抗人P－选择素凝集素－表皮生长因子功能域的人源单克隆抗体及其杂交瘤细胞株

技术领域

本发明涉及转基因技术领域，特别涉及一种抗人P-选择素凝集素-表皮生长因子(P-selectin-lectin-EGF，PsL-EGF)功能域的人源单克隆抗体及产生该抗体的杂交瘤细胞株。

背景技术

P-选择素(P-selectin)是一种分子量为140kD的I型膜糖蛋白，定位于血小板的α颗粒和内皮细胞Weibel-Palade小体内，全长由789个氨基酸残基组成。其N末端730个氨基酸构成胞外区，包括1个凝集素(Lectin)结构域、1个表皮生长因子(EGF)结构域和9个补体调节蛋白重复序列(SCR)结构域；C末端24个氨基酸构成跨膜区。此外35个氨基酸构成胞浆短尾(Johnston GI，Cook RG，McEver RP.Cloning of GMP-140，a granulemembrane protein of platelets and endothelium：sequence similarity to proteinsinvolved in cell adhesion and inflammation.Cell，1989，56(6)：1033-1044)。P-选择素属细胞黏附分子的选择素家族，其作为血小板/内皮细胞活化的标志和黏附受体，可介导白细胞与活化内皮细胞等最初黏附，是启动炎症反应并维持炎症状态的重要成分。其正常情况下不表达或低表达，受到炎症、损伤等因素刺激后可显著表达，且原先不表达的脏器也出现表达，故P-选择素参与免疫炎症损伤、血栓形成及肿瘤转移等多种病理生理过程，其过度或持续表达可成为某些脏器病变的标志，与诸多临床疾病有十分密切的关系。实验表明，抑制其表达及其细胞黏附作用已取得良好的抗炎、抗肿瘤转移等防治效果。

在本申请人的专利号为ZL 200310108522.5的中国专利中，公开了针对抗P-选择素lectin-EGF(L-EGF)功能域的鼠源单克隆抗体(PsL-EGF mAb)及其制备方法(包括杂交瘤细胞)和应用。试验数据表明PsL-EGF mAb较P-选择素全长单抗更具有抗黏附/抗炎靶向抑制效应，且对L-，E-选择素也有黏附抑制作用，以及对机体细胞免疫功能无明显抑制且有调节效应；进一步利用肾缺血再灌注损伤大鼠模型证明该单抗能有效抑制P-选择素表达及其介导的白细胞黏附聚集，减轻肾组织病理损伤，改善肾功能，且基本不影响机体正常免疫防御功能。

然而，鼠源性单抗应用于人体存在着免疫学和药理学两方面的问题：主要表现为鼠抗半衰期短，不能有效激发适当的抗体依赖的细胞毒效应和补体依赖的细胞毒效应，以及人抗鼠抗体反应等，限制了该鼠源单抗药物在临床的开发和利用。

发明内容

本发明要解决的技术问题即是上述课题，提供一种抗人P-选择素凝集素-表皮生长因子功能域的人源单克隆抗体及其制备方法，尤其是产生该单克隆抗体的特定杂交瘤细胞株。

本发明选用现有能产生人源单克隆抗体的转基因小鼠来制备本发明的人源单抗。该转基因小鼠系采用人工文库制备整合含人免疫球蛋白(Ig)位点，同时敲除内源性Ig位点，并以人Ig基因取代小鼠Ig基因，经重排后表达完全人源的特异性抗体。具体来说，本发明选用携有人Igμ、Igκ和Igλ基因，且鼠源IgH和Igκ链表达失活，而称为五特征鼠(Nicholson IC，ZouX，Popov AV，et al.Antibody Repertoires of Four-and Five-Feature TranslocusMice Carrying Human Immunoglobulin Heavy Chain and κ and λ LightChain Yeast Artificial Chromosomes.The Journal of Immunology，1999，163(12)：6898-6906)的转基因小鼠。由于本研究的目的基因片段PsL-EGF仅474bp，表达的蛋白分子量比较小，抗原性较弱，而实验抗体制备所用的转基因小鼠免疫应答能力较弱，需要选择合适的载体构建融合蛋白以增强免疫原性；考虑到谷胱甘肽转移酶(Glutathione-S-Transferase，GST)对一些蛋白的融合表达具有较好的可溶性和较高的表达量，而谷胱甘肽固化于琼脂糖形成的亲和层析树脂对GST及其融合蛋白的纯化效率很高。因此，本发明首先利用特异引物，通过PCR扩增目的基因片段PsL-EGF，将其连接到pGEM T-easy载体，用EcoRI和Sal I双酶切后构建入pGEX-5X-1载体(含有GST)，从而构建了pGEX-PsL-EGF重组质粒。后者经测序验证后转化大肠杆菌BL21，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达了GST-PsL-EGF融合蛋白。该融合蛋白经纯化后作为抗原免疫转基因小鼠，应用杂交瘤技术，筛选阳性克隆，制备腹水及获得目的抗体——特异性抗人P-选择素L-EGF功能域的人源单克隆抗体。

上述杂交瘤技术包括皮下皮内注射和腹腔注射两种免疫方法交替进行，免疫转基因小鼠，将其脾细胞作为免疫细胞与小鼠的骨髓瘤细胞SP2/0融合。而后通过间接ELISA筛选阳性克隆，获得1株可稳定分泌抗PsL-EGF功能域单抗的人源单抗杂交瘤细胞株PsL-EGFmAb-2，其亚型为IgM，轻链为λ型，该人源单抗杂交瘤细胞株PsL-EGFmAb-2已于2006年10月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，获得保藏号为CCTCC NO：C200634。

对本发明所获单抗的特性进行了鉴定与检测，结果表明：该单克隆抗体为人源单抗(IgM，λ型)，并具有良好的特异性和稳定性。抗PsL-EGF人源单克隆抗体的成功制备，为进一步将其应用于人类疾病的特异性抗黏附治疗研究奠定了基础，并更具有潜在的临床应用价值。

本发明的人源单抗杂交瘤细胞株PsL-EGFmAb-2已于2006年10月26日保藏在位于中国武汉大学(邮编为430072)内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，获得保藏号为CCTCC NO：C200634。

附图说明

图1为pGEX-PsL-EGF重组质粒的构建及酶切鉴定的电泳图谱，

M1：DL 2,000 Marker；M2：DL 15000 Marker；A：PCR扩增PsL-EGF片段；B：PsL-EGF-pEGMT-easy重组质粒；C：EcoR I、Sal I双酶切PsL-EGF-pEGMT-easy重组质粒；D：pGEX-5X-1质粒；E：EcoR I、Sal I双酶切pGEX-5X-1质粒；F：pGEX-PsL-EGF重组质粒；G：EcoR I、Sal I双酶切pGEX-PsL-EGF重组质粒。

图2为pGEX-PsL-EGF载体构建示意图。

图3为GST-PsL-EGF融合蛋白表达与纯化的SDS-PAGE检测图谱，

A：IPTG诱导前的菌液；B：IPTG诱导后的培养液；C：破菌后上清；D：破菌后沉淀；E：尿素纯化的GST-PsL-EGF蛋白；F：丙酮纯化的GST-PsL-EGF蛋白；M：蛋白Marker。

图4为His-PsL-EGF和GST蛋白纯化后行SDS-PAGE凝胶电泳结果，

M：蛋白Marker；A：His-PsL-EGF蛋白；B：GST蛋白。

图5为本发明杂交瘤细胞株的染色体分析结果。

图6为RT-PCR鉴定人源抗体结果，1以人淋巴细胞cDNA为模板；2以杂交瘤细胞株CCTCC NO：C200634的cDNA为模板；3以鼠淋巴细胞cDNA为模板。

图7为抗PsL-EGF人源单克隆抗体IgM Fc段测序结果。

图8为ELISA鉴定免疫血清(A)和本发明杂交瘤细胞上清液(B)中的抗体结果。

图9为Western blot鉴定免疫血清(A)和本发明杂交瘤细胞上清(B)中的抗体结果。

具体实施方式

在下面的实施例中进一步说明本发明，但并不限制本发明的范围。

下面所述实施例中的材料为：

1、质粒、菌株及主要制剂E.coli DH5α，E.coli XLI-Blue菌株为GBICO公司产品，E.coli BL-21(DE3)菌株、pGEX-5X-1质粒为PharmaciaBiotech公司产品；限制性内切酶(EcoR I、Sal I)为TaKaRa公司产品、T4DNA连接酶、TaqPlus DNA聚合酶、pGEM-T easy载体连接试剂盒、dNTP均为Promega公司产品；DNA marker DL2000为NEB公司产品，RT-PCR试剂盒为Invitrogen公司产品；QIA quick Gel Extraction Kit、质粒小抽试剂盒、PCR产物回收试剂盒、Ni²⁺-NTA superflow树脂均为Qiagen公司产品；Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱为BD公司产品；RNA抽提液Trizol、逆转录试剂盒、RPMI-1640培养基、胎牛血清、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、PEG、HAT、HT均为GibcoBRL公司产品；rhP-selectin/Fc chimera为R&D公司产品；HRP标记的羊抗人IgM(μ链)抗体为Protol research Inc公司产品；HRP标记的羊抗人κ链抗体、HRP标记的羊抗人λ链抗体为bethyl公司产品；乙醇、苯酚、氯仿、异戊醇、甲醛、戊二醛、IPTG(异丙基-β-D硫代半乳糖苷)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二硫苏糖醇(DTT)、十二烷基磺酸钠(SDS)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)等其他常规试剂均为市售进口或国产分析纯。

2、动物与细胞株6-8周龄Balb/c小鼠，雌性，20-25g/只，购自中科院上海动物实验中心；实验前于本院动物房专人饲养1周，正常饮食；小鼠骨髓瘤细胞SP2/0取自上海市免疫学研究所；转基因小鼠(五特征鼠)购自上海转基因研究中心。

3、自配试剂

1)LB培养液

Peptone              10g

酵母抽提液           5g

氯化钠               10g

溶于蒸馏水，用NaOH调pH至7.0，定容至1000ml，高压灭菌121℃，20min。若做平板，则加入15g琼脂粉，高压灭菌121℃，20min。若做LB-Amp培养液或平板，高压灭菌后，待培养基冷至50℃左右再加入氨苄青霉素(Amp)至终浓度为50ug/ml。

2)2×YT培养基

Tryptone 16g，Yeast Extract 10g，NaCl 5g，加蒸馏水至1L，用5mol/L NaOH调pH7.0，高压蒸汽灭菌(1.034×10⁵pa)20min，置4℃冰箱备用。

3)TAE电泳缓冲液(50×储存液)：48.4g Tris碱，11.42ml冰乙酸，20ml0.5mol/L EDTA(pH8.0)，定容至1000ml。

4)DNA凝胶加样缓冲液：0.25％溴酚兰，40％(W/V)蔗糖水溶液。

5)EB(10mg/ml)：0.01g EB粉末溶于1ml蒸馏水中，室温避光保存。

6)SDS-PAGE电泳缓冲液(50×储存液)：48.4g Tris碱，11.42ml冰乙酸，20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，定容至1000ml。

7)2×SDS上样缓冲液

        1M Tris-HCl(pH6.8)       2.5ml

        10％SDS                  4ml

        甘油                     2ml

        蒸馏水                   1.5ml

        溴酚蓝                   0.1％

        DTT                      0.015g

                                 共10ml

8)5％积层胶(两块板)

        蒸馏水                   2.7ml

        30％凝胶储存液           0.67ml

        0.5MTris-HCl(pH6.8)      0.5ml

        10％SDS                  40ul

        10％过硫酸铵(AP)         40ul

        TEMED                    4ul

        后二者最后加。

9)12％分离胶(两块板)

        蒸馏水                    3.3ml

        30％凝胶储存液            4.0ml

        1.5M Tris-HCl(pH8.8)      2.5ml

        10％SDS                   0.1ml

        10％过硫酸铵(AP)          0.1ml

        TEMED                     4ul

        后二者最后加。

10)电泳缓冲液

        Tris                      3g

        甘氨酸(氨基乙酸)          14.4g

        SDS                       1g

溶于蒸馏水定容至1000ml，4℃保存。

11)考马斯亮蓝脱色液

        甲醇                      40ml

        乙酸                      10ml

        蒸馏水                    50ml

12)考马斯亮蓝染色液：即在脱色液中加入0.1％考马斯亮蓝R250。

13)RPMI-1640-20培养液：将RPMI 1640补充20％灭活胎牛血清，加抗生素(青霉素100IU/ml、链霉素100ug/ml)，谷氨酰胺(200mmol/L)及丙酮酸钠(100mmol/L)配成完全培养液。

14)1640-HAT培养液：98ml RPMI-1640-20培养液中加入50×HAT 2ml。

15)50％PEG：PEG1500以1g/管分管，高压灭菌冷却后置4℃保存，临用前加等体积RPMI-1640培养液混合。

16)10％二甲亚砜(DMSO)冻存液

RPMI 1640中加入10％DMSO。临用前新鲜配置，或置于4℃冰箱(避光)备用，保存1个月左右。

17)包被液(0.05M碳酸缓冲液，pH9.6)

        碳酸钠                1.59g

        碳酸氢钠              2.93g

        双蒸水                1000ml

18)洗涤液(0.01MPBS-T，pH7.2)

        磷酸氢二钠            2.579g

        磷酸二氢钠            0.4369g

        氯化钠                8.5g

        Tween-20              0.5ml

    溶于水定容至1000ml，4℃保存。

19)稀释缓冲液(含1％BSA的0.02M PBS缓冲液，pH7.4)

        氯化钾                0.2g

        磷酸二氢钾            0.2g

        磷酸氢二钠.12H₂O      2.9g

        氯化钠                8.0g

        双蒸水                1000ml

临用前加1％BSA。

20)底物液

        A液：0.1mol/l柠檬酸溶液

        B液：0.2mol/1Na₂HPO₄溶液

临用前取A液5ml和B液5ml混合加入邻苯二胺(OPD)4mg，待充分溶解后加入30％H₂O₂2.5ul，即成底物工作液。

21)转移缓冲液

        Tris                  3g

        甘氨酸(氨基乙酸)      14.4g

        溶于水至1000ml，4℃保存。

22)丽春红S染色液

        丽春红S                2g

        三氯乙酸                30g

        磺基水杨酸              30g

溶于水至1000ml，使用时按1∶9稀释，可反复使用。

23)10×RNA电泳缓冲液(MOPS 0.2mol/L，EDTA 0.01mol/L，NaAC0.05mol/L混匀后用2mol/L氢氧化钠调节pH至7.0，临用时以DEPC-H₂O稀释)。

24)RNA上样缓冲液(成分有100％甲酰胺0.5ml、37％甲醛0.2ml、10×电泳缓冲液0.1ml、溴酚兰0.06ml，临用时配制)。

4、His-PsL-EGF蛋白的表达与纯化

根据上述专利CN200310108522.5实施例1-4制备纯化，结果如图4所示。

5、GST蛋白的表达与纯化

将pGEX-5X-1质粒转化入BL21表达菌中，次日取单克隆加入5ml含氨苄青霉素的LB培养液，37℃，250rpm振摇过夜。次日将此菌液加入500ml含氨苄青霉素的2×YT培养基，37℃，250rpm振摇至OD₆₀₀值达0.6-0.8，随后加入0.4mM IPTG诱导表达特异蛋白，28℃表达5h后收集菌液。

GST蛋白纯化过程简述如下：将上述菌液置4℃，8000rpm离心5min，弃上清液，于沉淀中加入1×PBS 40ml，振荡使其充分混悬，分小批量置超声破碎仪中破碎细菌，直至呈半透明状，加入终浓度为1％的TritonX-100，置振荡器振荡30min，4℃，8000rpm离心15min，弃沉淀，将上清液加于预制的Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱，循环上样3次，1×PBS 50ml洗涤后，加入洗脱液，静置10min后，收集流出液，按每管1ml收集、编号。取部分样品进行SDS-PAGE电泳，剩余部分-20℃保存备用，结果如图4所示。

实施例1  PCR扩增

以pET42b-PsL-EGF质粒(即pET42b(+)-L-E质粒，参见专利CN200310108522.5)为模板，用引物进行PCR扩增得到人P-选择素Lectin--EGF区域474bp片段。

1、引物设计根据GenBank(登录号M25322)中人P-选择素lectin-EGF功能域的mRNA序列设计一对引物并结合载体的多克隆酶切位点，在上、下游引物5’端分别加入限制性内切酶位点，引物序列如下，下划线部分为EcoR I和Sal I酶切位点，引物由上海生工生物公司合成。

上游：5’CGTGAATTCTGGACTTATCATTACAGCAC 3’

      EcoR I

下游：5’TTCGTCGACCTCTCTCACGTATTCACATTCT 3’

      Sal I

2、PCR

pET42b-PsL-EGF质粒  1ul

3、PCR产物电泳取上述产物于1％琼脂糖凝胶(含0.5ug/ul溴化乙锭)中进行电泳分析，100V，30min，紫外灯下观察PCR产物染色条带，结果表明扩增片段的大小与预期的474bp相符，结果如图1的A泳道所示。

4、PCR产物纯化用QIAGEN quick-spin PCR纯化试剂盒回收PCR产物，具体过程详见试剂盒说明。

实施例2  PsL-EGF-pEGM T-easy重组质粒的构建

将PsL-EGF片段用EcoR I和Sal I双酶切，将酶切产物连入经同样酶切的pGEM T-Easy载体，得到PsL-EGF-pEGM T-easy重组质粒。转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含有氨苄青霉素和IPTG/X-Gal(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷/5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷)的选择性LB培养皿中，于37℃培养过夜。挑取白色单克隆，接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养基，37℃，250rpm振摇过夜。提取质粒并进行EcoR I和Sal I酶切电泳鉴定，可得大小两个片段，证明含有正确的插入片段，结果如图1的C泳道所示。

实施例3  pGEX-PsL-EGF重组质粒的构建

将实施例2所得重组质粒PsL-EGF-pEGM T-easy进行EcoR I和Sal I酶切后得到的小片段进行割胶纯化回收后，与EcoR I、Sal I双酶切后的pGEX-5X-1质粒得到的大片段pGEX片段(如图1的E泳道所示)连接，获得pGEX-PsL-EGF重组质粒(如图1的F泳道所示，构建过程如图2所示)。转化E.coli XLI-Blue感受态细胞，涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜。挑取白色单克隆，提取质粒并进行EcoR I和Sal I酶切电泳鉴定，可得大小两个片段，小片段约474bp，证明含有正确的插入片段，结果如图1的G泳道所示。再将小片段经PE3700测序仪进行测序，测序后用BLAST软件将所测序列与GenBank中的序列进行比对，结果一致，说明所构建的重组质粒正确。

实施例4  目的蛋白质GST-PsL-EGF的表达与纯化

将鉴定正确的重组质粒pGEX-PsL-EGF转化入表达菌种E.coli BL21(DE3)得到基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pGEX-PsL-EGF。将基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pGEX-PsL-EGF接种于5ml LB培养液中，37℃活化过夜，次日将上述菌液以1％比例接种于500ml含氨苄青霉素的2×YT培养基中，25℃，250rpm振摇3-4h，使其OD₆₀₀值达0.5-0.8，取1ml菌液作为诱导表达前的对照，其余菌液加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L，诱导3h后收集菌体。

收集菌液离心后，1×PBS洗涤菌体3次，Buffer A(Tris-base 50mM，EDTA0.5mM，NaCl 50mM，甘油5％，DTT 5mM)重悬菌体，冰浴中超声破碎菌体至清亮(400W，每次5s，间歇12s，共超声20次)，4℃，8000rpm离心15min，弃上清液，再用Buffer A洗涤沉淀2-3次，于沉淀中加入8M的尿素室温静置30min至2h使其缓慢溶解，用滤纸滤除不溶物质。溶液加入样品缓冲液混匀后行SDS-PAGE凝胶电泳，使用特殊样品梳，使一次上样体积可达1ml左右，电泳结束后将蛋白质标准品和小部分样品所在的凝胶切下，用考马斯亮蓝染色，以确定目的蛋白的位置，其余凝胶浸入冰冷的0.25M KCl溶液中染色，2-3min后即可见白色蛋白条带，将目的蛋白所在位置的条带切下，用去离子水浸洗15min，再洗涤2次，捣碎凝胶条用Elute溶液(0.1％SDS，50mM Tris-HClpH 7.9，0.1mM EDTA，5mM DTT，0.2M NaCl)浸泡，4℃过夜，次日8000rpm离心20min，取上清液加入4倍体积的丙酮(-20℃预冷)，-20℃放置4h后，4℃，8000rpm离心20min，弃上清液，沉淀用8M尿素溶解后-20℃保存，即为电泳级纯化的GST-PsL-EGF蛋白，结果如图3所示。

实施例5  动物免疫

(1)免疫前抗原的处理：取适量纯化后的GST-PsL-EGF融合蛋白，行12％SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束后将凝胶浸入冰冷的0.25M KCl溶液中染色，切下白色条带，用去离子水浸洗15min，再洗涤2次，捣碎凝胶条使其成悬液状待用。

(2)免疫方法：皮下皮内注射和腹腔注射交替进行。皮下皮内注射即分别于转基因小鼠两侧脚掌皮下注射上述抗原0.01ml，剩余部分分别注射于腿部、背部皮下及皮内。腹腔注射剂量不大于0.5ml。

(3)免疫剂量及间隔时间：每次每只小鼠免疫100μg上述抗原，初次免疫后，每隔2-3周加强免疫一次，加强免疫后第7d自小鼠眼眶内眦取血测效价，加强免疫后第20d，由尾静脉注射抗原溶液100-150ug/只，3-5d内进行细胞融合。

实施例6  细胞融合、筛选及克隆化

1、细胞准备

1)脾细胞制备：将实施例5中加强免疫后的转基因小鼠摘除眼球取血后脱颈处死，收集血液以分离血清作阳性对照。另将上述处死小鼠浸于75％乙醇5min后，腹部朝上置于超净台上，在无菌条件下分离出脾脏，冲去血液及剥离周围结缔组织，然后将脾脏装入100目尼龙网袋中，置于盛有10mlRPMI-1640培养液的无菌培养皿中，用镊子隔网袋研磨脾细胞至成单细胞悬液，再用少量RPMI-1640培养液冲洗网袋后，将脾细胞悬液移入50ml离心管中，用RPMI-1640培养液洗涤两次后悬浮于RPMI-1640培养液中进行细胞计数。

2)饲养细胞制备：融合前一日取一只转基因小鼠脱颈处死，浸于75％乙醇5min后，腹部朝上置于超净台上，用两把镊子于小鼠腹中部向上下方撕开小鼠皮肤，用无菌镊子提起腹部的同时将预制的1640-HAT培养液注入小鼠腹腔内，回抽腹腔内液体行细胞计数，用1640-HAT培养液调整细胞浓度为2×10⁵/ml，然后按每孔100ul将饲养细胞液滴加到96孔细胞培养板中，将培养板置于5％CO₂，37℃培养箱中培养。

3)骨髓瘤细胞制备：常规方法复苏骨髓瘤细胞SP2/0，加入RPMI-1640-20培养液后置于5％CO₂，37℃培养箱中培养。细胞融合前按1∶3传代一次，并于融合前一日细胞换液，且融合当天应以细胞处于对数生长期为宜。融合前用吸管将细胞轻轻吹落，收集于50ml离心管中，室温1000rpm离心5min，移出上清液，将沉淀悬浮于RPMI-1640培养液中行细胞计数。

2、细胞融合

将上述制备的脾细胞和骨髓瘤细胞以10∶1的比例混合于50ml离心管中，1000rpm离心5min，用RPMI-1640培养液洗涤2次，移出上清液后在手心轻轻敲打试管底部，使细胞团块松匀后，置37℃水浴中缓慢加入1ml50％PEG，边加边缓慢搅拌，而后在水浴中静置1.5min，5min内按速度由慢到快加入RPMI-1640培养液10ml，然后补加该培养液至40ml，轻轻转动试管，使之均匀混合，1000rpm离心5min，弃上清液，取少量1640-HAT培养液将细胞团块轻轻吹散，再加入适量1640-HAT培养液充分稀释，按100ul/孔加到已铺有饲养细胞的96孔培养板中，置于37℃，5％CO₂培养箱培养。期间经常观察细胞生长情况，及时补液和换液。

3、阳性克隆的筛选

当杂交瘤细胞生长状态良好，占孔底25-50％左右时，采用间接ELISA法筛选阳性克隆。

1)包板：将His-PsL-EGF蛋白用包被液稀释至5ug/ml，按每孔100ul加入酶标板，置4℃冰箱过夜。

2)封闭：酶标板洗涤3次后，每孔加入封闭液300ul，置37℃封闭1h。

3)加样：同上洗涤后，按每孔100ul加入杂交瘤细胞上清液、1∶100稀释的转基因小鼠免疫血清(阳性对照)及RPMI-1640培养液(阴性对照)，置37℃孵箱温育1h。

4)加酶标二抗：同上洗涤后拍干，分别加入1∶5000稀释的HRP标记的羊抗人IgM(μ链)抗体，每孔100ul，置37℃孵箱温育1h。

5)显色：同上洗涤后拍干，每孔加入显色液100ul，加样结束后，用封板膜封板，置37℃显色15-20min，加入50ul 2mol/L硫酸溶液终止显色，于酶标仪波长490nm处读取吸光值，以OD₄₉₀值大于阴性对照的2倍为阳性。对酶标板阳性孔所对应的细胞孔换新鲜培养液，培养1-2d后用5ug/mlP-选择素标准蛋白(rhP-selectin/Fc chimera)包板再予检测。以OD₄₉₀值大于阴性孔2倍以上者进行克隆化培养。

4、杂交瘤细胞的克隆化

采用有限稀释法进行克隆化。

1)克隆当天制备饲养细胞，接种96孔板内，100ul/孔(2×10⁴/孔)。

2)阳性细胞从培养板内轻轻冲洗下，计数。

3)用培养液连续稀释细胞悬液成10个细胞/ml接种加有饲养细胞的96孔板内，100ul/孔。

4)10天左右，杂交瘤细胞集落长至孔底25-50％左右时，开始测定上清中抗体活性。

5)测得有抗体活性的阳性细胞孔时，再克隆，共进行4次。

经上述重复进行ELISA筛选及亚克隆，最后筛选出1株能稳定分泌抗P-选择素Lectin-EGF单抗的杂交瘤细胞株，命名为人源单抗杂交瘤细胞株PsL-EGFmAb-2，该细胞株已于2006年10月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，获得保藏号为CCTCC NO：C200634。

实施例7杂交瘤细胞的染色体分析

采用秋水仙素法进行染色体分析，用以鉴定所筛选的细胞株。

1)加秋水仙素前24-48h将杂交瘤细胞株CCTCC NO：C200634传代。

2)在培养液中加入终浓度为0.02-0.05ug/ml的秋水仙素，继续培养2.5-3h，收集细胞，1000rpm离心10min，弃上清液。

3)加入已预温至37℃的0.075mol/L KCl溶液2ml，将细胞悬匀，37℃水浴15-20min。

4)于悬液中缓慢加入100ul新鲜配制的固定液(甲醇与冰醋酸3∶1混合)，混匀后室温静置15min，然后1000rpm离心10min，弃上清液。

5)加入固定液1ml，将细胞悬匀，室温静置15-20min，然后1000rpm离心10min，弃上清液。

6)重复操作一次，吸去上清液，根据细胞压积留下200-400ul固定液，将细胞悬匀后，吸取细胞悬液1-2滴，滴于刚从冰水中取出的载玻片，在火焰上过数次使细胞平铺于载玻片上，自然晾干。

7)用新鲜配制的10％Giemsa染液染色30min，自来水漂洗去除染液，自然晾干。

8)镜检：选择染色体分散好，无重叠，无失散的细胞进行观察分析。

经杂交瘤细胞染色体分析结果显示，染色体数目达90条左右且较集中，多数为端部着丝点染色体，还出现少数有中部或亚中部着丝点的标记染色体(如图5所示)。

实施例8单抗轻链类型的鉴定

采用间接ELISA法检测所筛选的杂交瘤细胞分泌的单抗轻链类型。

1)P选择素标准蛋白(rhP-selectin/Fc chimera)以每孔0.5ug包被酶标板，置4℃过夜。

2)封闭液37℃封闭1h，洗涤。

3)分κ链、λ链两组，每组设6个复孔，分别加入杂交瘤细胞株CCTCC NO：C200634上清液100ul。阴性对照两孔，分别加入封闭液和PBS100ul。阳性对照两孔，分别加入免疫血清100ul，37℃孵育1h，洗涤。

4)于κ链、λ链两组分别加入羊抗人κ链、λ链单抗(各6复孔)100ul，阴性对照和阳性对照孔均加入适当稀释的羊抗人IgM(μ链)抗体100ul，37℃孵育1h，洗涤。

5)每孔加入OPD显色液100ul，加样结束后，用封板膜封板，置37℃显色15-20min，加入50ul 2mol/L硫酸溶液终止显色，于酶标仪波长490nm处读取吸光值。

间接ELISA法结果显示，本研究筛选的杂交瘤细胞株分泌的单抗轻链为λ型(表1)。

表1  单抗轻链类型的鉴定结果

实施例9  人源抗体的鉴定

杂交瘤细胞株CCTCC NO：C200634抽提的mRNA进行逆转录后，根据GenBank中人IgM Fc段的mRNA序列设计引物，引物序列为：

上游5’-CAGTCCCCGGCAGATTCAG-3’

下游5’-CTTCGCCATTCTGGCGG-3’

以上述cDNA为模板进行PCR扩增，同时以人淋巴细胞为阳性对照，鼠(Balb/c鼠)淋巴细胞为阴性对照。对PCR产物进行测序，用以鉴定所筛选的单克隆抗体。

PCR结果显示，在人淋巴细胞和杂交瘤细胞株CCTCC NO：C200634中可扩增出人IgM Fc段，扩增片段长度为380bp，但在鼠淋巴细胞中不能扩增出同样的片段(如图6所示)。对杂交瘤细胞株CCTCC NO：C200634扩增的PCR产物进行纯化后，再经PE3700测序仪进行测序，测序结果与上述PCR结果相符，结果如图7所示。

实施例10  单抗特异性的检测

1、ELISA法

1)分别用GST-PsL-EGF、His-PsL-EGF、GST三种蛋白各5ug/ml包板，4℃过夜；

2)酶标板洗涤3次后拍干，每孔加入封闭液300ul，置37℃封闭1h；

3)酶标板洗涤3次后拍干，每孔加入杂交瘤细胞株CCTCC NO：C200634上清液或转基因小鼠的免疫血清(对照)100ul，37℃温孵1h；

4)酶标板洗涤3次后拍干，加入HRP标记的羊抗人IgM(μ链)抗体，100ul/孔，37℃温孵1h；

5)酶标板洗涤3次后拍干，加入OPD显色液100ul/孔，加样结束后，用封板膜封板，37℃显色15-20min，2mol/L硫酸50ul/孔终止显色，于酶标仪波长490nm处测定各孔的吸收值。

ELISA检测发现，转基因小鼠的免疫血清与His-PsL-EGF和GST蛋白均能发生作用(图8的A所示)；但杂交瘤细胞株CCTCC NO：C200634上清液仅与His-PsL-EGF蛋白发生作用，而与GST蛋白无反应，结果如图8的B所示。

2、Western blot

于His-PsL-EGF、GST蛋白溶液加入等体积2×SDS凝胶加样缓冲液，沸水中煮5min后上样行12％SDS-PAGE凝胶电泳。电泳结束后，用半干转移仪将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜。转移完毕后，用膜封闭液室温封闭2h，加入杂交瘤细胞株CCTCC NO：C200634上清液4℃过夜，次日膜洗涤液洗涤3次，每次15min，加入1∶2000稀释的HRP标记的抗人IgM(μ链)抗体室温反应2h，膜洗涤液洗涤3次，每次15min，在膜上滴加ECL液，经压片、显影、定影后洗片读取结果。

同法，将His-PsL-EGF、GST溶液上样，以适当稀释的转基因小鼠免疫血清(对照)作为一抗进行反应，压片读取结果。

Western-blot结果显示，转基因小鼠的免疫血清均能与His-PsL-EGF融合蛋白和GST蛋白反应，血清中存在抗PsL-EGF功能域和抗GST蛋白的抗体，也存在针对大肠杆菌中其他杂蛋白的抗体(图9的A所示)。杂交瘤细胞株CCTCC NO：C200634上清液仅能与His-PsL-EGF蛋白发生反应，而与GST蛋白无反应，表明本发明所获得的单克隆抗体能与PsL-EGF抗原特异结合，结果如图9的B所示。