法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2012-01-11
授权
授权
2009-04-22
实质审查的生效
实质审查的生效
2009-02-25
公开
公开
技术领域
本发明涉及细胞培养、组织工程领域，更具体地说是涉及一种能够对组织培养物加载拉压力学载荷，并且具有灌注和使组织培养物旋转功能的组织工程反应器。
背景技术
组织工程，是指用工程学和生命科学相结合的原理和方法，来制备组织和器官替代物，以恢复、维持或改善人体组织、器官的功能，是一个发展迅速、意义深远的生物医学工程应用领域，是生物医学工程中的一个新的分支，组织工程技术的出现和发展为先天性疾病和获得性疾病的治疗创造了前所未有的机会。
组织工程生物反应器是组织工程模型系统的重要组成部分，它能够模拟体内调控组织发育和维持的一些生物化学和物理信号，提供营养、通气、应力等多种可控的体外培养条件，为细胞-支架复合物构建发育成为功能组织提供适宜的体外环境。组织工程生物反应器已经成为研究和培养血管、心肌、软骨、骨等组织的重要手段。因此模拟细胞组织生长的体内生理条件下的力学、生化等环境，通过研究体外环境下力学、生化因素如何影响细胞的三维培养和功能化，研究组织工程生物反应器如何改进细胞的接种、传质、力学环境、以及组织工程的工业化生产，有针对性地研发更先进的组织工程用生物反应器对于组织工程的发展具有重大意义。
目前，组织工程用生物反应器的研究内容主要包括：
1.实现和控制细胞在支架中的均匀、高密度接种：近年的研究发现直接灌注式生物反应器在细胞接种密度和均匀性方面优于静态、旋转搅拌式等非直接灌注式生物反应器，这一技术已应用于心肌细胞、血管组织和肝细胞组织工程
2.改善传质状况：壁面旋转式生物反应器通过动态旋转层流流动为细胞提供了一定的低剪切应力，较好地改善了传质状况，培养效果优于旋转-搅拌式生物反应器；壁面旋转式生物反应器的灌注率、对细胞施加的切应力大小、细胞营养物和代谢物传质的平衡等问题都会对培养效果产生影响，因此需要针对特定的组织控制、调节灌注率等参数，以获得优化的传质效果。
3.在组织工程化培养中施加适当的机械力，控制工程化组织构建：大量的研究表明周期性机械伸张可促进心肌细胞的的增殖和骨架构建，提高体外培养的骨骼肌细胞组织力学特性，提高种植在聚合物支架材料上的平滑肌细胞构建的组织机构性能和弹性蛋白的表达；动态压缩或剪切应力有助于软骨细胞GAG的合成和软骨组织力学特性的增强；对组织工程化培养过程中施加力学载荷，不仅能够促进工程化组织的构建，而且能够直接促进细胞在特定的生长期向多功能分化。因此，在组织工程化培养过程中施加力学载荷，能够直接促进细胞在特定的生长期向多功能分化，促进工程化组织的构建。
Powell，Courtney A.等设计了一种能够用于骨骼肌组织培养的生物反应器，将骨骼肌组织支架一段固定，一段与步进电机相连，通过步进电机提供恒定或周期性拉压应力，支架所受的拉应力通过拉力传感器检测，组织培养腔不能旋转(Mechanical stimulat ionimproves tissue-engineered humanskeletal muscle，Am J Physiol Cell Physiol，2002；282(5)：1557-1565)。
Bancroft，Gregory N.等用蠕动泵对骨支架进行灌注培养的反应器，发现与静态培养相比灌注培养提高了培养物的钙含量，培养同时没有加载拉压和扭转等力学载荷(Technical Note：Design of a Flow Perfusion BioreactorSystem for Bone Tissue-Engineering Applications，Tissue Engineering，2003；9(3)：549-554)。
Breen，Liam T.等设计了能够对单层细胞单独或同时提供剪切和拉压应力的组织工程反应器。通过步进电机与锥盘流变计相连对细胞施加剪切应力，通过步进电机与弹性硅胶底盘的相连对细胞施加拉压应力，组织培养腔不能旋转(Development of a novel bioreactor to apply shear stress and tensilestrains imultaneously to cell monolayers，Review of ScientificInstruments，2006；77(10)：104301-9)。
Satish，C.Muluk等设计了一种能够用拉压电机加载拉压应力和用微步进电机加载扭转应力的血管反应器，通过程控阀门提供脉动流，采用血管内灌注的方式，无壁面旋转(Enhancement of tissue factor expression by veinsegments exposed to coronary arterial hemodynamics.Journal of vascularsurgery：official publication，the Society for Vascular Surgery[and]International Society for Cardiovascular Surgery，North AmericanChapter 1998；27(3)：521-527)。
Bursac，Nenad等将心肌细胞及支架放在外壁旋转的反应器内悬浮培养，提高了心肌细胞的电生理和分子生物学性能，培养过程中没有施加拉压等力学载荷(Cultivation in Rotating Bioreactors Promotes Maintenance ofCardiac Myocyte Electrophysiology and Molecular Properties，TissueEngineering，2003；9(6)：1243-1253)。
综上所述，现有的组织工程反应器存在较大的缺陷：一是无法为组织同时提供近似生理状态的周期性轴向拉伸、压缩、径向牵张、扭曲等机械力载荷；二是多数采用无壁面旋转的方式，在细胞均匀、高密度接种和传质方面还有待改进。因此，迫切需要研制能够同时加载组织培养所需的多种力学环境，有利于细胞均匀、高密度接种，有利于传质，具有良好的可调控性的生物反应器。
发明内容
本发明针对组织生长的体内力学环境，提供了一种具有组织培养物拉压和旋转功能的组织工程反应器，该反应器具有良好的传质性能，能够为组织培养提供近良好的传质。
根据本发明的一个方面，提供了一种具有组织培养物拉压和旋转功能的组织工程反应器，其包括：一个组织培养腔；一个培养液灌注回路，它穿过所述培养腔；设置在所述组织培养腔内的第一保持装置和第二保持装置，用于在它们之间以可拆卸方式连接并固定待培养的组织培养物；一个组织培养物拉压驱动装置，它与所述第一保持装置耦合，用于驱动所述第一保持装置作往复运动从而对所述组织培养物进行拉压作用；一个组织培养物旋转驱动装置，它与所述第一保持装置和第二保持装置相耦合，用于驱动设置于所述第一保持装置和第二保持装置之间的所述组织培养物转动。其中，所述保持装置的一种实现方式可以是夹具。
作为一个具体但非限定的实施例，所述的具有组织培养物拉压和旋转功能的组织工程反应器中，所述组织培养物拉压驱动装置通过一根拉压传动拉杆与所述第一保持装置相耦合，以带动所述第一保持装置沿着轴向往复运动，所述第二保持装置通过一根固定拉杆轴向固定在一固定支架上。
作为一个具体但非限定的实施例，所述的具有组织培养物拉压和旋转功能的组织工程反应器中，所述组织培养腔的两端设置有密封塞，所述拉压传动拉杆穿过所述密封塞而与所述第一保持装置耦合，所述拉压传动拉杆与所述密封塞之间为可滑动、可转动的耦合，所述固定拉杆穿过所述密封塞而与所述第二保持装置耦合，所述固定拉杆与所述密封塞之间为可转动的耦合。
作为一个具体但非限定的实施例，所述的具有组织培养物拉压和旋转功能的组织工程反应器中，所述组织培养物旋转驱动装置包括：第一转动传动装置和第二转动传动装置，所述两转动传动装置与动力源的同一输出轴相耦合而进行同步转动；所述第一转动传动装置与所述拉压传动拉杆相耦合，所述第二转动传动装置与所述固定拉杆相耦合，因而所述两转动传动装置的转动分别驱动了所述拉压传动拉杆和所述固定拉杆进行同步转动，因而使设置在所述拉压传动拉杆和所述固定拉杆之间的组织培养物的两端同步转动。
作为一个具体但非限定的实施例，所述的具有组织培养物拉压和旋转功能的组织工程反应器中，所述拉压传动拉杆和所述第一转动传动装置中与其直接耦合的部件是沿着轴向是相互固定的，而以所述第一转动传动装置中的部件之间的轴向滑动啮合来吸收所述拉压传动拉杆的往复轴向移动。
作为一个具体但非限定的实施例，所述的具有组织培养物拉压和旋转功能的组织工程反应器中，所述拉压传动拉杆和所述第一转动传动装置中与其直接耦合的部件沿着轴向是可相互滑动的，而用一个固定装置来使该部件沿轴向固定。
作为一个具体但非限定的实施例，所述的具有组织培养物拉压和旋转功能的组织工程反应器中，所述第一转动传动装置和第二转动传动装置分别采用齿轮组、链条传动装置、皮带传动装置或传动杆之一。
作为一个具体但非限定的实施例，所述的具有组织培养物拉压和旋转功能的组织工程反应器还包括：设置在所述组织培养腔上游进口处的进口压力传感器，用于检测所述灌注回路中组织培养腔的进口处的压强；设置在所述组织培养腔下游出口处的出口压力传感器，用于检测所述灌注回路中组织培养腔的出口处的压强；位移传感器，用于检测所述拉压传动拉杆发生的位移；拉压传感器，用于检测作用在所述组织培养物上的拉力或压力；信号处理电路，用于处理由上述传感器所检测到的信号。
作为具体但非限定的实施方式，组织培养腔的材质为能够耐受高温消毒的、没有生物毒性的玻璃、不锈钢、塑料、聚碳酸酯，形状为圆柱体或对称的多面体，长度为例如5-30cm，容量为例如20-500ml；组织培养腔通过密封垫和螺栓保持培养腔体密闭，密封垫和螺栓的材质为可耐受高温消毒的有机、无机材料。
作为具体但非限定的实施例，本发明的组织工程反应器用于骨、肌肉、软骨、韧带等工程化组织的培养，包括由胶原、蚕丝纤维、羊毛纤维、羟基磷灰石等天然材料构成的和\或由PLGA、PLA、PLG、海藻酸钠、聚四氟乙烯等高聚物构成的支架材料，支架材料可以是圆柱状、片状、支架直径\厚度在例如1-12mm之间，支架长度在例如5-30cm之间，支架材料上的细胞包括骨细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞和心肌细胞。
作为具体但非限定的实施例，本发明的组织工程反应器的整个灌注管路通过放入动物细胞培养箱维持37℃，5-15％CO2，95％相对湿度的培养条件。
本发明的组织工程反应器，与现有反应器相比有如下有益效果：
1、本发明的反应器系统安装、拆卸方便；整个反应器、包括灌注通道管路和接头可拆卸、可消毒，示例性的消毒条件为例如：130℃，3个大气压，时间1小时。
2、本发明的组织工程反应器的具体但非限定的实施例，克服了常用的组织工程反应器无法为组织同时提供近似生理状态的周期性轴向拉压、压缩等机械力载荷的缺点，能够在培养的同时在组织培养物上同时或单独加载类似于生理状态下组织受到的周期性轴向拉压等力学载荷，上述力学载荷具有良好的可调控性；
3、在本发明的组织工程反应器的一个作为但非限定的实施例中，在培养腔灌注的同时，组织培养物能够以可调控的方向和转速旋转，从而实现与灌注液体更加充分地接触，使反应器具有良好的传质性能；
4、本发明的组织工程反应器的一种具体但非限定的实施例，既可用于培养骨、软骨、肌肉、韧带等工程化组织，也可用作研究所述组织的生物学和力学性能的仪器，具有较大的推广应用前景和较大的潜在社会经济效益。
附图说明
图1是本发明的组织工程反应器的一个示例性实施方式的结构示意图；
图2显示了图1的实施方式的一种变形。
具体实施方式 下文提供了实施方式进一步说明本发明，但本发明不仅限于以下实施方式。在附图中，相同的标号表示相同或对应的部分，且为简洁起见，在以下的说明中对这些相同或对应的部分不作重复的描述。
如图1所示的，是根据本发明的一个具体但非限定的实施方式的组织工程反应器，现在描述该反应器的细节。
储液瓶101通过管路与液体驱动装置102相连。液体驱动装置102可以采用蠕动泵，也可以采用直线电机或其他适当的装置，其不同的具体构成会使其具有相应的功能和/或产生相应的效果。
在本发明的一个具体但非限定的实施方式中，液体驱动装置102采用蠕动泵，其为灌注回路提供定常流。
在另一个具体但非限定的实施方式中，液体驱动装置102为一种直线电机，其为灌注回路提供脉动流。
组织培养腔进口管路107的下游端穿过上游密封塞106而进入到组织培养腔103中，上游端与液体驱动装置102通过管路相连。组织培养腔出口管路115的上游端置于培养腔103内，下游端穿过组织培养腔下游密封塞106伸出到培养腔103之外，而与连接到储液瓶101的管路相连，从而形成一个完整的灌注液体回路。
上、下游密封塞106可以提供培养腔103与进、出培养腔103的进口管路107和出口管路115之间的密封，从而实现培养腔103对外界的密封。
培养腔103优选地是由材料(如玻璃、塑料、不锈钢、聚碳酸酯)制成，用于为待培养的组织109提供无菌的密闭环境。在组织培养操作过程中，培养腔103内完全充满液体。
待培养的组织培养物109的一端由包括一个夹具的第二保持装置108所固定，而第二保持装置108被设置在固定拉杆104的一端上；组织培养物109的另一端则由包括一个夹具的第一保持装置108所固定，而第一保持装置108被设置在由拉压电机114驱动的拉压电机驱动杆111的一端上。固定拉杆104穿过上游密封塞106，且其另一端固定在支架105上；拉压电机驱动杆111穿过下游密封塞106，且其另一端与拉压电机114连接。
图1所示的实施方式中，还包括组织培养腔上游支架105，用于固定和/或保持培养腔。
在图1所示的实施方式中，拉压电机驱动杆111与组织培养腔下游的密封塞106之间的结合是可滑动的，拉压电机驱动杆111的往复拉压驱动作用在组织培养腔下游的夹具108上，从而驱动组织培养腔下游的夹具108沿着轴向作往复运动，从而实现对培养中的组织培养物109的往复拉压。
应当理解的是，拉压电机114不是实现组织培养物109的往复运动发生装置的唯一实施方式，它可以被其他形式的装置所替代，如曲柄-连杆机构、液压缸等。这些变形实施方式都属于本发明的范围。
应该注意的是，拉压机构的设置，对于组织培养腔的上游和下游的夹具来说是对等的，即，拉压电机114的拉压驱动，既可以如图1所示地那样耦合到组织培养腔的下游的夹具108上，也可以耦合到组织培养腔的上游的夹具108上，也可以耦合到上游的夹具108和下游的夹具108上。这些替换方式，都属于本发明的范围。
如图1所示的非限定的具体实施方式进一步包括了实现组织培养物的独立转动的部分：一个组织培养物转动驱动电机203，电机203的转动轴204与齿轮组201和齿轮组202相耦合，以驱动齿轮组201和202作同步转动。齿轮组201还与培养腔上游的固定拉杆104相耦合，而齿轮组202还与培养腔下游拉压电机驱动杆111相耦合，因而齿轮组201和202的转动分别驱动了培养腔上游的固定拉杆104和培养腔下游拉压电机驱动杆111的转动，且由于齿轮组201和202的转动是同步的，在它们的带动下，培养腔上游的固定拉杆104和培养腔下游拉压电机驱动杆111的转动也是彼此同步的，因而设置在培养腔上游的固定拉杆104和培养腔下游拉压电机驱动杆111之间的待培养组织109两端的转动是同步的，待培养组织109不会发生扭转。
作为一种具体实施方式，培养腔103不与任何固定装置相连，从而使培养腔103在培养腔上游的固定拉杆104和培养腔下游拉压电机驱动杆111以及它们之间的待培养组织培养物109转动时也随着转动。上、下游密封塞106实现培养腔103对外界的密封。
作为另一种具体实施方式，可以用诸如支架的固定装置(未显示)固定住培养腔103，从而使培养腔103在培养腔上游的固定拉杆104和培养腔下游拉压电机驱动杆111以及它们之间的待培养组织培养物109转动时保持静止。
在此，齿轮组202包容与其转动耦合的培养腔下游拉压电机驱动杆111的往复轴向移动的方式可以有多种。
其一是，培养腔下游拉压电机驱动杆111和齿轮组202中与其直接耦合的齿轮是沿着轴向是相互固定的，而以齿轮组202的齿轮之间的轴向滑动啮合来吸收培养腔下游拉压电机驱动杆111的往复轴向移动。为此，一种可选方案是，齿轮组202中发生滑动啮合的两个齿轮之一的厚度明显大于另一个，从而避免了由于齿轮之间的滑动而造成啮合脱离的可能性。
其二是，培养腔下游拉压电机驱动杆111和下游传动齿轮组202中与其直接耦合的齿轮沿着轴向是可相互滑动的，而用一个支架(未显示)来使该齿轮沿轴向固定。
应该理解的是，上述的齿轮组201、202，只是实现相应的转动传递的转动传动装置的例子；也可以用其他的传动装置来代替齿轮组201和/或202，这些其他的传动装置可以是诸如链条传动装置、皮带传动装置、传动杆等等。
借助图1所示的实施方式，可以同时或单独地实现：培养中的组织培养物的旋转、培养腔的培养液灌注、组织培养物的拉压，以及这些功能/效果的任何组合。
图2显示了图1所示的实施方式的一种变形。与图1所示的实施方式相比，图2所示的实施方式进一步包括一个用于采集、处理、显示和/或记录数据的部分。如图2所示，该用于采集、处理、显示和/或记录数据的部分的一个具体但非限定性的实施方式包括：设在培养腔进口处的压力传感器302，用于检测灌注管路中培养腔103的进口处的压强；设在培养腔出口处的压力传感器304，用于检测灌注管路中动态培养腔103的出口处的压强；可选的拉压传感器301，用于检测该具体实施方式下作用在组织培养物109上的拉力或压力；位移传感器303，用于检测该实施方式下拉压电机驱动杆111发生的位移。集线器305；小信号放大器306；驱动器307；处理器308，它可以是一个PC机或工控机；显示器309。传感器301、302、303和304的输出被送到集线器305并被其后的部分所处理、记录、和/或显示。
应当注意的是，虽然在上文中分别提到了拉压驱动装置、扭转驱动装置、旋转驱动装置等，但这些装置并不一定是相互完全独立的装置，相反，它们可以具有共同的部分，例如它们可以由同一个电机驱动。
实施例1内旋转拉压灌注
1.按照图1所示连接组织培养腔灌注回路，其中液体驱动装置为蠕动泵(Cole-Parmer公司，Masterflex系列)；
2.对反应器进行消毒，消毒条件为：130℃，3个大气压，时间1小时；
3.在无菌状态下将待培养的骨组织培养物安装到组织培养腔中的夹具上，其中骨组织培养物直径4mm，长度为5cm，支架材料为羟基磷灰石；
4.按照图1所示连接组织培养物旋转装置，其中组织培养物旋转电机选用海顿57000系列步进电机；
5.按照图1所示连接骨组织拉压装置，其中骨组织拉压电机选用海顿57000系列直线步进电机；
6.按照培养要求配制培养基，将无菌培养基注入储液瓶；
7.打开各设备的电源预热；
8.设定灌注流量为1.0ml/s；
9.设定组织培养物旋转电机的转向和转速：顺时针旋转，10rpm；
10.设定骨组织受的周期性拉、压应力为15N，拉压频率为5次/min；
11.运行反应器；
实施例2内旋转拉压灌注带控制系统
1.按照图2所示连接组织培养腔灌注回路，其中液体驱动装置为蠕动泵(Cole-Parmer公司，Masterflex系列)；
2.对反应器进行消毒，消毒条件为：130℃，3个大气压，时间1小时；
3.在无菌状态下将待培养的骨组织培养物安装到组织培养腔中的夹具上，其中骨组织培养物直径4mm，长度为5cm，支架材料为羟基磷灰石；
4.按照图2所示连接组织培养物旋转装置，其中组织培养物旋转电机选用海顿57000系列步进电机；
5.按照图2所示连接组织培养腔进出口的压力传感器，和信号检测装置；
6.按照图2所示连接骨组织拉压装置，其中骨组织拉压电机选用海顿57000系列直线步进电机；
7.按照图2所示连接组织拉压的拉压传感器和位移传感器；
8.按照培养要求配制培养基，将无菌培养基注入储液瓶；
9.打开各设备的电源预热；
10.设定灌注流量为1.0ml/s；
11.设定组织培养物旋转电机的转向和转速：顺时针旋转，10rpm；
12.设定骨组织受的周期性拉、压应力为15N，拉压频率为5次/min；
13.运行反应器；
本申请人同时提交的其他申请的交叉引用
本申请人与本申请同时提交的如下中国专利申请的内容在此被全文引用：
1、“一种具有扭转和拉压功能的组织工程反应器”
2、“一种具有拉压和培养腔旋转功能的组织工程反应器”
机译： 用于组织工程和异位测试的生物反应器具有一个带有生物材料支架的载体，可通过线性驱动器将其移动通过介质，以复制收缩压和舒张压
机译： 仪器化生物反应器，具有材料特性测量功能和基于过程的调节，可调节组织工程医疗产品
机译： 仪器化生物反应器，具有材料特性测量功能和基于过程的调节，可调节组织工程医疗产品
