用载肝细胞生长因子聚乳酸－O－羧甲基壳聚糖纳米粒子的肝细胞培养方法

技术领域：

本发明涉及一种肝细胞的培养方法。

背景技术：

急性肝衰竭死亡率高达70％。肝细胞移植可以起到一定的肝功能支 持和促进肝再生作用。由于其具有操作简单、对机体生理环境干扰小、 供体来源广泛等优点，已引起了众多研究者的广泛关注。然而，如何提 高移植肝细胞的活性、降低免疫排斥反应和促进受体肝再生是急需解决 的三大问题。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种可有效促进肝细胞生长、提高肝细胞活 力的用载肝细胞生长因子聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子的肝细胞培 养方法。

本发明的技术解决方案是：

一种用载肝细胞生长因子(HGF)聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒 子的肝细胞培养方法，其特征是：在肝细胞培养时，将载肝细胞生长因 子聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子与肝细胞混合进行接种培养。

所述载肝细胞生长因子聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子是通过下 列步骤制得：将载肝细胞生长因子加入到聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米 粒子悬浮溶液中，在4℃、800rpm电磁搅拌的条件下充分反应4小时， 然后10000rpm高速离心、蒸馏水洗涤、冷冻抽干，得到固化的载HGF 聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子。

肝细胞培养时，培养温度为35～38℃，且5％CO₂条件下培养，培养 12小时内，每30分钟振荡一次，每次持续5分钟。

肝细胞与载肝细胞生长因子聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子的用 量关系为：5×10⁵个/ml肝细胞与40μg/ml的载HGF聚乳酸-O-羧甲基壳 聚糖纳米粒子相混合接种。

本发明可有效促进肝细胞生长，提高肝细胞活力，必定对肝细胞培 养技术的发展起到巨大的推动作用。实验证明，与普通肝细胞培养相比 较，本发明培养的肝细胞形成球形聚集体的时间明显缩短，球形聚集体 的比例明显增加，细胞形态好，培养后第2天至第7天，采用CCK-8 体外细胞增殖试剂盒检测培养肝细胞的活力，发现载HGF纳米培养组 生成黄色甲臢染料的量高于普通培养组(P＜0.05)。表明载HGF纳米培 养组活细胞数目多于普通培养组，载HGF纳米粒子在体外能够持续地 促进大鼠肝细胞生长和活性的保持。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1是载肝细胞生长因子聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子透射电 镜照片。

图2是载肝细胞生长因子聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子扫描电 镜照片。

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

具体实施方式：

聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖(PLA-O-CMC)纳米粒子的制备：

将10ml浓度为0.03％的PLA(聚乳酸)二氯甲烷溶液与10ml浓度 为0.15％的O-CMC溶液在超声情况下充分反应(约25分钟左右)，待 其中的有机溶剂挥发完全后得到乳光较重的均匀悬浊液。将此悬浊液先 以2000rpm低速离心5分钟，取低速离心后所得的上清液以14000rpm 高速离心10分钟，得到部分白色沉淀，吸去部分上清液，将沉淀用蒸 馏水离心洗涤两次后，将沉淀冷冻抽干取出并行钴-60辐照消毒后备用。

载HGF的聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子的制备：

称取5mg PLA-O-CMC纳米粒子放入5ml去离子水中进行超声波分 散，制得纳米粒子悬浮溶液。取5μg HGF加入5ml PLA-O-CMC纳米粒 子悬浮溶液中，在4℃、800rpm电磁搅拌的条件下充分反应4小时，然 后10000rpm离心、蒸馏水洗涤、冷冻抽干，得到固化的载HGF的聚乳 酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子。

载HGF聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子的表征：

透射电子显微镜观察：取5mg固化的载HGF的PLA-O-CMC纳米 粒子放入5ml去离子水中进行超声波分散，制得纳米粒子悬浮溶液。然 后将少量悬浮溶液滴到已载膜的铜网上，用滤纸吸去多余的液体，晾干 后即制成样品，透射电子显微镜观察载HGF的PLA-O-CMC纳米粒子 的结构、粒径及表面形貌。

激光粒度仪/zeta电位仪测试：用激光粒度仪/zeta电位仪检测上述载 HGF的PLA-O-CMC纳米粒子悬浮溶液中载HGF纳米粒子的粒径和表 面电位。

载HGF的PLA-O-CMC纳米粒子载药率与包封率的测定：载药率 (drug loading，LD)是指微粒中药物的质量百分比，包封率(embedding ratio，ER)是指微粒中药物量与投入制备体系中的药物量的质量百分比。 分别通过以下公式计算载药率和包封率：载药率＝纳米粒子中HGF含量 /纳米粒子质量×100％，包封率＝纳米粒子中HGF含量/HGF投入量 ×100％。采用改良超声乳化法制得的载HGF的PLA-O-CMC纳米粒子 具有较为光滑的表面形貌和相对均一的粒径分布，其平均粒径为 139.82nm，粒径分布指数为0.108，粒子的表面电位为32.8eV，载药率 为0.12665％，包封率为76.32％。具有较为明显的核-壳结构存在，微粒 表面有较为均匀的高聚物包裹，粒子的表面电位为32.8eV。这表明该纳 米粒子表面有较强的正电荷，便于载HGF纳米粒子和带负电荷的肝细 胞相接触实现药物的靶向治疗。

称取一系列载HGF纳米粒子，每份1mg，分别装入离心管中，加 入1ml pH 7.4的PBS溶液；将离心管放在37℃的水浴恒温振荡器内(频 率60rpm)，并计时，间隔一段时间取出一个离心管离心沉淀(14000rpm) 载HGF纳米粒子，将上清液和沉淀分别收集。用ELLISA法检测上清 液中HGF的含量，并用酸度计测定释放液的pH值，用冷冻抽干机冷冻 干燥释放后的纳米粒子并精确称重。重复试验3次，取平均值，绘制载 HGF微粒释放曲线。

通过动态观察载HGF纳米粒子体外降解过程发现初制的载HGF纳 米粒子呈球形，具有光滑的表面形貌和相对均一的粒径，且具有明显的 核-壳结构存在，表面有一层高聚物包裹。经过15天的释放和降解，粒 子表面皱缩变形、体积变大、部分粒子崩塌失去球状外形。45天后，载 HGF纳米粒子进一步释放和降解，大多数粒子降解为絮状物质，少部分 粒子仍有核-壳结构。随着纳米粒子的不断降解，将出现质量损失，主 要发生本体降解。对纳米粒子在体外的释药行为研究发现：载HGF纳 米粒子前24小时的降解可以分为高速释药，中速释药，低速释药3个 阶段，前24小时的释药动力学方程为Q＝148.4266+189.0493 t^1/2(R＝0.97589)，符合Huguchi方程。载HGF纳米粒子在前30天内的的 释药行为可以分为早期药物突释阶段，后期稳定释放阶段。释放动力学 方程Q＝1086.28966+58.23938t(R＝0.99716)，符合零级释放方程。

大鼠肝细胞的分离和培养：

采用Seglen原位两步灌流法分离大鼠肝细胞。将分离所得肝细胞进 行培养将肝细胞以5×10⁵个/ml与40μg/ml的载HGF聚乳酸-O-羧甲基壳 聚糖纳米粒子相混合接种到培养板上(1ml/孔)，置于37℃，5％CO₂条 件下静置培养，培养12小时内，每30分钟振荡一次，每次持续5分钟， 以促进载纳米粒子与肝细胞的结合且有利于细胞集聚形成球形体。培养 12小时后，细胞与载HGF纳米粒子紧密结合。培养48小时后，形成细 胞粘附聚集的球形体，提高了细胞密度。培养24小时，大部分细胞仍 保持圆球状，部分肝细胞向多边形转变，多数肝细胞相互粘连，成束状 生长。约培养48小时后，大部分肝细胞重建细胞极性，呈现较典型、 均匀的多边形形态特征。

为了更好地分析本发明的效果，同时建立了普通培养组对肝细胞进 行培养：将肝细胞以5×10⁵个/ml的浓度接种到培养板上(1ml/孔)，置 于37℃，浓度为5％的CO₂条件下静置培养，培养12小时内，每30分 钟振荡一次，每次持续5分钟，以利于细胞集聚形成球形体。

普通培养的肝细胞，接种后很快沉于培养板底并贴壁生长，其形态 立即由刚分离的圆球形向单层扁平多边形伸展，48～72小时后细胞进一 步变薄，渐失去多边形特征，肝细胞连接成片生长。

培养肝细胞活力检测：采用CCK-8体外细胞增殖检测试剂盒检测 培养肝细胞活力。CCK-8所含的WST-8在电子载体作用下，能被活细 胞线粒体中的脱氢酶还原成具有高度水溶性的黄色甲臢染料 (Formazen)，生成的甲臢染料的量与活细胞数目成正比。下面表中将 用本发明方法的培养组称为“载HGF纳米粒子培养组”，与普通培养组 作比较。

表1CCK-8法比较两组培养肝细胞的活力(mean±SD)

经统计学处理，培养一天两组细胞活力无较大差异(P＞0.05)，这 可能与肝细胞分离培养后第一天正处于潜伏期有关。培养2～7天，载 HGF纳米粒子组细胞活力明显高于普通培养组(P＜0.05)，说明载HGF 纳米粒子对体外培养大鼠肝细胞的增殖有明显的持续的促进作用。

通过研究载HGF聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子对体外培养大鼠 肝细胞发现，该载HGF纳米粒子在体外能够持续地促进大鼠肝细胞生 长。