞密度约5x104细胞/孔,过夜让细胞贴壁,从第二天开始加药,每24小时加药一次,加药之前更换培养液。加药二次后取样,样品进行荧光素酶活性测定(Fluostar Optima,BMG Labtechnology)。实验资料以三次实验的平均值,每次平行做三个孔。
3.正交试验设计
首先对当归补血汤四个组分进行配伍考察,选择L16_4_5正交表,首先对当归补血汤中当归多糖(DP),当归乙醇提取物(DE),黄芪多糖(HP),黄芪乙醇提取物(HE)四个因素进行四水平考察。以当归补血汤原方当归∶黄芪1∶5配伍时各组分含量为1×,四水平分别为0×,0.5×,1×,2×,试验结果见图5、表1和表2:
表1.正交试验结果
表2.方差分析结果
从直观分析和方差分析结果中可以看出,黄芪乙醇提取物为影响当归补血汤活性最主要组分(p<0.05),对药效有显著影响,9号(当归多糖∶当归乙醇提取物∶黄芪多糖∶黄芪乙醇提取物∶淫羊藿提取物=1×∶0×∶1×∶2×)和15号(当归多糖∶当归乙醇提取物∶黄芪多糖∶黄芪乙醇提取物∶淫羊藿提取物=2×∶1×∶0.5×∶2×)组合物表现出最佳雌激素样作用。二者相比,9号组合物各组分所需药量更少,且根据传统中医理论和文献报道(Dong et at,2006),当归乙醇提取物具有刺激作用,故选择9号组合物作为最优组合物进行进一步研究。
5.淫羊藿用量选择
以药材重量当归∶黄芪∶淫羊藿=1∶5∶1时提取各味药材所得当归多糖、当归乙醇提取物、黄芪多糖、黄芪乙醇提取物、淫羊藿提取物含量为1×。
9号组合物加入不同量淫羊藿后对雌激素样作用结果如以下表3所示:
表3:
以上结果表明:古方当归补血汤的雌激素样活性在当归多糖∶黄芪多糖∶黄芪乙醇提取物∶淫羊藿提取物=1∶1∶2∶4时效果最佳,按此比例,根据各组分产率折合成重量比为:当归多糖∶黄芪多糖∶黄芪乙醇提取物∶淫羊藿提取物=8%∶46%∶6%∶40%。
实施例23:提取物防治去卵巢大鼠骨质疏松的实验研究
1.材料
1.1实验动物
健康雌性SD大鼠90只,4月龄,体重200-220g(由广州中医药大学实验动物中心提供,合格证号:97A016)。随机分为6组,每组15只,分别为空白对照组、模型组、提取物高剂量组、提取物中剂量组、提取物低剂量组、尼尔雌醇组。灌胃给药容积为10ml/kg。
1.2实验药物
提取物中各组分的重量配比为:当归多糖:8%;黄芪多糖:46%;黄芪乙醇提取物:6%;淫羊藿提取物:40%。提取物的施用剂量为:高剂量10g/kg体重,中剂量5g/kg体重,低剂量2.5g/kg体重,相当于临床剂量的20倍、10倍、5倍。药物以蒸馏水定容至所需浓度。
阴性对照品:蒸馏水。
阳性对照药:尼尔雌醇(由上海华联制药有限公司生产,2mg/片,批号:201001)。
麻醉药:3%戊巴比妥钠(佛山市化工实验厂生产,批号960001)。
盐酸四环素:为荧光标记物,上海新亚制药厂生产,0.25g/支,批号99124-18。
Calcein(USA):为荧光标记物。
甲基丙烯酸甲酯:北京化工厂生产,批号990117。
2.方法
2.1造模方法[1]
用3%戊巴比妥钠溶液按0.1ml/100g腹腔注射麻醉,空白对照组大白鼠行假手术,单纯取背部切口,切除少量脂肪组织后立即关闭;其余各组大白鼠,均采用背侧入路双侧卵巢摘除手术造模。
2.2给药方法
术后第3天开始给药,连续给药至术后3个月时处死全部实验动物。各组灌胃给药,空白对照组、模型组灌服蒸馏水,给药组灌服相应药物,每日一次;尼尔雌醇组[2]给予尼尔雌醇1mg/kg灌胃,使用前配成混悬液(浓度为0.167mg/ml),1次/周,其余时间给予蒸馏水10ml/kg灌胃。全部大鼠在处死前10天和2天分别于其背部皮下注射盐酸四环素25mg/kg和Calcein 5mg/kg。全部大鼠在处死前24小时禁食。
2.3检测指标[3]
实验过程中各组动物均有不同程度的死亡,剩余动物进行以下指标测定:
2.3.1骨密度测定:术后3个月采用双能X线骨密度测量仪(美国HOLOGIC公司产品,QDR-2000型,变异系数(CV)<0.1%)测定双侧胫骨干骺端骨密度。
2.3.2骨生物力学测定:术后3个月动物处死后取双侧股骨测生物力学指针(第一军医大学生物力学实验室协助。采用SWD-10型万能材料试验仪,长春试验仪器研究所生产)。
2.3.3血清降钙素(CT)、骨钙素(BGP)测定:分别于术前、术后3个月行眼底静脉丛取血,采用放免法测定。
2.3.4血清雌二醇(E2)测定:取血同上,采用放免法测定。
2.3.5血清钙(Ca)、磷(P)、镁(Mg)、碱性磷酸酶(ALP)测定:取血同上。采用酶标法测定。
2.3.6子宫湿重测定:术后3个月,采用颈椎脱位快速处死后,取子宫称重。
3.结果:
3.1提取物对去势大白鼠骨面密度(bone mineral density,BMD)(表4)、骨矿含量(bone mineral contant,BMC)(表5)变化的影响。
表4.提取物对去卵巢大鼠BMD变化的影响(g/cm2)
注:与模型组比较,*P<0.05 **P<0.01;与空白组比较,#P<0.05##P<0.01(下同)
表5.提取物对去卵巢大鼠BMC变化的影响(g)
表4、表5表明:提取物灌胃3个月时各组大鼠在左、右侧胫骨干骺端处的骨密度和骨矿含量均有显著差别,其中模型组最低;提取物高剂量组明显高于模型组,与阳性对照组无显著差异。说明提取物和尼尔雌醇均可显著提高胫骨干骺端处的BMD和BMC,二者作用相当,说明均能提高骨量。
3.2骨生物力学测定(表6)
表6.提取物对去卵巢大鼠左侧股骨生物力学指针的影响
表6表明:提取物灌胃3个月时各组大鼠左侧股骨扭转实验中最大扭矩(M)有明显差异,但扭转刚度(K)差异不显著。提取物中、高剂量组最大扭矩明显高于模型组,说明提取物能促进骨小梁重建,提高骨的力学性能,增加骨的韧度,使骨抗扭转强度增高,其中又以提取物高剂量组效果最好。阳性对照组M和K与模型组结果相似,仅略有增高,说明尼尔雌醇对骨的力学性能无明显影响,不能提高其抗骨折的效能。模型组扭转刚度差异不明显可能与实验时间较短,同时骨的类骨质增加较快,骨结构修复较慢有关。
3.3血CT(表7)、BGP(表8)测定:
表7表明:术前各组大鼠血清CT含量无明显差异;给药3个月后各组大鼠血清CT含量有明显差异,均明显高于模型组,提取物高、中、低剂量组和阳性对照组均明显高于空白对照组,阳性对照组又明显高于中药治疗组,说明提取物能提高血中降钙素的水平。
表7.提取物对去卵巢大鼠降钙素(CT)的影响(ng/L)
表8.提取物对去卵巢大鼠骨钙素(BGP)的影响(ng/ml)
表8表明:术前各组大鼠血清BGP含量无明显差别;给药3个月后各组大鼠血清BGP含量有明显差异,均明显高于模型组,提取物高、中剂量组和阳性对照组均明显高于空白对照组,阳性对照组又明显高于提取物各治疗组,说明提取物有提高血中骨钙素含量的作用。
3.4血清E2测定(表9):
表9.提取物对去卵巢大鼠血清雌二醇(E2)含量的影响(pg/ml)
表9表明:术前各组大鼠血清E2含量无明显差异;给药3个月后各组大鼠血清E2含量有显著差异,均明显高于模型组,提取物高、中剂量组和阳性对照组均明显高于空白对照组,阳性对照组又明显高于中药各组,说明提取物能有效的提高体内E2含量,但不及尼尔雌醇;中药组中又以高剂量组E2含量最高,且有明显量效关系。同时,我们采用放免法对高、中、低三种不同浓度的提取物进行测定,发现各种剂量提取物中均含有雌激素样作用物质,且呈量效关系。
3.5血清Ca(表10)、P(表11)、Mg(表12)、ALP(表13)测定:
表10.提取物对大鼠血清Ca含量的影响(mmol/L)
表11.提取物对大鼠血清P含量的影响(mmol/L)
表12.提取物对大鼠血清Mg含量的影响(mmol/L)
表13.提取物对大鼠血清ALP含量的影响(u/L)
表10-13表明,各组大鼠在手术前、术后一周及给药3个月时血清Ca、P、ALP、Mg的含量经过组间和自身前后比较,发现均无显著差异和变化。说明本实验动物模型是通过切除卵巢引起的原发性骨质疏松症模型,而非由于其它原因影响骨代谢的疾病引起的继发性骨质疏松症模型。
3.6子宫湿重测定
表14.提取物对大鼠子宫湿重的影响(mg)
表14表明:实验动物于3个月后处死时各组大鼠子宫重量有明显差异,其中模型组最低,空白对照组最高,提取物高、中、低剂量组均明显高于模型组,但明显低于阳性对照组。说明切除卵巢后由于大鼠体内雌激素水平下降,其对子宫内膜的刺激作用下降,故模型组子宫内膜明显萎缩;尼尔雌醇和提取物均有不同程度提高血内雌激素水平的作用,而使子宫内膜增生。
4.讨论
本研究通过切除卵巢诱发绝经后骨质疏松症的大鼠模型,运用随机对照分组原则,采用骨生物力学、DEXA扫描、放免、骨代谢等指标观察了提取物对实验动物的影响,并与尼尔雌醇进行对照,旨在观察提取物对绝经后骨质疏松症的疗效。本次实验结果表明:提取物能显著提高去势大鼠骨矿含量及骨密度、骨抗扭转力学性能,以及血清中E2、CT、BGP的含量。提取物可以提高血内雌激素水平的作用,使子宫内膜增生,减慢子宫萎缩。
机译: 用于预防和/或治疗骨质疏松症或由更年期综合症引起的变化的组合物
机译: 预防和/或治疗骨质疏松症和更年期综合症变化的药物组合物,其中含有丙酰基肉碱和金雀异黄素
机译: 用于预防和/或治疗骨质疏松症或由更年期综合症引起的变化的组合物