小鹅瘟、鹅副粘病毒病二联灭活疫苗及其制备方法

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明做详细说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、小鹅瘟、鹅副粘病毒病二联灭活疫苗的获得

为了同时、安全地预防雏鹅的这两种病毒性传染病，研制了二联灭活疫苗。其制备方法如下所述：

一、小鹅瘟灭活疫苗的制备

1、材料

毒种：小鹅瘟病毒鸭胚化弱毒GD株(购自中国兽医药品监察所)E_20-7代毒。GPVGD株病毒含量测定方法为：将毒种10倍系列稀释，取10^-4、10^-5、10^-63个稀释度，每一稀释度尿囊腔接种8～10日龄鸭胚5个，每胚0.3毫升，置37～37.5摄氏度继续孵育，观察72～124小时(在这个时间内死亡的鸭胚均记录作为计算ELD₅₀的依据)，记录死亡情况，死胚全身皮肤充血，翅尖、趾、胸部毛孔、颈、喙旁、背部、后脑有明显出血，头部皮肤和下颌水肿，按照Reed-Muench法(殷震，刘景华主编.《动物病毒学》.北京：科学出版社，1997，第二版)计算其半数致死量ELD₅₀，每0.3毫升病毒含量≥10^4.5ELD₅₀。

鸭胚：未免疫8～10日龄鸭胚(购自吉林省农科院)。

2、生产用毒种的制备和鉴定

1)毒种繁殖：小鹅瘟病毒鸭胚化弱毒GD株E_20-7代毒，用灭菌生理盐水作10倍稀释，尿囊腔接种8～10日龄健康未免疫鸭胚，每胚0.2毫升，接种后密封针孔，置37摄氏度继续孵育，不必翻蛋，选择96～216小时之间死亡的鸭胚，经冷冻后收取胚液(尿囊液及羊水)，每若干个胚为1组，再继代2代。

2)毒种鉴定：按基础毒种鉴定项目(《中华人民共和国兽用生物制品规程》2000年版：243～245页)进行，合格即为生产用毒种。

生产用毒种制备及检验结果见表1。从表1可见，生产用毒种符合基础毒种的标准。

表1.生产用毒种制备及检验结果

3、制苗用毒液繁殖和检验

1)接种

用灭菌生理盐水对步骤2获得的合格生产用毒种作10倍稀释，尿囊腔接种8～10日龄健康未免疫鸭胚，每胚0.2毫升，接种后密封针孔，置37摄氏度继续孵育，不必翻蛋；

2)收获及保存

接种后鸭胚，弃去96小时以前死胚，96小时后，每4～8小时照蛋1次，在96～216小时内死亡的鸭胚随时取出，气室向上直立于2～8摄氏度冷却6～12小时，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌收取鸭胚液(尿囊液和羊水)，每若干个胚液混为1组，置于灭菌瓶中。

3)制苗毒液的检验

无菌检验：按2000年版《中华人民共和国兽用生物制品规程》第448页方法进行。

病毒含量测定：方法见2000年版《中华人民共和国兽用生物制品规程》第243～245页。

制苗用毒液的制备及检验结果如表2所示，从表2可见，生产用毒种接种鸭胚，制备制苗用胚液共计2100毫升，检验结果符合中间品检验的标准。

表2.制苗用毒液制备及检验结果

4、胚液灭活与灭活检验

1)小鹅瘟病毒胚液灭活条件的优化

作为灭活疫苗，灭活是关键的步骤，灭活不好会有散毒的危险，将给养殖业和环境带来危害。因此我们对实验对照用小鹅瘟、鹅副粘病毒病油乳剂灭活单苗及小鹅瘟、鹅副粘病毒病油乳剂二联灭活疫苗进行甲醛灭活条件的优化研究。

将步骤3获得的接种后收集并检测合格的胚液进行甲醛灭活浓度梯度、灭活时间优化实验。实验设置如表3所示，将收获的鸭胚液以4层纱布及一层细铜纱网滤过，分别按终浓度如表3所示的量加入甲醛，密封，充分震荡混匀后，置于37摄氏度灭活24小时，每2小时摇振1次。每12小时取出部分进行灭活检验。

灭活检验：取8日龄易感鸭胚，每组10枚，每组胚接种上述各组灭活处理得到的灭活鸭胚液0.2毫升，自72小时后每12小时照蛋1次，至196小时全部拣出，死胚应不超过1/10，且剖检死、活鸭胚病毒无特异性病痕，判为灭活完全。

结果如表3所示，结果显示，GPV GD株制苗毒液，用终浓度为0.30％(体积百分比浓度)甲醛灭活36小时、用终浓度为0.35％(体积百分比浓度)甲醛灭活24小时、终浓度为0.40％(体积百分比浓度)甲醛灭活24小时、终浓度为0.45％(体积百分比浓度)甲醛灭活12小时，鸭胚死亡1/10(活鸭胚无特异性病痕)达到标准，说明灭活完全；考虑到灭活时间及甲醛残留问题，因此我们采用终浓度为0.35％(体积百分比浓度)甲醛进行灭活。

表3.不同甲醛浓度和灭活时间对GPV GD株制苗毒液灭活的影响

按终浓度为3.5％(体积百分比浓度)的量在上述获得胚液中加入40％甲醛溶液，37摄氏度，24小时，可完全灭活。制苗用毒液的灭活和灭活检验见表4。

表4.制苗用毒液灭活检验结果

二、鹅副粘病毒病灭活苗的制备

1材料

鹅副粘病毒强毒株GPMV NA-1株(吉林大学畜牧兽医学院传染病教研室分离鉴定，参见文献：①徐明，丁壮，毕玉海，李志杰，常爽，黄海楠，宋子运，尹仁福，杜眉.基因VII型鹅副粘病毒NA-1株全基因组的克隆及特性分析.中国兽医学报，2006，26(6)：610～618.②王学理，武迎红，丁壮.鹅源禽副粘病毒NA-1株生物学特性的研究.吉林农业大学学报，2006，28(1)：93～97.)E₀₇代基础毒种，每0.1毫升含毒10^7.5ELD₅₀。

GPMV NA-1株病毒含量测定

将毒种10倍系列稀释，取10^-7、10^-8、10^-93个稀释度，每一稀释度尿囊腔接种11日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.1毫升，置37摄氏度继续孵育，记录24～72小时死亡情况，死胚全身皮肤充血，翅尖、趾、胸部毛孔、颈、喙旁、背部、后脑有明显出血，同一稀释度死胚液等量混合，测定血凝价，以1∶160(微量法1∶128)判为感染，按照Reed-Muench法计算其半数致死量ELD₅₀，每0.1毫升病毒含量≥10^7.5ELD₅₀。

SPF鸡胚：9～11日龄，购自山东省农科院。

2、生产用毒种的制备和鉴定

1)毒种繁殖：将GPMV NA-1 E₀₇代毒用生理盐水作1000倍稀释，尿囊腔内接种11日龄SPF鸡胚，每胚0.1毫升，接种后密封针孔，置36～37摄氏度继续孵育，不必翻蛋，选择24～48小时之间死亡且病痕明显的SPF鸡胚，冷却后分别收获鸡胚液，将对1％鸡红细胞凝集价≥1∶512(微量法)的鸡胚液混合，定量分装于疫苗瓶中。再继代2代。

2)毒种鉴定按基础毒种鉴定项目(《中华人民共和国兽用生物制品规程》2000年版：243～245页)进行，合格即为生产用毒种。

生产用毒种制备及检验结果见表5，从表5可见，制备的生产用毒种符合基础毒种的标准。

表5.生产用毒种制备及检验结果

3、制苗用毒液繁殖与检验

1)接种

用灭菌生理盐水对步骤2获得的合格生产用毒种作10^-5稀释，尿囊腔内接种11日龄SPF鸡胚，每胚0.1毫升，接种后密封针孔，置37摄氏度继续孵育，不必翻蛋。

2)收获及保存

接种后鸡胚，每日照蛋1次，24小时前死亡鸡胚弃去，此后每4～6小时照蛋1次，死亡的鸡胚随时取出，直至120小时，取出的死亡鸡胚，气室向上，置2～8摄氏度冷却4～24小时，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌手术收取鸡胚液(尿囊液及羊水)，若干胚液混为1组，置于灭菌瓶中。

3)制苗用毒液检验

无菌检验：按《中国兽药典》附录15页进行。

病毒含量测定：按《中国兽药典》附录26页进行。

制苗毒液的制备及检验结果如表6所示，从表6可见，生产用毒种接种SPF鸡胚，制备制苗用鸡胚毒液1520毫升，检验结果，符合中间品检验的标准。

表6.制苗用毒液制备及检验结果

4、鹅副粘病毒胚液的灭活及灭活检验

作为灭活疫苗，灭活是关键的步骤，灭活不好会有散毒的危险，将给养殖业和环境带来危害。因此我们对实验对照用小鹅瘟、鹅副粘病毒病油乳剂灭活单苗及小鹅瘟、鹅副粘病毒病油乳剂二联灭活疫苗进行甲醛灭活条件的优化研究。

将步骤3获得的接种后收集并检测合格的鸡胚液进行甲醛灭活浓度梯度、灭活时间优化实验。实验设置如表7所示，将收获的鸡胚液以4层纱布及一层细铜沙网滤过，终浓度如表7所示的量加入甲醛，密封，充分震荡混匀后，置于37摄氏度灭活24小时，每2小时摇振1次。每12小时取出部分进行灭活检验。

灭活检验：取11日龄SPF鸡胚，每组10枚，每组每枚鸡胚分别接种上述各组灭活处理得到的灭活鸡胚液0.2毫升，每日照蛋2次，观察5日，鸡胚8小时特异死亡不应超过1个，所有鸡胚液均测红细胞凝集价(《中国兽药典》附录28页)，均不出现血凝，判为灭活完全。

结果如表7所示，结果显示，GPMV NA-1株制苗毒液，用终浓度为0.30％(体积百分比浓度)甲醛灭活36小时、终浓度为0.35％(体积百分比浓度)甲醛灭活24小时、终浓度为0.40％(体积百分比浓度)甲醛灭活24小时、终浓度为0.45％(体积百分比浓度)甲醛灭活12小时，鸡胚特异死亡不超过1个，所有鸡胚液均测红细胞凝集价，均不出现血凝，判为灭活完全。考虑到灭活时间及甲醛残留问题，因此我们采用终浓度0.35％(体积百分比浓度)甲醛进行灭活。

表7.不同甲醛浓度和灭活时间对GPMV NA-1株制苗毒液灭活的影响

按终浓度为0.35％(体积百分比浓度)的量在上述获得胚液终加入40％(体积百分比浓度)甲醛溶液，37摄氏度，24小时，可完全灭活。制苗用毒液的灭活和灭活检验见表8。

表8.制苗用毒液灭活检验结果

三、小鹅瘟病毒病、鹅副粘病毒病二联油乳剂灭活苗的制备

1、灭活制苗用毒液制备及检验结果

按照步骤一的方法制备小鹅瘟制苗用毒液(表9中GD)，按照步骤二的方法制备鹅副粘病毒病制苗用毒液(表9中NA-1)，毒种繁殖代数，接种胚数、毒种鉴定、毒价测定如表9所示。分别按照步骤一或步骤二中的步骤4的方法对小鹅瘟制苗用毒液和鹅副粘病毒病制苗用毒液进行灭活。制苗用毒液的灭活和灭活检验，均灭活完全。

表9.制苗用毒液制备及检验结果

2、二联苗油乳剂灭活苗的制备

1)油相制备：取注射用白油(购自北京石油化工科学院)94体积份，加司本-80(购自上海大众制药厂)6体积份，混合后，加硬脂酸铝(购自天津天大化工实验厂)使其浓度为0.02克/毫升，随加随搅拌至透明为止，121.3摄氏度高压灭菌30分钟备用。

2)水相制备：取吐温-80(购自上海大众制药厂)4体积份，装入带玻璃球的瓶中灭菌，冷却后加入灭活胚液[灭活鸡胚液(步骤1制备的灭活鹅副粘病毒病制苗用毒液)和灭活鸭胚液(步骤1制备的灭活小鹅瘟制苗用毒液)4∶2.5～4∶3的体积份数比混合]96体积份，充分振摇，使吐温-80完全溶解。

3)乳化：取上述制备的油相，放入乳剂缸内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入上述制备的水相中，加完后以10000转/分钟搅拌5分钟，制成二联油乳剂灭活苗。

4)分装：定量分装，加盖密封。

按照上述二联油乳剂灭活苗的具体配制见表10。

表10.二联油乳剂灭活苗配制

上述制备的各批次二联苗油乳剂灭活苗的进行如下所述检测：

观察物理性状：外观为乳白色乳剂。剂型为油包水型。

粘度检测：用1毫升吸管(下口内径1.2毫米，上口内径2.7毫米)，吸取25摄氏度左右的疫苗1毫升，令其垂直自然流出，结果表明上述各批次二联苗油乳剂灭活苗记录流出0.4毫升所需时间均为6秒以内。

无菌检验：按《中国兽药典》附录15页进行，结果表明上述制备的二联疫苗均无菌生长。

安全检验：上述5批疫苗分别用10只易感母鹅，每只肌肉注射表10所述各批疫苗2毫升(含4羽份)，观察14日，结果不出现由疫苗引起的任何局部和全身反应。

甲醛残留量测定：按《中国兽药典》附录25页进行，符合《兽用生物制品通则的规定》。

稳定性：在2～8摄氏度保存1年，均不出现分层和破乳现象。

效力检验：

1)取健康成年母鹅，各肌注上述制备的各批疫苗(注射量如表11所示)，隔离饲养14日，均正常。20日采血，每份血取适量，按《中国兽药典》附录27页方法，测抗GPV中和抗体效价，中和指数均应≥10^1.8；每份血取适量，按《中国兽药典》附录28页方法，测抗GPMV血凝抑制(HI)抗体，HI均应≥5log2(见表11)。

2)取母鹅免疫3周所产的蛋，孵出的雏鹅10只，隔离饲养7日，均正常。7日采血，每份血取适量，按《中国兽药典》附录27页方法，测抗GPV中和抗体效价，中和指数应≥10^1.8；每份血取适量，按《中国兽药典》附录28页方法，测抗GPMV血凝抑制(HI)抗体，HI均应≥5log2(见表12)。

表11.母鹅效力试验结果

从表11可见，能使母鹅90％保护的二联苗最小剂量为0.25毫升，0.25毫升疫苗免疫母鹅，免后20天，母鹅抗GPV中和抗体的中和指数≥10^1.8，抗GPMV HI≥5log2，三批疫苗的试验，证明了此数据的稳定性。从表中亦发现，在一定范围内，疫苗剂量增加，抗体效价亦随之升高，攻毒保护率亦提高。因此，在效力试验中，只测抗体效价，免去攻毒是可行的。

表12.免疫母鹅后代效力试验结果

从表12可见，用1各使用剂量(0.5毫升)免疫母鹅，免后21天所产的蛋孵化出的7日龄雏鹅，抗GPV抗体效价中和指数显著高于10^1.8，抗GPMV HI效价显著高于5log2，攻毒保护率均≥9/10，说明免疫成年母鹅能将抗体通过卵黄传至后代，其水平比产蛋时的母鹅抗体水平为高。三批疫苗的试验稳定性，在雏鹅的效力试验中得到了证实。通过检测雏鹅的母源抗体水平的疫苗效力试验，亦可以免去攻毒。

实施例2、小鹅瘟病毒病、鹅副粘病毒病二联油乳剂灭活苗的效果检测

一、小鹅瘟、鹅副粘病毒病二联灭活疫苗田间试验报告

在完成二联灭活苗的实验室试验后，用检验合格的四批实验室制品进行了田间试验，观察在生产条件下，二联苗的安全性和效力。

1材料

疫苗：实施例1制备的批号00201、00202、00203、00301的小鹅瘟、鹅副粘病毒病二联灭活疫苗。

免疫种鹅：选4个试验场点分别是：

赤峰市莱茵特鹅业有限公司            500只

白城市畜牧兽医工作总站              500只

梅河口市畜牧兽医工作总站            1000只

吉林市龙潭区江北乡畜牧兽医工作站    1000只

免疫前临床检查 观察种鹅表现，剔除病鹅。

2、田间效力试验

1)免疫接种：实施例1制备的批号00201、00202、00203、00301小鹅瘟、鹅副粘病毒病二联灭活疫苗分别对上述4个试验场点的母鹅胸部肌注1羽份(0.5毫升)(具体分组如表14所示)。

2)接种后观察：14天内每天观察动物的局部和全身反应，如局部红肿、麻痹症状。如有应查明原因，必要时病理剖检。

3)田间效力试验：从各试验场于免疫后14日和120日，分别随机从免疫鹅群中和非免疫鹅群中各抽检10份血清，按试行规程效力检验方法，测抗GPMV HI和抗GPV中和抗体。从免疫母鹅免后20天或非免疫母鹅(对照)产蛋孵化的7日龄雏鹅中，分别随机抽检10份血清(未免疫母鹅的7日龄后代，亦抽检10份血清)，同样测GPMV HI抗体和抗GPV中和抗体。

其中，免疫及非免疫母鹅和它们的所产雏鹅血清抗体效价检测方法如下所述：

抗GPV中和抗体效价检测：

取GPV GD毒种，作10倍系列稀释，分装到两列无菌试管中，第一列加等量健康鹅血清(对照组)，第二列加等量待检血清(试验组)，混合后放置1小时，然后每组分别接种SPF鸡胚5枚，每胚0.6毫升(其中毒液0.3毫升)，置37摄氏度继续孵育，记录24～72小时死亡情况，死胚全身皮肤充血，翅尖、趾、颈、背部等有明显出血，头部皮肤和下颚水肿，按照Reed-Muench法计算其半数致死量(ELD₅₀)，求得中和指数。

抗GPMV HI抗体效价检测(微量血凝抑制试验)

取待检血清，用生理盐水作依次进行2、2²、2³、2⁴、2⁵、2⁶、2⁷、2⁸倍稀释。稀释法如表13所示：

表13.血清稀释方法示意

取GPMV，红细胞凝集试验(HA)(《中国兽药典》附录28页)，测HA效价，配制4HAU的工作液，每孔中加入25微升，充分振荡后，在37摄氏度作用15分钟。

制备1％鸡红细胞悬液(《中国兽药典》附录30页)。在各孔中，再加入1％鸡红细胞悬液，置20～30摄氏度，20～40分钟后判定结果。

设1％鸡红细胞悬液(生理盐水50微升+1％鸡红细胞悬液25微升)对照，并设4HAU病毒液(4HAU病毒液25微升+生理盐水25微升+1％鸡红细胞悬液25微升)对照。

结果判定：能使鸡红细胞凝集被安全抑制的被检血清的最高稀释度即为被检血清的HI效价。

免疫母鹅田间效力试验结果如表14所示。

表14.田间效力试验结果

注：对照组检查结果未列入表中。

从表14可见，4个试验场免疫种鹅，免后14天和120天，随机采血测两种抗体效价，均高于最低抗体保护效价。说明二联苗对生产条件下种鹅的免疫效果是确实的。这在其后代的抗体检测中得到了进一步的证实，见表15。

从表15可见，用1羽份(0.5ml)二联苗免疫生产条件下的种鹅，母鹅免后20日产蛋孵化的7日龄雏鹅，两种病毒的抗体效价明显高于最低抗体保护效价。

表15.免疫母鹅后代效力检测结果

田间安全试验结果如表16所示，从表16可见，1羽份(0.5ml)二联苗免疫生产条件下的种鹅，从临诊症状、局部表现、14天抽样剖检，均证明是安全的。产蛋率及产蛋孵化雏鹅的成活率，都在正常范围之内。因此，二联苗对种鹅是安全的。

表16.田间安全试验结果

上述田间安全试验证实，二联苗对种鹅是安全的，对产蛋率、雏鹅成活率影响甚微。

田间效力试验结果表明二联苗能使免疫鹅产生抵抗两种病毒的抗体效价水平，其孵化后代亦具有坚强抵抗两种病毒的抗体效价水平。

母鹅的免疫期为150天，本试验测120日抗体水平，提示母鹅应在120日前后进行下一个免疫期的预防注射。

免疫母鹅产蛋孵化后代的成活率为95％～98％(用户观察统计)，其2％～5％的未成活数大都系自然淘汰数和非特异死亡数。

安全有效的二联苗，可进行中间试制和区域试验。

二、小鹅瘟、鹅副粘病毒病二联灭活疫苗中间试制报告

小鹅瘟、鹅副粘病毒病二联灭活苗在田间试验完成后，由吉林省五星动物保健药厂生物制品车间中间试制。中间试制的五批产品，用以进行区域试验。并确定二联苗实验室生产工艺可否适用工厂化生产。

生产用毒种制备方法和检验方法同实施例1，生产用毒种制备及检验结果如表17所示，从表17可见两种毒种均继3代，经鉴定，均符合基础毒种的标准，可做为生产用毒种使用，用以制备制苗用毒液。

表17.生产用毒种制备及检验结果表

制苗用毒液的繁殖及检验方法同实施例1，制苗用毒液的繁殖及检验结果如表18所示，从表18可见，用繁殖的3代生产用毒种制备的制苗毒液，符合中间品检验标准。共繁殖制苗用毒液：GPMV NA-1株72000毫升，GPV GD株47000毫升。

表18.制苗用毒液的繁殖及检验

制苗用毒液的灭活和灭活检验如实施例1所示，制苗用毒液的灭活和灭活检验结果见表19，从表19可见，按胚液量的0.35％加入40％的甲醛溶液，37摄氏度24小时均可完全灭活两种病毒液。

表19.制苗用毒液的灭活和灭活检验

二联油乳剂灭活苗的制备同实施例1，具体配制如表20，从表20可见，将制苗灭活毒液按照实验室配制二联油乳剂灭活疫苗的工艺，配制了五批二联灭活苗，每羽份0.5毫升，共48万羽份。

表20.二联油乳剂灭活苗的配制

3.5二联苗的效力和安全性检验结果

按照实施例1和实施例2的步骤一的方法对上述五批二联苗进行表21～表25中各项目检测，均由中间试制单位-吉林省五星动物保健药厂质检室进行检验，结果详见“检验报告单”(表21～表25)。五批产品均检验合格，可用于扩大的区域试验。五批二联苗的中间试制，证明二联苗的生产工艺可行，适合于工厂化生产，生产的五批二联苗均符合试行规程的质量标准。

表21.00301车间成品检验报告单01

表22.00302批车间成品检验报告单

表23.00303车间成品检验报告单

表24.车间成品检验报告单

表25.车间成品检验报告单