人乙酰肝素酶的小分子多肽抑制剂

具体实施方式

实施例1：人乙酰肝素酶8kD小亚基的克隆与表达

一.构建表达载体：

应用PCR方法(引物P1：GGAATTCCATATGCAGGACGTCGTGGACCT(引入Ned I酶切位点)(SEQ ID No.21)和P2：CCGCTCGAGTTCCTTCTTGGGATCG(引入Xho I酶切位点)(SEQ IDNo.22)。

反应体系：

2×GC Buffer I    25μl

TaKaRa LA Taq     0.5μ1

dNTP Mixture      8μl

模板              1μl

上游引物          1.5μl

下游引物          1.5μl

灭菌水补充体积至  50μl

反应条件：94℃预变5min，然后进行30个循环，94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min，最后72℃延伸10min)从含有HPA 8kD的质粒(含pGEX-HPA8kD质粒的BL21(DE3)工程菌株由本室构建保存，其中pGEX-2PK载体为GE Healthcare公司产品，pGEX-HPA 8kD质粒见李燕杰；李吉学；凌焱；汤国营；宋子博；林艳丽；朱厚础；肿瘤转移关键酶：人乙酰肝素酶氨基端亚基的表达纯化及鉴定，军事医学科学院院刊，Bulletin of The Academy of Military(Medical Sciences)，2005年6月29卷03期：PP236-240)中扩增人HPA小亚基目的基因，然后经酶切、连接构建人HPA小亚基表达载体pET24a(+)-HPA(8kD)质粒(pET24a(+)为Novagen公司产品)(图1)。

二.转化诱导表达：

转化本室保存的大肠杆菌RosettaTM感受态(Novagen公司产品)，菌种按1％接种到Kan+-LB中，37℃、200rpm培养至OD₆₀₀在0.8左右，加入终浓度1mM IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷酶，赛百盛公司产品)诱导，37℃200rpm继续培养4小时，经SDS-PAGE分析，目的蛋白成功表达(图2)。

三.目的蛋白的纯化：

4℃，10000rpm离心15min，收集菌体，-20℃反复冻融后用PBS重悬后冰浴超声破碎10min，离心(条件同上)，SDS-PAGE分析，人HPA小亚基以包涵体形式存在(图3)。沉淀用3M尿素-PBS重悬，离心(条件同上)，弃上清，沉淀用8M尿素-PBS溶解，离心(条件同上)，收集上清液。将上清液上样于Histrap FF金属螯合层析柱(Amersham Biosciences公司产品)，纯化(条件：按照HisTrap FF金属螯合层析柱说明书操作。具体过程如下：

(1)5倍柱床体积的EDTA-2Na

(2)5倍柱床体积的8M脲-PB缓冲液

(3)5倍柱床体积的ddH₂O

(4)3倍柱床体积的NiSO₄溶液

(5)5倍柱床体积的ddH₂O

(6)3倍柱床体积的平衡缓冲液

(7)上样

(8)5倍柱床体积的平衡缓冲液

(9)洗脱缓冲液进行洗脱

(10)收集洗脱液

得到电泳纯的人HPA小亚基蛋白(图4)。将纯化的高浓度与低浓度目的蛋白分别加入终浓度为10mM的DTT(二硫苏糖醇，Amresco公司产品)，分别对6M脲-0.1MNaHCO3-0.75M NaCl(1mM GSSG-0.1mM GSH)(GSH(谷胱甘肽还原型)、GSSG(谷胱甘肽氧化型))均为罗氏公司产品)、4M脲-0.1M NaHCO₃-0.5M NaCl(1mM GSSG-0.1M GSH)、2M脲-0.1M NaHCO3(1mM GSSG-0.1mM GSH)、1M脲-0.1M NaHCO3(1mMGSSG-0.1mM GSH)、0.5M脲-0.1M NaHCO3(1mM GSSG-0.1mM GSH)充分透析复性，透析过程中，均4℃不断搅拌，每种尿素浓度均透析7h以上；最后更换三次0.1M NaHCO3(pH 8.6)，均4℃不断搅拌12h；透析结束，将样品4℃离心(12000rpm，15min)，取上清，沉淀用等体积8M脲-0.1M NaHCO3(pH 8.6)重悬，SDS-PAGE分析复性效果(图5)，复性后的蛋白可溶性良好。

通过薄层凝胶扫描分析，复性后的人HPA小亚基蛋白纯度达到98％以上(图6)。Folin-酚法测蛋白浓度，目的蛋白浓度达1.9mg/mL。复性后目的蛋白浓度和纯度均可以用作靶蛋白进行后续的噬菌体库筛选工作。

实施例2：人HPA小亚基抑制剂的筛选

一.在得到纯度和浓度均符合要求的人HPA小亚基的基础上，以人HPA小亚基为靶分子筛选噬菌体展示随机环七肽库(New England Biolabs公司试剂盒产品)，经五轮筛选，回收率约增加了10³倍。从最后一轮筛选的平板上，随机挑取150个噬菌斑于对数生长期的ER2738培养物(New England Biolabs公司试剂盒产品)中，37℃剧烈振荡培养4.5h后4℃离心取上清，保存噬菌体原种，再分别制备150个相应的单克隆样品，ELISA检测挑选阳性克隆，提取噬菌体单链DNA，送出测序。根据DNA测序结果，推断出相应的结合肽氨基酸序列，共得到了10种人HPA小亚基结合肽(图7)。

二.通过ELISA方法得到10种与人HPA小亚基结合力很强的噬菌体

1.包被：用浓度为100μg/mL的HPA小亚基(溶于0.1M的NaHCO₃，pH 8.6)包被酶联板，100μL/孔，同时每个待鉴定克隆均包被一个对应的包被液(0.1MNaHCO₃，pH 8.6)孔作为阴性对照，设包被靶分子不加噬菌体单克隆样品为空白对照，另外设ER2738培养上清为无关阴性对照。4℃密封湿盒中过夜。

2.洗涤：甩出多余靶分子溶液，用TBST洗6次，每次间隔3min，每次均将酶联板倒置在纸巾上拍甩除去残液。

3.封闭：各孔加满封闭液，4℃湿盒内封闭1-2h。

4.洗涤：方法同步骤5。

5.加样：根据单克隆样品滴度测定结果，分别将每个样品用TBST稀释为1×10⁷pfu/μL，向每个样品加样100μL/孔。室温振荡孵育2h。

6.洗涤：方法同步骤5。

7.加二抗：用封闭液按1∶5,000的比例稀释HRP标记的抗-M13单克隆抗体。每孔加入100μL稀释后的抗体，室温振荡孵育1h。

8.洗涤：方法同步骤5。

9.加显色底物：每孔加100μL TMB底物溶液，室温避光作用30min左右。

10.加终止液：每孔加50μL 2mol/L的硫酸溶液终止显色反应。

11.测A₄₅₀：在450nm波长处测A₄₅₀。以A值高于阴性对照2.1倍以上者定为阳性克隆。检测得到10种与人HPA小亚基结合力很强的噬菌体(图8)，其中C7-1是多轮筛选获得的一致氨基酸序列。

委托西安蓝晶生物科技有限公司化学合成C7-1和C7-5两条氨基酸序列，纯度均为95％以上，其环化前后的质谱和纯化图谱分别见图9和图10。

实施例3：采用HepG-2细胞体外重组基底膜侵袭实验检测C7-1和C7-5的活性

一.方法

1.用胰酶(Amresco公司产品)消化对数生长期HepG-2细胞(军事医学科学院生物工程研究所巩新老师惠赠)，加含血清的培养基，离心，弃去培养液，PBS洗1遍，用含0.1％BSA-无血清DMEM培养基(HyClone公司产品)重悬，调整HepG-2细胞终浓度为1×10⁶/mL。向24孔板(下室)中加入10％FBS-DMEM培养基，600μL/孔；用无菌镊子将铺好Matrigel胶的细胞培养池转入24孔板(下室)中。

2.取HepG-2细胞悬液160μL加入细胞培养池；分别加入不同浓度的C7-1和0.25mg/mL C7-5，加入等体积的0.1％BSA-无血清DMEM培养基为空白对照，置于37℃、5％CO2、饱和湿度孵箱内培养23h，培养结束后，先用无菌干棉签擦去基质胶和微孔滤膜上室面细胞，再用无菌PBS湿润的棉签小心擦两次。向24孔板中加入5mg/mL MTT磷酸盐储存液(Amresco公司产品)100μL，将小池置于其中，使膜浸没在培养基中，37℃，5％CO₂饱和湿度培养箱中培养5h后，向24孔板中加入400μL20％SDS-0.01N HCl，37℃，5％ CO₂饱和湿度培养箱中放置过夜后取出，在微量振荡器上振荡混匀后，从每个孔中取出结晶物溶解液200μL于96孔板中。在570nm处读数，设与试验孔平行不加细胞只加培养液的孔调0。计算侵袭抑制率。

3.侵袭抑制率[％]＝[(对照孔OD₅₇₀-给药孔OD₅₇₀)/对照孔OD570]×100％

二.结果

C7-1通过抑制HepG-2细胞降解重组基底膜，抑制了HepG-2细胞的体外侵袭(图11)。侵袭抑制率为57.1％。

C7-5的实验结果与不加药的空白对照孔没有明显差异，说明C7-5不能抑制HepG-2细胞的体外侵袭。

序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所

<120>人乙酰肝素酶的小分子多肽抑制剂

<130>

<160>22

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>7

<212>PRT

<213>人工合成

<400>1

Lys His Thr His His Lys His

1              5

<210>2

<211>7

<212>PRT

<213>人工合成

<400>2

Lys His Ile His Lys His Tyr

1              5

<210>3

<211>7

<212>PRT

<213>人工合成

<400>3

Asn His Thr His His Lys His

1              5

<210>4

<211>7

<212>PRT

<213>人工合成

<400>4

Pro Gln Asp Pro Arg Leu Met

1              5

<210>5

<211>7

<212>PRT

<213>人工合成

<400>5

Gln Arg Met Asn Pro Asp Ser

1              5

<210>6

<211>7

<212>PRT

<213>人工合成

<400>6

Lys His Val Thr Ala His Glu

1              5

<210>7

<211>7

<212>PRT

<213>人工合成

<400>7

Ser His His His Trp Arg Lys

1              5

<210>8

<211>7

<212>PRT

<213>人工合成

<400>8

His Lys His Thr Ser Thr Leu

1              5

<210>9

<211>7

<212>PRT

<213>人工合成

<400>9

His Phe Thr Pro Gln Asn Pro

1              5

<210>10

<211>7

<212>PRT

<213>人工合成

<400>10

Pro Gly Thr Pro Arg Met Ala

1              5

<210>11

<211>21

<212>DNA

<213>人属，人种

<400>11

aagcatactc atcataagca t    21

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>人属，人种

<400>12

aagcatattc ataagcatta t    21

<210>13

<211>21

<212>DNA

<213>人属，人种

<400>13

aaccatactc atcataagca t    21

<210>14

<211>21

<212>DNA

<213>人属，人种

<400>14

ccgcaggatc ctcggctgat g    21

<210>15

<211>21

<212>DNA

<213>人属，人种

<400>15

cagcgtatga atccggatag t    21

<210>16

<211>21

<212>DNA

<213>人属，人种

<400>16

aagcatgtta ctgcgcatga g    21

<210>17

<211>21

<212>DNA

<213>人属，人种

<400>17

tcgcatcatc attggcggaa g    21

<210>18

<211>21

<212>DNA

<213>人属，人种

<400>18

cataagcata cgtcgacttt g    21

<210>19

<211>21

<212>DNA

<213>人属，人种

<400>19

cattttacgc ctcagaatcc g             21

<210>20

<211>21

<212>DNA

<213>人属，人种

<400>20

cctgggactc ctcgtatggc g             21

<210>21

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成

<400>21

ggaattccat atgcaggacg tcgtggacct    30

<210>22

<211>25

<212>DNA

<213>人工合成

<400>22

ccgctcgagt tccttcttgg gatcg         25