柴胡组织培养快速育苗方法

技术领域

本发明涉及通过组织培养技术的植物再生，具体属于一种药用植物柴胡的组织培养快速育苗方法。

背景技术

柴胡是重要的药用植物，也是我国、韩国及日本等国所使用的大宗药材。中国药典(2000年版)收录伞形科植物北柴胡Bupleurum Chinese DC.(又称硬苗柴胡)和狭叶柴胡B.scorzonerifolium Willd.(又称软苗柴胡或红柴胡)为药用柴胡的原植物。柴胡以根入药，根中含有柴胡皂苷和挥发油等成分，具有抗病毒、抗细菌内毒素、抗炎、抗肿瘤、抗惊厥、解热、降血脂及促进分泌、保肝、提高免疫力等功效，药用价值很高。

近年来，柴胡的市场需求量逐年增加，传统的获取柴胡的方法是以采集和消耗野生资源为代价，由于多年来无计划的滥采滥挖以及自然环境的破坏所导致的自然资源再生能力大大下降等原因，使得天然野生药用柴胡资源严重不足，只能满足需求量的50％左右，其余的50％需要通过人工栽培来补充，因此近年来柴胡供应的重点逐步转移到人工栽培植株上来。目前我国种植面积最大的为原产于日本的三岛柴胡，但三岛柴胡不是正品药材，我国政府有关部门已明令要求种植原产于我国的柴胡种而禁止种植三岛柴胡。然而，由于各种柴胡植物外形相似，而且常常是多个种混生于同一产地，形态学鉴定比较困难，学术界对其的分类处理亦有争议。经我们调查，北柴胡各产地均存在不同程度的品种混杂现象，既有北柴胡种下的不同变型，也有形态易混的近缘种，更有引种栽培后出现的各种形态变异，由此造成北柴胡药材的种质不纯、品种混杂、质量参差不齐，致使总体质量下降，已影响到用药的准确性和药品质量的稳定性，也影响到柴胡的出口创汇。因此，迫切需要采用一种更加科学、系统、有效、实用的技术，在查清北柴胡主要变异类型的遗传特征和柴胡的授粉类型的基础上，进行柴胡优良品种的筛选和培育，特别是对现有的、已被广大药农所接受的人工栽培种进行种质提纯、复壮，培育出品质优良、变异小的高产、优质柴胡植株(种子)并批量生产和供应市场，是目前亟待解决的问题。

植物组织培养技术是快速育苗的有效方法，已在园艺、林木等领域得到了广泛的应用。应用组织培养方法快速繁殖优质药用柴胡，是解决柴胡供求矛盾、提高种植水平和柴胡质量的快速而有效的途径。然而，植物的种类不同，品种不同，甚至同一品种所选用的外植体不同，组织培养所需的培养基成分、培养条件和移栽管理条件等也存在很大的差异。

发明内容

本发明的目的是建立药用柴胡的组织培养快速育苗方法，规模化生产优质柴胡种苗和种子。该方法简单实用，高效迅速，适宜规模化生产。

本发明经过多重筛选实验优化培养繁育条件，提出了适宜药用柴胡组织培养快速繁殖育苗的方法。本发明选择优质北柴胡(Bupleurum chineseDC.)或狭叶柴胡(B.scorzonerifoliumWilld)的茎段为外植体；筛选了芽快速增殖的培养基组成成分；筛选了壮苗培养的条件；筛选了生根培养培养基组成；筛选并建立了试管苗移栽及田间管理的条件和措施。

本发明的柴胡组织培养快速育苗方法，具体步骤包括：

(1)外植体的消毒：将采自田间的柴胡用自来水冲去浮土，取带腋芽的幼茎作为外植体，切成3cm～5cm长的切段，经75％乙醇浸泡30s，0.1％HgCl₂水溶液消毒10min，无菌水冲洗4次；

(2)芽的诱导与增殖：将经上述处理的外植体切成单芽茎段，分别接种于含外源植物激素的B₅培养基中，在25±2℃、1500lux～2500lux、12～14h/d光照下培养30d～40d得到无根苗，每隔30d～40d继代培养一次；培养基配方为：B₅培养基+0.2mg/L～1.5mg/L6-BA+0mg/L～0.2mg/L KT+0mg/L～0.2mg/L NAA+25％～35％蔗糖，pH5.8～6.0。在以上培养基中，外植体上的腋芽均能正常萌发。

上述培养基优选为：B5培养基+1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L KT+30％蔗糖，pH5.8，在该培养基中接种1周后腋芽萌发，接种2～3周后，芽迅速增殖形成丛生芽，无根苗生长健壮，苗高3cm～4cm。每隔30d～40d后可继代培养。

(3)壮苗：经过多次继代培养后，无根苗生长状态会减弱，需要将增殖得到的无根苗接种到含25％～35％蔗糖，pH5.8～6.0的B₅培养基中，在25±2℃、1500lux～2500lux、12～14h/d光照下培养15d～35d壮苗。

(4)生根诱导：选取健壮的、1cm～3cm高的丛生无根苗，将其切分为单芽，转至生根培养基中诱导生根，得到完整试管植株；生根培养基配方为：1/2MS培养基+0.1mg/L～1.0mg/L NAA+0.1mg/L～1.0mg/L IBA+0mg/L～1.0mg/L DSC+25％～35％蔗糖，pH5.8～6.0；在25±2℃、1500lux～2500lux、12～14h/d光照下培养35d～45d。柴胡无根苗在以上培养基中几乎都能生根。

优选生根培养基为：1/2MS培养基+NAA0.1mg/L+IBA0.5mg/L+DSC1.0mg/L+30％蔗糖，pH5.8，该培养基对柴胡无根苗的生根有良好的促进作用，生根率为100％。

(5)炼苗与移栽：选取生根多且健壮的植株揭开封口膜炼苗3d～5d，然后洗净培养基，移入装有草炭土和珍珠岩(体积比1∶1～3∶1)混合基质的营养钵中置于温室，移栽时应注意保护试管苗的根尖，移栽后浇透水，用塑料薄膜覆盖以保湿，3d后逐渐揭去薄膜通风，以避免霉菌污染，加强光照，及时补足营养钵水分，1～3周后，将营养钵置于田间适应大田环境，经2～4周后根系长成，移栽至追施磷肥的大田中。移栽初期要注意病虫害的防治与水分的补充。移栽苗的成活率可达94％～97％。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：

(1)缩短了柴胡选优育苗的周期。柴胡传统种植育种周期较长，难以满足大规模生产的需求。本发明可以大大缩短柴胡的育苗周期，并且可以选择优质品种或类型进行大规模工厂化生产。

(2)提高了繁殖系数，移栽苗的成活率高。普通柴胡栽培类型繁殖周期长。本发明的繁殖速度快，苗生长整齐，单芽繁殖30d继代一次，增殖倍数为5～10倍；；筛选出适宜的柴胡试管苗炼苗条件和栽培基质，使得移栽成活率达到了94％～97％；具有成本低的特点。

(3)以茎段作为外植体，通过芽的增殖进行快速繁殖，保证了遗传的稳定性，并且取材容易，更新方便。

(4)可以根据市场供求关系，合理安排和调整生产规模，及时组织生产，并可实现周年生产。

(5)具有普遍的适用性。本发明基于对柴胡主要的种植地山西、陕西、甘肃的8个地区种植的北柴胡和狭叶柴胡栽培类型的快速繁殖研究，各地的柴胡均能被驯化并进行试管快速繁殖，有助于今后筛选得到的柴胡优质品种或类型的快速繁殖与推广。

附图说明

图1示北柴胡无根苗芽的增殖：将取自田间的北柴胡茎段经过表面消毒后接入培养基，腋芽长出后，在激素配比为6-BA1.0mg/L+KT0.2mg/L的B₅培养基中进行芽的快速扩大增殖，3周后得到丛生芽。

图2示北柴胡无根苗诱导出不定根：经B5基本培养基壮苗后，将丛生芽分切为单芽，接入激素配比为NAA0.1mg/L、IBA0.5mg/L和DSC1.0mg/L的1/2MS培养基诱导生根，35d后得到的完整的试管苗。

图3示北柴胡试管苗移栽至有基质的营养钵中：试管苗经炼苗后，洗净根部的培养基，移栽到含草炭土和珍珠岩混合基质的营养钵中。

图4示北柴胡试管苗移栽大田：营养钵中的试管苗适应大田环境，根系发育完善后，移栽到土壤中，表现很好的生长态势。

图5示移栽后的北柴胡试管苗开花：试管苗移栽入大田2个月后开始开花，花期长达4个月。

图6示移栽后的北柴胡试管苗结实：移入大田的试管苗正常结实，而且籽粒饱满。