鉴定LRRK2相互作用分子和纯化LRRK2的方法

本发明涉及使用吲哚配体91作为LRRK2的配体，鉴定LRRK2相互 作用分子和纯化LRRK2的方法。此外，本发明涉及包含所述相互作用 分子的药物组合物，例如用于治疗帕金森病。

帕金森病(PD)[OMIM168600，在线人类孟德尔遗传(OMM)， http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi？id＝168600] 是一种特征在于基底神经节黑质内的多巴胺能神经元变性的各种不同 运动失调。它影响着2％的超过60岁的人群。

帕金森病的现有治疗策略主要集中在使用多巴胺能药剂(例如左 旋多巴/卡比多巴)来减轻它症状的严重性。尽管为患者提供了益处， 这些药剂表现出不利的副作用，且在长期治疗后会变得无效(减弱效 应)。这些治疗都没有解决潜在问题，即多巴胺能神经元的渐进性丧失。

概括而言，帕金森病存在2种临床病理组分。首先，存在临床上 定义的帕金森症，即包含帕金森病运动失调的主要特征的综合征术语。 它们是静止性震颤，运动徐缓(运动缓慢)，僵硬和姿势不稳，所有都 是在开始或停止运动中的问题。它们的病理学联系是黑质中多巴胺能 神经元的丧失。其次，帕金森病的尸体解剖标志是在残存神经元中存 在Lewy小体和Lewy轴突。它们是脂质和包括泛素和α-突触核蛋白 在内的蛋白的细胞内聚集。帕金森病的病理学确定需要在残存黑质神 经元中存在α-突触核蛋白阳性的Lewy病状，伴有黑质细胞丧失和完 整的纹状体神经元(Cookson，2005.Annual Reviews in Biochemistry 74，29-52)。

近年来，蛋白聚集的α-突触核蛋白中心理论已经被蛋白DJ1、 PINK1和OMI/HTRA2的发现所补足，它们都与线粒体有关，且已经参 与抗氧化性损伤的细胞保护(Abou-Sleiman等人，2006.Nature Reviews Neuroscience 7，207-219)。

近来已有遗传学证据显示，富含亮氨酸的重复单位激酶2(LRRK2， 同义词Dardarin)的突变会造成以前与PARK8基因座相关联的常染色 体显性帕金森病。据估计，LRRK2突变占具有阳性家族史的帕金森病 例的5-6％，且也在散发病例中鉴定出。LRRK2编码一种大的多结构域 蛋白，它由N-末端富含亮氨酸的重复单位、GTP酶ROC/COR结构域、 丝裂原活化的蛋白激酶激酶激酶(MAPKKK)和C-末端WD40重复序列组 成(Paisan-Ruiz等人，2004.Neuron44，595-600；Zimprich等人， 2004.Neuron44，601-607)。Paisan-Ruz等人将蛋白产物命名为 dardarin，它源自表示震颤的巴斯克语“dardara”，但是该蛋白以后 被更名为LRRK2。

现在，关于LRRK2功能知之甚少，但是在体外过表达系统中已经 进行了初步观察。LRRK2编码一种蛋白激酶，且能自磷酸化(West等人， 2005.PNAS102，16842-16847，Gloeckner，等人，2005.Hum.Mol. Genet.15，223-232)。West等人的出版物描述了在特异性抗体辅助 下纯化重组LRRK2。但是，得到的蛋白的量非常少。

重要的是，3个PD-相关的LRRK2突变，2个在激酶结构域中 (G2019S和I2020T)，1个在ROC/COR GTP酶结构域中(R1441C)，会 增加LRRK2自磷酸化，这暗示着显性的获得功能型机理。实际上，LRRK2 的R1441C、Y1699C或G2019S突变体的过表达足以诱导小鼠原代皮质 神经元中的神经元变性(Smith等人，2005.PNAS 102，18676- 18681)。

此外，通过用“激酶-死亡”突变形式替换激酶结构域来操纵LRRK2 的激酶活性，会阻断包涵体的形成，并延迟细胞死亡，这是帕金森病 的2种细胞表型(Greggio等人，2006.Neurobiol.Dis.23(2)，329- 341)。该观察结果暗示着，激酶抑制剂将是具有LRRK2突变的患者的 有用治疗剂，且推测也是散发性PD的有用治疗剂。

最近发现，LRRK2突变会导致具有多形病状(包括α-突触核蛋白， tau和泛素病状)的迟发性帕金森病，这将LRRK2置于帕金森症的共 同神经变性途径中的上游。因而，LRRK2已经变成帕金森病的干预和 神经保护的有吸引力的治疗靶物(Taylor等人，2006.Trends in Molecular Medicine 12，76-82)。

考虑到上述内容，需要提供鉴定LRRK2相互作用化合物的有效方 法以及纯化LRRK2的方法。

为了满足该需要，本发明在第一方面提供了鉴定LRRK2相互作用 化合物的方法，其包括下述步骤：

a)提供含有LRRK2的蛋白制品，

b)在允许形成吲哚配体91-LRRK2复合物的条件下，使该蛋白制 品接触固定化在固体支持物上的吲哚配体91，

c)将吲哚配体91-LRRK2复合物与给定的化合物温育，和

d)确定该化合物是否能将LRRK2与固定化的吲哚配体91分离。

此外，在第二方面，本发明涉及鉴定LRRK2相互作用化合物的方 法，其包括下述步骤：

a)提供含有LRRK2的蛋白制品，

b)在允许形成吲哚配体91-LRRK2复合物的条件下，使该蛋白制 品接触固定化在固体支持物上的吲哚配体91和给定的化合物，和

c)检测在步骤b)中形成的吲哚配体91-LRRK2复合物。

在第三个优选方面，本发明提供了鉴定LRRK2相互作用化合物的 方法，其包括下述步骤：

a)提供含有LRRK2的蛋白制品的2份等分试样，

b)在允许形成吲哚配体91-LRRK2复合物的条件下，使一份等分 试样接触固定化在固体支持物上的吲哚配体91，

c)在允许形成吲哚配体91-LRRK2复合物的条件下，使另一份等 分试样接触固定化在固体支持物上的吲哚配体91和给定的化合物，和

d)测定在步骤b)和c)中形成的吲哚配体91-LRRK2复合物的量。

在本发明的上下文中，已经惊奇地发现，吲哚配体91是LRRK2 的配体。这使得能将吲哚配体91用于筛选实验即竞争性筛选实验以及 纯化LRRK2的方法中。

在图1中给出了吲哚配体91(5-[5-氟-2-氧-1，2-二氢-吲哚 -(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(3-氨基-丙基)-酰胺) 的结构。该化合物是结构上类似于激酶抑制剂Sutent(SU11248；Sun 等人，2003.J.Med.Chem.46，1116-1119)的分子。吲哚配体91 可以通过伯氨基共价偶联至合适的固体支持材料上，并用于结合蛋白 的分离。在实施例1中描述了吲哚配体91的合成。根据本发明，表述 “吲哚配体91”也包括具有相同核心但是具有另一接头的化合物，该 接头优选偶联至不构成环结构的一部分的NH基团上，用于连接固体支 持物。通常，接头可以具有8、9或10个原子的主链，且可以含有羧 基-或氨基-活性基团。

根据本发明，表述“LRRK2”不仅仅指如图3中所示的蛋白，而且 还指其功能活性衍生物，或其功能活性片段，或其同源物，或由在低 严格性条件下与编码所述蛋白的核酸杂交的核酸编码的变体。优选地， 这些低严格性条件包括，在含有35％甲酰胺、5X SSC、50mM Tris-HCl (pH 7.5)、5mM EDTA、0.02％ PVP、0.02％ BSA、100ug/ml变性鲑 精DNA和10％(重量/体积)硫酸葡聚糖的缓冲液中，在40°C杂交 18-20小时，在由2X SSC、25mM Tris-HCl(pH7.4)、5mM EDTA 和0.1％ SDS组成的缓冲液中，在55℃洗涤1-5小时，和在由2X SSC、 25mM Tris-HCl(pH 7.4)、5mM EDTA和0.1％ SDS组成的缓冲液中， 在60℃洗涤1.5小时。

此外，根据本发明，表述“LRRK2”包括LRRK2的突变体形式， 优选在帕金森病(家族型以及散发性病例)中观察到的这样的突变体形 式。已经显示，LRRK2基因中的突变会造成家族性常染色体显性帕金 森病(West等人，2005.PNAS 102，16842-16847)。更优选地，这些 突变体形式包括单氨基酸突变。

单氨基酸置换G2019S是最常观察到的突变之一(Taylor等人， 2006.Trends in Molecular Medicine 12，76-82)。该突变位于激 酶结构域中活化环的保守区域内，暗示着激酶活性的调控可能参与致 病机理。在帕金森病中观察到的其它突变包括R1441C，Y1699C，和 I2020T(参见Taylor等人的表2)。

因此，在一个优选的实施方案中，表述“LRRK2”也包括具有 G2019S、R1441C、Y1699C或I2020T突变的LRRK2蛋白。更优选地， 表述“LRRK2”也包括具有下述单突变之一的LRKK2蛋白：G2019S， R1441C，Y1699C，或I2020T。

此外，已经在LRRK2中鉴定出15个额外的推定致病的氨基酸置换 (Taylor等人，2006.Trends in Mol ecular Medicine 12，76-82，特 别参见图2)。

因此，在一个优选的实施方案中，表述“LRRK2”也包括具有R793M、 Q930R、R1067Q、S1096C、I1122V、S1228T、I1371V、R1441G、R1441H、 R1514Q、M1869T、R1941H、I2012T、T2356I或G2385R突变的LRRK2蛋 白。更优选地，表述“LRRK2”也包括具有下述单突变之一的LRKK2蛋 白：R793M，Q930R，R1067Q，S1096C，I1122V，S1228T，I1371V，R1441G， R1441H，R1514Q，M1869T，R1941H，I2012T，T2356I或G2385R。

在本发明的方法中，首先提供了含有LRRK2的蛋白制品。本发明 的方法可以使用任意的蛋白制品作为原料来实施，只要LRRK2溶于该 制品即可。实例包括几种蛋白的液体混合物，含有原始细胞中存在的 并非全部蛋白的部分细胞裂解物，或几种细胞裂解物的组合。

通过首先分离细胞器(例如细胞核，线粒体，核糖体，高尔基体 等)，然后制备源自这些细胞器的蛋白制品，可以得到部分细胞裂解物。 分离细胞器的方法是本领域已知的(Chapter 4.2 Purification of Organelles from Mammalian Cells，见”Current Protocols in Protein Science”，编者：John.E.Coligan，Ben M.Dunn，Hidde L.Ploegh，David W.Speicher，Paul T.Wingfield；Wiley，ISBN： 0-471-14098-8)。

另外，通过分级分离细胞提取物，从而富集特定类型的蛋白，例 如胞质或膜蛋白，可以制备蛋白制品(Chapter 4.3 Subcellular Fractionation of Tissue Culture Cells见”Current Protocols in Protein Science”，编者：John.E.Coligan，Ben M.Dunn，Hidde L.Ploegh，David W.Speicher，Paul T.Wingfield；Wiley，ISBN： 0-471-14098-8)。

此外，可以使用来自体液(例如血液，脑脊液，腹膜液和尿)的蛋 白制品。

例如，可以使用源自模型生物体(例如美丽线虫)的限定发育阶 段或成年阶段的全胚胎裂解物。另外，完整器官(例如从小鼠切离的 心脏)可以是蛋白制品的来源。这些器官也可以体外灌注，以便得到 蛋白制品。

此外，所述蛋白制品可以是含有已经重组生产的LRRK2的制品。 已经广泛确定了在原核和真核细胞中生产重组蛋白的方法(Chapter 5 Production of Recombinant Proteins见“Current Protocols in Protein Science”，编者：John.E.Coligan，Ben M.Dunn，Hidde L.Ploegh，David W.Speicher，Paul T.Wingfield；Wiley，1995， ISBN：0-471-14098-8)。

在本发明方法的一个优选的实施方案中，蛋白制品的提供包括下 述步骤：收获至少一个含有LRRK2的细胞，和裂解所述细胞。

在一个优选的实施方案中，所述细胞是细胞培养系统的一部分， 从细胞培养系统收获细胞的方法是本领域已知的(文献同上)。

细胞的选择将主要取决于LRRK2的表达，因为必须确保该蛋白主 要存在于选择的细胞中。为了确定给定的细胞是否是本发明方法的合 适起始系统，蛋白印迹、基于PCR的核酸检测方法、RNA印迹和DNA- 微阵列方法(“DNA芯片”)等方法可能是合适的，以便确定给定的目 标蛋白是否存在于细胞中。

细胞的选择也将受研究目的的影响。如果需要分析给定药物的体 内效能，则将选择在其中发生希望的治疗效果的细胞或组织(例如，对 于抗-神经变性药物，是脑组织)。相比之下，为了阐明介导不希望的 副作用的蛋白靶物，将分析在其中观察到副作用的细胞或组织(例如， 对于药物代谢，是肝组织)。

此外，在本发明中预见到，含有LRRK2的细胞可以从生物体得到， 例如通过活组织检查。对应的方法是本领域已知的。例如，活组织检 查是用于得到少量组织的诊断性操作，该少量组织然后可以显微镜检 查或用生化方法检查。活组织检查对于疾病的诊断、分类和分期是重 要的，对于评价和监测药物治疗也是重要的。

本发明包括，通过收获至少一个细胞，同时进行裂解。但是，同 样优选地，首先收获细胞，然后分开裂解。

裂解细胞的方法是本领域已知的(Karwa和Mitra：Sample preparation for the extraction，isolation，and purification of Nuclei Acids；chapter 8见”Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry”，Wiley 2003，编者：Somenath Mitra，print ISBN：0471328456；online ISBN：0471457817))。用匀浆器(例如 Potter-匀浆器)，超声磨碎机，酶裂解，去污剂(例如NP-40，Triton X-100，CHAPS，SDS)，渗透压休克，反复冻融，或这些方法的组合， 可以实现不同细胞类型和组织的裂解。

根据本发明的方法，在允许形成吲哚配体91-LRRK2复合物的条 件下，使蛋白制品接触固定化在固体支持物上的吲哚配体91。

在本发明中，术语“吲哚配体91-LRRK2复合物”表示其中吲哚配 体91与LRRK2相互作用(例如通过共价结合，或最优选地通过非共 价结合)的复合物。

技术人员会明白为了形成吲哚配体91-LRRK2复合物可以应用哪 种条件。

在本发明的上下文中，术语“在允许形成复合物的条件下”包括 可实现这样的形成、优选这样的结合的所有条件。这包括下述可能性： 将固体支持物置于固定化相上，并将裂解物倒到其上。在另一个优选 的实施方案中，也包括固体支持物是颗粒形式，并与细胞裂解物混合。

在非共价结合的上下文中，吲哚配体91和LRRK2之间的结合是例 如通过盐桥、氢键、疏水相互作用或其组合。

在一个优选的实施方案中，在基本上生理条件下进行形成吲哚配 体91-LRRK2复合物的步骤。在Petty，1998(Howard R.Petty， Chapter 1，Unit 1.5见：Juan S.Bonifacino，Mary Dasso，Joe B.Harford，Jennifer Lippincott-Schwartz，和Kenneth M.Yamada (编.)Current Protocols in Cell Biology Copyright  2003 John Wiley & Sons，Inc.All rights reserved.DOI： 10.1002/0471143030.cb0101s00在线邮寄日期：2001年5月，印刷 品出版日期：1998年10月)中，描述了细胞内蛋白的物理状态。

在基本上生理条件下的接触具有下述优点，即配体、细胞制品(即 要表征的酶)和任选地化合物之间的相互作用会尽可能多地反映天然 条件。“基本上生理条件”尤其是，在原始的、未加工的样品材料中 存在的那些条件。它们包括生理性的蛋白浓度、pH、盐浓度、缓冲容 量和涉及的蛋白的翻译后修饰。术语“基本上生理条件”不要求与样 品来源的原始活生物体中的条件完全相同的条件，但是基本上细胞样 条件或接近细胞条件的条件。本领域技术人员当然会认识到，由于最 终会导致不那么细胞样条件的实验设置，可能产生某些约束。例如， 当从活生物体采取和加工样品时，最后必需的细胞壁或细胞膜的破碎， 可能需要与在生物体中发现的生理条件不完全相同的条件。用于实施 本发明方法的生理条件的适当变化，是本领域技术人员显而易见的， 且包括在本文使用的术语“基本上生理条件”中。总之，应当理解， 术语“基本上生理条件”涉及，接近生理条件的条件，例如在天然细 胞中发现的条件，但是不一定要求这些条件完全相同。

优选地，“基本上生理条件”可以包含50-200mM NaCl或KCl，pH 6.5-8.5，20-45℃，和0.001-10mM二价阳离子(例如Mg++，Ca++，)； 更优选约150m NaCl或KCl，pH7.2-7.6，5mM二价阳离子，经常 包括0.01-1.0％非特异性蛋白(例如BSA)。可经常存在非离子型去污 剂(Tween，NP-40，Triton-X100)，通常是约0.001-2％，典型地 0.05-0.2％(体积/体积)。作为一般指南，下面的缓冲含水条件可能是 适用的：10-250mM NaCl，5-50mM Tris HCl，pH5-8，任选地加入 二价阳离子和/或金属螯合剂和/或非离子型去污剂。

在本发明的上下文中，将吲哚配体91固定化在固体支持物上。在 本发明中，术语“固体支持物”指能将小分子配体固定化到其表面上 的每种不溶支持物。

根据另一个优选的实施方案，所述固体支持物选自：琼脂糖，改性 琼脂糖，琼脂糖(sepharose)珠子(例如NHS-活化的琼脂糖)，胶乳， 纤维素，和亚铁-或铁磁性颗粒。

吲哚配体91可以共价或非共价地偶联到固体支持物上。非共价结 合包括通过生物素亲和配体结合而结合到链霉抗生物素基质上。

优选地，吲哚配体91共价偶联到固体支持物上。

偶联之前，基质可以含有活性基团，例如NHS，碳化二亚胺等， 以实现与吲哚配体91的偶联反应。通过直接偶联(例如使用官能团例 如氨基-，巯基-，羧基-，羟基-，醛-，和酮基团)和通过间接偶联 (例如通过生物素，生物素共价连接到吲哚配体91上，和生物素与直 接结合到固体支持物上的链霉抗生物素非共价结合)，可以将吲哚配体 91偶联到固体支持物上。

与固体支持物材料的连接，可以包含可切割的和不可切割的接头。 切割可以通过酶促切割或适当化学方法处理来实现。

吲哚配体91结合固体支持物材料的优选结合界面是含有C原子主 链的接头。通常，接头具有8、9或10个原子的主链。同样优选的是 聚乙二醇(PEG)接头。

技术人员会明白，在本发明方法的各个步骤之间，洗涤步骤可能 是必需的。这样的洗涤是本领域技术人员知识的一部分。洗涤用于从 固体支持物去除细胞裂解物中未结合的组分。通过加入低水平的去污 剂或通过适度调节洗涤缓冲液的盐浓度，可以使非特异性的(例如单纯 离子性的)结合相互作用最小化。

根据本发明的鉴定方法，读出系统是LRRK2的检测或测定(本发 明的第一个方面)、吲哚配体91-LRRK2复合物的检测(本发明的第二个 方面)、吲哚配体91-LRRK2复合物的量的测定(本发明的第三个方面)。

使用经标记的针对LRRK2的抗体和合适的读出系统，可以实现根 据本发明的第二个方面的吲哚配体91-LRRK2复合物的检测。

针对LRRK2的抗体和它们的使用方法是本领域已知的，标记抗体 (例如使用荧光染料)的方法也是本领域已知的。抗-LRRK2抗体可在商 业上得到(Sant Cruz Biotechnology Inc.，Santa Cruz，CA，USA)。 另外，针对LRRK2的突变形式(例如在家族型PD中观察到的G2019S 和I2020T氨基酸置换)的抗体可在商业上得到(Abgent，San Diego， CA，USA)。

但是，在本发明第二和第三方面的过程中，优选地将LRRK2与固 定化的吲哚配体91分离开。

根据本发明，分离是指破坏吲哚配体91和LRRK2之间的相互作用 的每种动作。在一个优选的实施方案中，这包括从固定化的吲哚配体 91洗脱LRRK2。

洗脱可以使用下文所详述的非特异性试剂(离子强度，pH值，去 污剂)来实现。另外，可以测试目标化合物是否可以特异性地洗脱 LRRK2。在下面的部分中进一步描述了这样的LRRK2相互作用化合物。

这样的破坏相互作用的非特异性方法在原理上是本领域已知的， 并且取决于配体酶相互作用的性质。原则上，离子强度、pH值、温度 的变化或与去污剂的温育，是从固定化的配体解离靶酶的合适方法。 洗脱缓冲液的应用，可以通过极端的pH值(高或低pH；例如使用0.1M 柠檬酸盐pH2-3降低pH)、离子强度的变化(例如使用Na I，K I，MgCl₂， 或KCl的高盐浓度)、破坏疏水相互作用的极性降低剂(例如二噁烷或 乙二醇)、或变性剂(离液盐或去污剂例如十二烷基硫酸钠，SDS；综述： Subramanian A.，2002，Immunoaffinity chromatography)，解离结 合伴侣。

在有些情况下，优选地将固体支持物与释放的物质分离。用于该 目的的各个方法取决于固体支持物的性质，且是本领域已知的。如果 支持物材料包含在柱内，释放的物质可以作为柱流出物收集。在支持 物材料与裂解物组分相混合的情况下(所谓的批式操作)，额外的分离 步骤(例如轻轻离心)可能是必需的，释放的物质作为上清液收集。 或者，磁珠可以用作固体支持物，使得珠子可以使用磁力装置从样品 中消除。

在根据本发明第一个方面的方法的步骤d)中，确定LRRK2是否 已经与固定化的LRRK2分离。这可以包括，检测LRRK2或测定LRRK2 的量。

结果，在本发明的所有鉴定方法的优选实施方案中，使用检测 LRRK2或测定它的量的方法。这样的方法是本领域已知的，包括物理 化学方法例如蛋白测序(例如Edmann降解)，通过质谱方法或使用针对 LRRK2的抗体的免疫检测方法进行分析。

优选地，通过质谱或免疫检测方法，检测LRRK2或测定LRRK2的 量。

用质谱分析(质谱法)鉴定蛋白是本领域已知的(Shevchenko等人， 1996，Analytical Chemistry 68：850-858；Mann等人，2001， Analysis of proteins and proteomes by mass spectrometry，Annual Review of Biochemistry 70，437-473)且在实施例部分进一步解释。

优选地，以定量方式进行质谱分析，例如通过使用iTRAQ技术(用 于相对和绝对定量的同量异序标记)或cICAT(可切割的同位素-编码 的亲和标记)(Wu等人，2006.J.Proteome Res.5，651-658)。

根据本发明另一个优选的实施方案，通过鉴定LRRK2的 proteotypic肽，进行质谱法(MS)表征。proteotypic肽的概念在实 施例部分详细描述。该构思是，用蛋白酶消化LRRK2，通过MS测定所 得到的肽。结果，来自相同源蛋白的肽的肽频率有很大程度的差异， “典型地”促成该蛋白的鉴定的最常观察到的肽称作“proteotypic 肽”。因此，在本发明中使用的proteotypic肽是在实验中可很好观 察的肽，它可以独特地鉴定特定的蛋白或蛋白同种型。

根据一个优选的实施方案，通过对比在实施本发明的方法过程中 得到的proteotypic肽和已知的proteotypic肽，进行表征。因为当 使用通过蛋白酶消化制备的片段在MS中鉴定蛋白时，通常对于给定的 酶观察到相同的proteotypic肽，因此可以对比对给定样品得到的 proteotypic肽和对给定酶类别中的酶已知的proteotypic肽，并从 而鉴定样品中存在的酶。

作为质谱分析的一个替代方案，使用针对LRRK2的特异性抗体， 可以检测洗脱的LRRK2(包括共洗脱的结合伴侣或支架蛋白)。

此外，在另一个优选的实施方案中，一旦已经通过质谱分析确立 了共洗脱的结合伴侣的身份，可以用针对该蛋白的特异性抗体检测每 种结合伴侣。

合适的基于抗体的测定包括、但不限于蛋白印迹，ELISA测定， 夹心ELISA测定和抗体阵列或其组合。这样的测定的建立，是本领域 已知的(Chapter 11，Immunology，第11-1至11-30页，见：Short Protocols in Molecular Biology.第4版，F.M.Ausubel等人编， Wiley，New York，1999)。

这些测定不仅可以以检测和定量目标酶的方式构建，而且可以以 分析翻译后修饰模式(例如磷酸化)的方式构建。例如，通过用特异 性的抗-磷酸酪氨酸、抗-磷酸丝氨酸或抗-磷酸苏氨酸抗体探测它的磷 酸化状态，可以确定激酶的活化状态。本领域已知如何选择和使用这 样的抗-磷酸抗体(Zhang等，2002.Journal of Biological Chemistry 277，43648-43658)。

此外，本发明的鉴定方法包括，使用要测试它们作为LRRK2相互 作用化合物的能力的化合物。

原则上，根据本发明，这样的化合物可以是能与LRRK2相互作用 的每种分子。优选地，化合物对LRRK2有作用，例如刺激、激活或抑 制作用。

优选地，所述化合物选自：合成的或天然存在的化学化合物或有 机合成药物，更优选小分子，有机药物或天然小分子化合物。优选地， 所述化合物从含有这类化合物的文库开始鉴定。然后，在本发明的过 程中，筛选这样的文库。

这样的小分子优选地不是蛋白或核酸。优选地，小分子的分子量 小于1000Da，更优选小于750Da，最优选小于500Da。

根据本发明的”文库”指以分类方式提供的(许多)不同化学实体 的集合(主要是大集合)，其能实现对不同单个实体的快速功能分析(筛 选)，并同时提供构成文库的单个实体的快速鉴定。实例是试管或表面 上的孔或点的集合，它们含有化合物，后者可以加入与一种或多种确 定的潜在相互作用伴侣的高处理量方式的反应中。鉴定出两种伴侣的 希望的”阳性”相互作用后，由于文库构建，可以快速鉴定各个化合 物。合成和天然起源的文库可以购买，或由熟练技术人员设计。

文库构建的实例提供在，例如，Breinbauer R，Manger M，Scheck M，Waldmann H.Natural product guided compound library development.Curr Med Chem.2002 Dec；9(23)：2129-45，其中描述 了天然产物，它们是生物学上验证过的设计组合文库的起点，因为它 们具有经证实的生物相关性记录。参考关于通过结构生物学和生物信 息学得到的蛋白的域结构的新知识，可以解释天然产物在药物化学和 化学生物学中的这种特殊作用。为了满足域家族内各个结合袋的特殊 要求，可能必须通过化学变化来优化天然产物结构。据称固相化学是 该优化过程的有效工具，在该综述文章中，强调了该领域的最新进展。 其它相关文献包括Edwards PJ，Morrell AI.Solid-phase compound library synthesis in drug design and development.Curr Opin Drug Discov Devel.2002 Jul；5(4)：594-605.；Merlot C，Domine D， Church DJ.Fragment analysis in small molecule discovery.Curr Opin Drug Discov Devel.2002 May；5(3)：391-9.Review；Goodnow RA Jr.Current practices in generation of small molecule new leads.J Cell Biochem Suppl.2001；Suppl37：13-21；它描述说， 许多制药公司的当前药物开发过程需要巨大的且日益增多的高质量先 导结构集合，用于高处理量筛选测定中。在过去，已经通过几种方式 获得具有不同结构和＂药物-样＂性质的小分子集合：通过以前的内部 先导物优化工作的记录，通过从化合物供应商购买，和通过公司合并 后单个集合的联合。尽管高处理量/组合化学被描述成属于新先导物产 生方法中的重要组分，用于合成和随后设计文库成员的文库设计的选 择，已经演化到新水平的挑战和重要性。针对多种生物学靶物筛选多 个小分子化合物文库设计的潜在益处，会提供大量发现新的先导结构 的机会。

在本发明第二个方面的一个优选的实施方案中，首先将LRRK2与 化合物、然后与固定化的吲哚配体91温育。但是，将化合物和固定化 的吲哚配体91与含有LRRK2的蛋白同时温育(共温育)是同样优选的 (竞争结合实验)。

优选地，首先在4℃-37℃，更优选4℃-25℃，最优选4℃， 将LRRK2与化合物温育10-60分钟，更优选30-45分钟。优选地，使 用的化合物的浓度范围是1μM至1mM，优选10至100μM。第二 步，接触固定化的配体，优选在4℃进行10-60分钟。

在同时温育的情况下，LRRK2优选地在4℃-37℃、更优选4℃ -25℃、最优选4℃-8℃的温度与化合物和固定化的吲哚配体91 同时温育10-120分钟，更优选20-60分钟。优选地，使用的化合物的 浓度范围是1nM至100μM，优选10nM至10μM。

此外，本发明第二个方面的步骤a)至c)可以用几种蛋白制品来 实现，以便测试不同化合物。在中等或高通量筛选的上下文中，该实 施方案是特别令人感兴趣的(参见下文)。

在根据第三个方面的本发明方法的一个优选的实施方案中，与步 骤b)相比在步骤c)中形成的吲哚配体91-LRRK2的量的减少，指示着 LRRK2是化合物的靶物。其原因是，在本发明该方法的步骤c)中，化 合物与配体竞争结合LRRK2。如果在与化合物温育的等分试样中存在 较少的LRRK2，这优选意味着化合物已经与抑制剂竞争与酶的相互作 用，因此是酶的直接靶物，反之亦然。

优选地，本发明的鉴定方法作为中等或高通量筛选来进行。这样 的实验是本领域技术人员已知的(Mallari等人，2003，A generic high-throughput screening assay for kinases：protein kinase A as an example，Journal of Biomolecular Screeing 8，198-204； Rodems等人，2002，A FRET-based assay platform for ultra-high density screening of protein kinases and phosphatases，Assay and Drug Development Technologies 1(1PT1)，9-19)。

通过测定其是否对LRRK2活性、例如对它的激酶活性有影响，可 以进一步表征根据本发明鉴定出的相互作用化合物(West等人，2005. PNAS 102，16842-16847)。这样的实验是本领域已知的，且也是允许 实施中等至高通量筛选的形式。

简而言之，可以将荧光素-标记的肽底物与酪氨酸激酶(例如 LRRK2)、ATP和抗-磷酸酪氨酸抗体温育。随着反应的进行，磷酸化的 肽会结合抗-磷酸酪氨酸抗体，导致极化信号的增加。抑制激酶的化合 物会产生低的极化信号。

或者，可以以改进的间接方式构建测定。发荧光的磷酸肽用作与 抗-磷酸-酪氨酸抗体形成复合物的示踪剂，产生较高的极化信号。当 未标记的底物被激酶磷酸化时，产物与发荧光的磷酸化的肽竞争抗体。 发荧光的肽然后从抗体释放进溶液，导致极化信号的丧失。直接和间 接测定都可以用于鉴定蛋白酪氨酸激酶活性的抑制剂(Seethala， 2000，Methods 22，61-70；Seethala和Menzel，1997，Anal.Biochem. 253，210-218；Seethala和Menzel，1998，Anal.Biochem.255， 257-262)。

通过用抗-磷酸丝氨酸或抗-磷酸苏氨酸抗体替代抗磷酸酪氨酸抗 体，可以将该荧光极化测定修改得适合用于蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶 (Turek等，2001，Anal.Biochem.299，45-53，PMID 11726183；Wu 等，2000，J.Biomol.Screen.5，23-30，PMID 10841597)。

可以进一步优化根据本发明鉴定出的化合物(先导物优化)。因为 在这些先导物产生文库中编码的结构-活性关系(SAR)信息，这样的化 合物的随后优化经常被加速。由于用于随后合成的高处理量化学(HTC) 方法的适用性，经常会促进先导物优化。

这样的文库和先导物优化的一个实例描述在，Wakeling AE， Barker AJ，Davies DH，Brown DS，Green LR，Cartlidge SA，Woodburn JR.Specific inhibition of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase by 4-anilinoquinazolines.Breast Cancer Res Treat.1996；38(1)：67-73。

本发明还涉及制备药物组合物的方法，其包括下述步骤：

a)如上所述鉴定LRRK2相互作用化合物，和

b)将所述相互作用化合物配制成药物组合物。

因此，本发明提供了制备药物组合物的方法，其可以以有效量施 用给受试者。在一个优选方面，治疗剂是基本上纯化的。待治疗的受 试者优选地是动物，包括但不限于牛、猪、马、鸡、猫、狗等动物， 优选哺乳动物，最优选人。在一个具体的实施方案中，非-人哺乳动物 是受试者。

总体而言，本发明的药物组合物包含治疗有效量的治疗剂和药学 上可接受的载体。在一个具体的实施方案中，术语＂药学上可接受的＂ 指被联邦或政府机关的管理部门所批准，或列在美国药典或其它公认 的药典中，用于动物，更特别是用于人。术语＂载体＂指与治疗剂一起 施用的稀释剂，辅剂，赋形剂，或介质。这样的药物载体可以是无菌 的液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，包 括但不限于花生油，大豆油，矿物油，芝麻油等。当经口施用药物组 合物时，水是优选的载体。当静脉内地施用药物组合物时，盐水和含 水右旋糖是优选的载体。盐水溶液和含水右旋糖和甘油溶液优选地用 作可注射溶液的液体载体。合适的药物赋形剂包括淀粉，葡萄糖，乳 糖，蔗糖，明胶，麦芽，稻米，面粉，白垩，硅胶，硬脂酸钠，单硬 脂酸甘油酯，滑石，氯化钠，脱脂奶粉，甘油，丙烯，乙二醇，水， 乙醇等。如果需要，组合物还可以含有小量的润湿剂或乳化剂，或pH 缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶 囊、粉末、持续释放制剂等的形式。利用传统的粘合剂和载体，例如 甘油三酯，可以将组合物配制成栓剂。经口制剂可以包括标准的载体 例如药物级甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素，碳酸 镁等。合适的药物载体的实例记载在E.W.Martin的＂Remington′s Pharmaceutical Sciences＂。这样的组合物含有治疗有效量的治疗剂， 优选纯化的形式，以及合适量的载体，以便提供适于施用给患者的形 式。制剂应当适合施用模式。

在一个优选的实施方案中，根据常规方法，将组合物配制成适于 静脉内地施用给人类的药物组合物。典型地，静脉内施用的组合物是 在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。当需要时，组合物也可以包括增溶 剂和局部麻醉剂，例如利多卡因，以缓解注射部位的疼痛。通常，单 独分开地或在单位剂型中混合在一起地供应成分，例如，作为在密封 容器中的冻干粉末或无水浓缩物，所述容器例如指示活性剂的量的安 瓿或药囊(sachette)。当要通过输注施用组合物时，可以用含有无 菌药用级水或盐水的输液瓶分配它。当通过注射施用组合物时，可以 提供一安瓿的无菌注射用水或盐水，以便可以在施用前混合各成分。

本发明的治疗剂可以配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包 括与游离羧基形成的那些，例如源自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石 酸等的羧基；与游离胺基团形成的那些，例如源自异丙胺、三乙胺、 2-乙氨基乙醇，组氨酸，普鲁卡因等的胺基团，和源自钠、钾、铵、 钙和铁氢氧化物等的那些。

将有效地治疗特定障碍或状况的本发明的治疗剂的量，取决于障 碍或状况的性质，且可以通过标准的临床技术来确定。另外，可以任 选地采用体外测定，以辅助鉴定最佳剂量范围。在制剂中使用的准确 剂量，也依赖于施用途径，疾病或障碍的严重性，且应当根据操作人 员的判断和每位患者的情况来决定。但是，静脉内施用的合适的剂量 范围通常是约20-500微克活性化合物/千克体重。鼻内施用的合适的 剂量范围通常是约0.01pg/kg体重至1mg/kg体重。从源自体外或 动物模型实验系统的剂量-效应曲线，可以外推有效剂量。一般而言， 栓剂可以含有0.5％-10％(重量)的活性成分；经口制剂优选地含有 10％-95％活性成分。

已知多种输送系统，且可以用于施用本发明的治疗剂，例如包封 在脂质体，微粒，和微胶囊中；使用能表达治疗剂的重组细胞，使用受 体-介导的胞吞作用(例如，Wu和Wu，1987，J.Biol.Chem. 262：4429-4432)；构建作为逆转录病毒或其它载体的一部分的治疗核 酸等。导入方法包括但不限于皮内的，肌肉内的，腹膜内的，静脉内 的，皮下的，鼻内的，硬膜外的和经口的途径。通过任何方便的途径， 例如通过输注，通过快速推注，通过经上皮或粘膜皮肤内衬(例如，口 腔的，直肠的和肠的粘膜等)的吸收，可以施用化合物，且可以与其它 生物活性剂一起施用。施用可以是全身的或局部的。另外，可能需要 通过任何合适的途径，包括脑室内的和鞘内的注射，将本发明的药物 组合物导入中枢神经系统；通过脑室内的导管，例如其连接到储器， 例如Ommaya储器，可以促进脑室内注射。也可以采用肺施用，例如， 通过使用吸入器或或喷雾器，并与雾化剂一起配制。

在一个具体的实施方案中，可能需要将本发明的药物组合物局部 地施用到需要治疗的区域。这可以通过下述方式实现：例如但不限于， 在手术过程中局部输注，局部应用，例如手术后与创伤敷料相联合， 通过注射，借助导管，借助栓剂，或借助植入物，所述植入物是多孔 的，无孔的，或凝胶状的材料，包括膜，例如sialastic膜，或纤维。 在一个实施方案中，施用可以是通过在恶性肿瘤或肿瘤组织或肿瘤发 生前组织的部位(或先前部位)直接注射。

在另一个实施方案中，可以在囊泡、尤其脂质体中输送治疗剂 (Langer，1990，Science 249：1527-1533)。

在另一个实施方案中，通过控释系统，可以输送治疗剂。在一个 实施方案中，可以使用泵(Langer，同上)。在另一个实施方案中， 控释系统可以置于治疗靶物(即脑)附近，从而仅仅需要全身剂量的 一部分。

本发明还涉及纯化LRRK2的方法，其包括下述步骤

a)提供含有LRRK2的蛋白制品，

b)在允许形成吲哚配体91-LRRK2复合物的条件下，使该蛋白制 品接触固定化在固体支持物上的吲哚配体91，和

c)将LRRK2与固定化的吲哚配体91分离。

如上所述，已经惊奇地发现，吲哚配体91是LRRK2配体。这能 实现有效的LRRK2纯化方法。

关于LRRK2，含有LRRK2的蛋白制品，接触吲哚配体91的条件、 固定化的吲哚配体91，吲哚配体91-LRRK2复合物，LRRK2与固定化的 吲哚配体91的分离，和LRRK2的检测或它的量的测定，上面为本发明 的鉴定方法定义的实施方案也适用于本发明的纯化方法。

在一个优选的实施方案中，本发明的纯化方法还包括，在步骤c) 后，鉴定能结合LRRK2的蛋白。当复合物的形成是在基本上生理条件 下进行时，这是特别令人感兴趣的，因为那样可保持酶的天然条件， 这包括存在结合伴侣、酶亚基或翻译后修饰，它们然后可以在质谱法 (MS)辅助下鉴定出来。

因此，在一个优选的实施方案中，本发明的纯化方法还包括，在 步骤c)后，确定LRRK2是否经翻译后修饰。

本发明还涉及吲哚配体91用于鉴定LRRK2相互作用化合物和用于 纯化LRRK-2的用途。上面定义的实施方案也适用于本发明的用途。

下面附图和实施例进一步解释了本发明，它们不应当视作限制本 申请权利要求赋予的保护范围。

附图简述

图1：可连接的吲哚配体91的结构。

该图显示了可连接的吲哚配体91的结构。游离的伯氨基可以用于 共价偶联到固体支持物材料。

图2：使用固定化的吲哚配体91的药物pulldown实验

该图显示了考马斯蓝染色后蛋白凝胶的照片。用SDS样品缓冲液 洗脱结合到固定化吲哚配体91上的蛋白，并通过SDS-聚丙烯酰胺凝 胶电泳(SDS-PAGE)分析。将指示的凝胶区域切下作为凝胶切片，对蛋 白进行质谱分析。含有LRRK2的条带的位置在样品01中是在凝胶上部 00b和01a之间。

图3：LRRK2鉴定的肽

通过质谱分析小鼠LRRK2序列(IPI00227565.2，2527个氨基酸) 鉴定出的肽标有下划线。

实施例1：可连接的吲哚配体91的合成

合成吲哚配体91：5-[5-氟-2-氧-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲 基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(3-氨基-丙基)-酰胺

步骤1：5-氟-1，3-二氢-吲哚-2-酮

在110℃，加热5-氟靛红(1g)于水合肼(55％，10ml)中的溶液30 分钟。一旦悬浮液转变成溶液，在110℃加热反应4小时，然后在0 ℃冷却。过滤沉淀，用水洗涤。将固体悬浮于水(10ml)中，通过加入 浓盐酸，使pH降低至pH2，在室温搅拌溶液5小时。收集沉淀，用水 (2x15ml)洗涤固体，在40℃真空烘箱中干燥(0.26g，30％)。¹H NMR(400 MHz，DMSO-d₆)δ 10.2(s，1H)；6.8-7.0(dd，2H)；6.6(m，1H)； 3.2(s，2H)；。LCMS：方法D，RT＝1.736min，[MH⁺＝152]。

步骤2：{3-[(5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羰基)-氨基]-丙 基}-氨基甲酸叔丁基酯

向5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡唑-3-甲酸(0.300g，1.79mmol)、 N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基碳化二亚胺(0.516g，2.69mmol)、1-羟 基苯并三唑水合物(0.364g，2.69mmol)、三乙胺(0.502ml，3.56mmol) 于二甲基甲酰胺(3ml)中的溶液中，加入N-Boc-1，3-二氨基丙烷 (0.375ml，2.15mmol)。在室温搅拌溶液15小时。加入盐水(1.5ml)、 水(1.5ml)和饱和碳酸氢钠水溶液(1.5ml)的混合物，通过加入10N氢 氧化钠，将溶液的pH调节至12。用二氯甲烷：甲醇(9:1)的混合物， 萃取溶液3次。用无水硫酸镁干燥有机层。去除溶剂，通过快速色谱(己 烷：乙酸乙酯(50-100％))纯化残余物，产生黄色固体状的希望的化 合物(0.30g，52％)。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ 11.90(s，1H)； 9.50(s，1H)；7.50(m，1H)；6.90(m，1H)；3.20(q，2H)；3.00 (q，2H)；2.30(s，3H))；2.20(s，3H))；1.60(m，2H))；1.40 (s，9H)。LCMS：方法D，RT＝2.103min，[M+Na⁺＝346]，和 [M-Boc+Na⁺＝246]。

步骤3：[3-({5-[5-氟-2-氧-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲 基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羰基}-氨基)-丙基]-氨基甲酸叔丁基酯

在78℃加热{3-[(5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羰基)-氨 基]-丙基}-氨基甲酸叔丁基酯(0.200g，0.62mmol)和5-氟-1，3-二氢 -吲哚-2-酮(0.011g，0.62mmol)、吡咯烷(0.003ml)于乙醇(2ml)中 的溶液3小时。使反应冷却至0℃，过滤得到的沉淀，用冷乙醇洗涤。 将产物悬浮于乙醇(4ml)，在72℃搅拌30分钟。过滤反应物，在40 ℃真空烘箱中干燥沉淀，产生希望的化合物固体(0.265g，94％)。¹H NMR (400MHz，DMSO-d₆)δ 13.8(s，1H)；11.00(s，1H)；7.80(m，2H)； 7.70(m，1H)；7.0(m，1H)；6.9(m，2H)；3.30(q，2H)；3.10(q， 2H)；2.50(dd，6H)1.60(m，2H))；1.40(s，9H)。LCMS：方法D， RT＝2.86min，[M+Na⁺＝479]，和[M-Boc+Na⁺＝379]。

步骤4：5-[5-氟-2-氧-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二 甲基-1H-吡咯-3-甲酸(3-氨基-丙基)-酰胺

将[3-({5-[5-氟-2-氧-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二 甲基-1H-吡咯-3-羰基}-氨基)-丙基]-氨基甲酸叔丁基酯悬浮于甲醇。 加入2ml HCl(4N)的二噁烷溶液，在室温搅拌反应物过夜。去除溶剂， 产生希望的化合物(0.098g，91％)。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ 13.8(s，1H)；11.00(s，1H)；7.90-7.70(m，5H)；6.9(m，2H)； 3.30(q，2H)；2.80(q，2H)；2.50(dd，6H)1.80(m，2H)。LCMS： 由于荧光而不确定。

在惰性气氛下进行所有反应。在Bruker dpx400上得到NMR光谱。 使用zorbax SBC-18，4.6mmx150mm-5μ柱或小柱： SB-C18， 4.6 x 75mm，3.5微米(“短柱”)，在Agilent1100上进行LCMS。 柱流速是1ml/min，使用的溶剂是水和乙腈(0.1％TFA)，注射体积是 10ul。波长是254和210nm。方法如下所述。

表1：分析方法

表2：在化学方案中使用的缩写

实施例2：使用固定化的吲哚配体91的药物pulldown和LRRK2 的鉴定

本实施例证明了固定化的吲哚配体91配体用于鉴定来自小鼠脑 裂解物的LRRK2的用途。使用化学蛋白组学方法，鉴定出了结合到固 定化的吲哚配体91的蛋白。在共价连接了吲哚配体91的树脂上，纯 化了结合蛋白。洗脱结合的蛋白，随后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离(参见图2)，切出合适的凝胶条带，通过LC-MS/MS质谱法分析蛋 白。

结果表明，固定化的吲哚配体91可以用于富集和表征来自小鼠脑 裂解物的LRRK2。在表4中列出了通过质谱法鉴定出的12种LRRK2肽。

1.小分子胺化合物的固定化

用无水DMSO(二甲基亚砜，Fluka，41648，H20<＝0.005％)平衡 NHS-活化的Sepharose 4 Fast Flow(Amersham Biosciences， 17-0906-01)。将1ml沉降的珠子置于15ml Falcon试管中，加入化 合物原液(通常100mM，在DMF或DMSO中)(终浓度0.2-2μmol/ml 珠子)以及15μl TEA。在翻转摇动器(end-over-end shaker)(Roto Shake Genie，Scientific Industries Inc.)上在黑暗中在室温温育 珠子16-20小时。通过HPLC测定偶联效率。通过在翻转摇动器上在 室温与氨基乙醇温育过夜，封闭未反应的NHS-基团。用10ml DMSO 洗涤珠子。将洗涤过的珠子在4℃储存在异丙醇中。

2.细胞裂解物的制备

在Potter S匀浆器中匀浆小鼠脑组织(每个脑5ml)：50mM Tris-HCl，1％ CHAPSO，5％甘油，150mM NaCl，1.5mM MgCl₂，25mM NaF，1mM钒酸钠，1mM DTT，pH7.5。每25ml缓冲液加入1片不 含EDTA的完全片剂(蛋白酶抑制剂混合物，Roche Diagnostics，1 873 580)。使用机械化的POTTER S，将物质匀浆10次，转移至50ml falcon 试管，在冰上温育30分钟，以20,000g在4℃(10,000rpm，在Sorvall SLA600中，预冷)旋转10分钟。将上清液转移至超速离心(UZ)-聚碳 酸酯试管(Beckmann，355654)并以100.000g在4℃(33.500rpm， 在Ti50.2中，预冷)旋转1小时。将上清液再次转移至新鲜的50ml Falcon试管，通过Bradford测定(BioRad)，测定蛋白浓度，制备 每份等分试样含有50mg蛋白的样品。将样品立即用于实验，或在液 氮中冷冻，在-80℃冷冻保藏。

3.化合物pulldown实验

在裂解缓冲液中平衡含有固定化的化合物的琼脂糖珠子(每个 pull-down实验100μl珠子)，在翻转摇动器(Roto Shake Genie， Scientific Industries Inc.)上与含有50mg蛋白的细胞裂解物样 品在4°C温育2小时。收集珠子，转移至Mobicol-柱(MoBiTech 10055)，并用含有0.5％去污剂(NP40)的10ml裂解缓冲液洗涤，随后 用含有0.25％去污剂5ml裂解缓冲液洗涤。为了洗脱结合的蛋白，加 60μl 2 x SDS样品缓冲液，在50℃加热柱30分钟，通过离心 将洗脱液转移至微量离心管。然后通过SDS-聚丙烯酰胺电泳 (SDS-PAGE)分离蛋白。

4.质谱法鉴定蛋白

4.1质谱分析前的蛋白消化

基本上按照Shevchenko等，1996，Anal.Chem.68：850-858所 述的操作，将凝胶分离的蛋白还原，烷基化，并在凝胶中消化。简而 言之，使用清洁的解剖刀，从凝胶切离经凝胶分离的蛋白，使用10mM DTT(在5mM碳酸氢铵中，54℃，45分钟)还原，随后用55mM碘乙 酰胺(在5mM碳酸氢铵中)在室温在黑暗中烷基化(30分钟)。以在 5mM碳酸氢铵中12.5ng/μl的蛋白酶浓度，用猪胰蛋白酶(Promega) 在凝胶中消化经还原和烷基化的蛋白。在37℃进行消化4小时，随后 使用5μl5％甲酸终止反应。

4.2质谱法分析之前的样品制备

用20μl 1％TFA提取凝胶塞2次，与酸化的消化上清液合并。在 真空离心机中干燥样品，重悬于13μl1％TFA中。

4.3.质谱数据获取

将肽样品注射进nano LC系统(CapLC，Waters或Ultimate， Dionex)，后者直接连接到四极TOF(QTOF2，QTOF Ultima，QTOF Micro， Micromass)或离子阱(LCQ Deca XP)质谱仪。使用含水和有机溶剂的梯 度(见下文)，在LC系统上分离肽。溶剂A是5％乙腈于0.5％甲酸中， 溶剂B是70％乙腈于0.5％甲酸中。

表3：从LC系统洗脱的肽在质谱仪内部分测序

4.4.蛋白鉴定

在LC-MS/MS实验中产生的肽质量和断裂数据，用于查询在 NCBI(对于NCBInr，dbEST以及人和小鼠基因组)和欧洲生物信息学研 究所(EBI，对于人，小鼠，黑腹果蝇和美丽线虫蛋白质组数据库)维 持和定期更新的fasta格式化的蛋白和核苷酸序列数据库。通过使用 软件工具Mascot(Matrix Science；Perkins等，1999. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass specttometry data.Electrophoresis 20， 3551-3567)，将测量的肽质量和断裂数据与从数据库中登录条目计算 出的相同数据相关联，鉴定蛋白。搜索标准随分析使用的质谱仪而异。

表4：来自小鼠脑的LRRK2的质谱法肽鉴定(实验P11927B)

实施例3：鉴定LRRK2相互作用化合物的筛选实验

本实施例描述了一个竞争结合实验，其中将实验化合物直接加入 细胞裂解物。将实验化合物和带有固定化的吲哚配体91的亲和基质加 入裂解物等分试样，并允许其结合到裂解物样品中含有的蛋白。温育 时间后，将捕获有蛋白的珠子与裂解物分离。然后洗脱结合的蛋白， 检测LRRK2在洗脱液中的存在，并在斑点印迹方法和Odyssey红外检 测系统中使用特异性抗体定量。通过使用多种不同浓度的实验化合物， 建立剂量响应曲线。在WO2006/134056中公开了其它实验信息。

亲和基质的洗涤

用含有0.4％ NP40的1 x DP缓冲液洗涤在实施例1中所述的亲 和基质2次，然后重悬于含有0.4％ NP40的1 x DP缓冲液(20％珠子 浆)。

表5：5 x DP缓冲液的制备

物质：      原液      在1x裂解缓       对于115 x

                      冲液中的终浓     裂解缓冲液的

                      度               加入量

Tris/HCl pH 7.51M     50mM             250ml

甘油        87％      5％              288ml

MgCl₂       1M        1.5mM            7.5ml

NaCl        5M        150mM            150ml

Na₃VO₄      100mM     1mM              50ml

通过0.22μm过滤器过滤5倍浓缩的(5x)DP缓冲液，储存于 -80℃。为了得到1xDP缓冲液，用蒸馏水1:5稀释5xDP缓冲液。从 下述供应商得到原液：1.0M Tris/HCl pH 7.5(Sigma，T-2663)， 87％甘油(Merck，目录号04091.2500)；1.0M MgCl₂(Sigma，M-1028)； 5.0M NaCl(Sigma，S-5150)。

实验化合物的制备

在DMSO中制备实验化合物原液，相当于比最终的目标实验浓度高 100倍的浓度(例如对于4μM的最终实验浓度，制备400μM原液)。 该稀释方案产生在实验中1％的终DMSO浓度。对于对照实验(无实验化 合物)，使用含有1％DMSO的缓冲液，所以所有样品都含有1％DMSO。

细胞裂解物的制备和稀释

如实施例2所述制备细胞裂解物。对于一个典型实验，在37℃ 水浴中融化含有50mg蛋白的一份裂解物等分试样，然后保持在4℃。 向该裂解物中加入1体积的1xDP缓冲液，达到0.4％的终NP40浓度。 然后，加入1/50终体积的50倍浓缩的蛋白酶抑制剂溶液(1片蛋白酶 抑制剂溶于0.5ml含有0.4％ NP40的1 x DP缓冲液；无EDTA的片剂 蛋白酶抑制剂混合物来自Roche Diagnostics，目录号41647)。通过 加入含有0.4％NP40的1 x DP缓冲液进一步稀释裂解物，达到5mg/ml 的终蛋白浓度。

将裂解物与实验化合物和亲和基质温育

将100μl体积的稀释的裂解物分配到96孔滤板的每个孔中。然 后，加入1.5μl在DMSO中稀释的实验化合物。对于对照反应，使用 1.5μl不含实验化合物的DMSO。然后，每个孔加入50μl亲和基 质(20％浆)。在4℃在摇床上温育平板2小时。使用多头抽真空装置 (Millipore，MAVM 096 0R)，洗涤平板。每个孔用400μl含有0.4％ NP-40的1 x DP缓冲液洗涤4次，用400μl含有0.2％ NP-40的1x DP缓冲液洗涤2次。

对于洗脱，将滤板置于收集板上，向每个孔中加入40μl含有 DTT(50mM终浓度)的2x样品缓冲液(100mM TrisHCl，pH6.8；4％ SDS； 20％甘油；0.02％溴酚蓝)。在摇床(750rpm，在Thermomixer上， Eppendorf)上在室温温育平板30分钟。随后，以1100rpm(Heraeus 离心机)离心平板2分钟，在收集板的孔中收集洗脱物。

洗脱的LRRK2的检测和定量

使用针对LRRK2的第一抗体(Santa Cruz Biotechnolgy，Santa Cruz，CA，USA)和荧光标记的二抗(抗-小鼠IRDye^TM 800，来自 Rockland，610-732-124)，通过斑点印迹方法检测和定量洗脱物中的 LRRK2蛋白。根据生产商提供的说明书操作来自LI-COR Biosciences (Lincoln，Nebraska，USA)的Odyssey红外成像系统 (Schutz-Geschwendener等人，2004.Quantitative，two-color Western blot detection with infrared fluorescence.LI-COR Biosciences在2004年5月出版，www.licor.com)。

根据供应商的说明书，使用斑点印迹装置(Bio-Dot microfiltration，BioRad 170-65)。用20％乙醇处理硝酸纤维素膜 (BioTrace NT Nitrocellulose，PALL BTNT30R)，随后用1xPBS缓冲 液洗涤。每个斑点应用30μl洗脱物样品。

对于LRRK2的检测，首先通过与Odyssey封闭缓冲液(LICOR， 927-40000)在室温温育1小时，封闭膜。然后封闭的膜与在含有0.2％ 吐温-20的Odyssey封闭缓冲液中稀释的抗-LRRK2抗体在4℃温育 16小时。用含有0.1％吐温20的1xPBS缓冲液洗涤膜4次后，膜与在 含有0.2％吐温-20的Odyssey封闭缓冲液中稀释的检测抗体(抗-小鼠 IRDye^TM 800来自Rockland，610-732-124)温育40分钟。然后，用 1 x PBS缓冲液/0.1％吐温20洗涤膜4次，每次5分钟，用1 x PBS缓 冲液洗涤1次5分钟。将膜在4℃保持在PBS缓冲液中，然后用 Odyssey装置扫描，根据生产商的说明书记录信号和分析。

实施例4：LRRK2激酶实验

本实施例描述了可以用于确定LRRK2相互作用化合物是否是 LRRK2激酶抑制剂的实验。如以前所述进行实验(West等人，2005. PNAS 102，16842-16847)。

将含有Myc表位标记的全长LRRK2cDNA克隆克隆进哺乳动物表达 载体。根据生产商的说明书，使用FuGENE6.0试剂(Roche Applied Science)，将表达质粒瞬时转染进HEK-293T细胞。在添加了10％FBS、 青霉素(100单位/ml)和链霉素(100μg/ml)的Opti-MEM培养基 (Invitrogen)中培养HEK-293T细胞。为了制备用于激酶实验的重组 LRRK2蛋白，在免疫沉淀缓冲液(0.5％ Triton-X-100，1x完全小蛋 白酶抑制剂混合液(Roche)在PBS中)中收获HEK-293T细胞，然后在 4℃温育裂解物1小时，随后以17,500xg离心15分钟。使上清液 级分与用小鼠单克隆抗-c-myc抗体(克隆9E10；Roche)预复合的 Protein G sepharose 4 Fast Flow(Amersham Pharmacia Biotech) 合并，然后旋转试管温育过夜。通过离心沉淀蛋白G琼脂糖复合物， 用添加了500mM NaCl的缓冲液洗涤5次，用1 x PBS缓冲液洗涤1 次。

将结合到G琼脂糖上的Myc-标记的LRRK2蛋白与25μM生物素 化的髓磷脂碱性蛋白(MBP；Upstate Biotechnology，Lake Placid， NY)一起重悬于在冰上的激酶缓冲液(20mM Hepes，pH7.4；15mM MgCl₂；5mM EGTA；20mM β-甘油磷酸酯)。通过加入0.5μCi[γ ³²P]ATP(Perkin Elmer)和15μM ATP，启动激酶反应。在30℃温 育混合物15分钟。将反应物置于冰上，通过加入2.5M胍-HCl终止 反应。使用通用的激酶实验试剂盒(Calbiochem)来定量生物素化的 MBP中掺入的放射性同位素，其中向反应物中加入抗生物素蛋白溶液 (Calbiochem)，在25℃温育10分钟。将反应物以800xg离心2 分钟，将上清液置于含有抗生物素蛋白结合膜的柱上，根据生产商的 方案洗涤。通过液体闪烁计数，测量掺入的放射性同位素的量。

在如上所述的激酶反应中测定LRRK2自磷酸化活性，但是没有加 入MBP。在30℃温育反应物15分钟，通过加入5％ 2-巯基乙醇的 Laemmli样品缓冲液终止反应。在75℃加热反应物10分钟，然后置 于冰上。简单离心后，在6％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中分离样品(上清液)， 转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，曝光于BioMax胶片(Kodak)。用抗-c-myc 抗体(9E10；Roche)探测膜，以测定每个反应中LRRK2的量。使用 IMAGEQUANT5.0定量放射自显影和蛋白印迹条带，从而将磷酸化的MBP 的量相对于每个实验中LRRK2的量标准化。

序列表

<110>Cellzome AG

<120>鉴定LRRK2相互作用分子和纯化LRRK2的方法

<130>CEL64132PC

<150>US60/782,119

<151>2006-03-14

<160>13

<170>PatentIn versi on 3.3

<210>1

<211>2527

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>1

<210>2

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>2

<210>3

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>3

<210>4

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>4

<210>5

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>5

<210>6

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>6

<210>7

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>7

<210>8

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>8

<210>9

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>9

<210>10

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>10

<210>11

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>11

<210>12

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>12

<210>13

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>13