具有增加的L－赖氨酸生产力的棒状杆菌和使用其生产L－赖氨酸的方法

实施发明的最佳方式

[46]通过下述实施例可以获得对本发明更好的理解，这些实施例被阐述以举例说明本发明，而不被解释为对本发明的限制。

[47]

[48]实施例1：用于核靶向基因的载体pDZ的构建和使用该载体插入基因

[49]基于大肠杆菌(E.coli)克隆载体pACYC177(New EnglandBiolab，GenBank登录号X06402)，如下构建携带棒状杆菌染色体的重组载体pDZ。

[50]使用Klenow酶使得用AcuI和BanI限制性酶处理得到的pACYC177载体消化物变成平端。对于用作选择标记，如下制备大肠杆菌的lacZ基因：通过PCR从大肠杆菌K12 W3110的核DNA进行基因扩增，设计成含有其启动子，然后进行5′末端磷酸化作用，并用T4 DNA聚合酶或多核苷酸激酶产生平端。这两个DNA片段被相互连接以得到环状DNA分子，然后将含有许多限制性位点的人工合成的接头插入环状DNA分子的限制性位点BamHI，以构建核靶向到棒状杆菌的基因的载体pDZ。图1是显示载体pDZ的示意图，所述载体用于将基因核靶向到棒状杆菌。

[51]之后，感兴趣基因被插入棒状杆菌的核DNA。为达到这一目的，谷氨酸棒状杆菌KFCC10881——L-赖氨酸生产菌株，通过电穿孔用含有两个串联的感兴趣基因的拷贝的pDZ载体转化(使用Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52：541-545的电脉冲方法)，并在含有25mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化体，其中感兴趣基因由于同源性被插入到染色体中。在含有X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)的固体培养基上出现蓝色表明成功地用载体将基因插入核DNA。将最初的核插入菌株振荡培养在营养肉汤中(30℃，8小时)，然后从10^-4连续稀释至10^-10，之后涂布在含有X-gal的固体培养基上。生长的大部分的克隆染有蓝色。选择白色克隆，其是生长的克隆的少数。这些二次选择的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列，因为它通过交换从基因组除去。最后测试这些菌株对卡那霉素的敏感性，并在最终选择之前通过PCR分析基因结构。

[52]

[53]实施例2：通过突变制备产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌(KFCC-10881)

[54]要插入负责赖氨酸生物合成途径的基因的菌株以谷氨酸棒状杆菌(KFCC-10881)为基础，谷氨酸棒状杆菌(KFCC-10881)对S-(2-氨乙基)半胱氨酸(S-(2-aminoethyl)cysteine，以后称为“AEC”)具有抗性，并且是高丝氨酸渗漏型的(homoserine-leaky)。

[55]从野生型谷氨酸棒状杆菌(ATCC13032)制备突变体菌株KFCC-10881。含有10⁷～10⁸细胞/ml浓度母株的培养基用500μg/ml的诱变剂N-甲基-N′-硝基-N-硝基胍(N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine，之后称为“NTG”)在30℃处理30min，然后选择在含有5g/l AEC的复合板上生长的克隆。分析初级突变体菌株的ACE抗性和赖氨酸生产力后，用NTG进行次级突变。将由此形成的许多克隆用牙签挑入基本培养基，该基本培养基补充或不补充高丝氨酸以分离高丝氨酸营养缺陷型(次级突变体)，高丝氨酸营养缺陷型不能在缺少高丝氨酸的基本培养基上生长。使高丝氨酸营养缺陷型进行三级突变，以产生高丝氨酸-渗漏型菌株，其通过在含有10mg/L高丝氨酸的基本培养基中温育进行鉴定。检查在培养基中生长的菌株的赖氨酸生产力(表1)。得到的产赖氨酸菌株——其是AEC抗性的以及高丝氨酸渗漏的，保藏在韩国联邦菌物保藏中心(Korean Federation of Culture Collection)，登录号为KFCC-10881。在本实施例中使用的基本培养基和生产培养基描述如下。

[56]表1

[57]

[58]基本培养基(pH 7.0)

[59]葡萄糖100g、(NH₄)₂SO₄ 40g、大豆蛋白2.5g、玉米浸泡固体5g、尿素3g、KH₂PO₄ 1g、MgSO₄ 7H₂O 0.5g、生物素100μg、氯化硫胺素1000□、泛酸钙2000□、烟酰胺3000□、CaCO₃ 30g(于1升蒸馏水中)。

[60]生产培养基(pH 7.0)

[61]葡萄糖100g、(NH₄)₂SO₄ 40g、大豆蛋白2.5g、玉米浸泡固体5g、尿素3g、KH₂PO₄ 1g、MgSO₄ 7H₂O 0.5g、生物素100□、氯化硫胺素1000□、CaCO₃ 30g(于1升蒸馏水中)。

[62]

[63]实施例3：产赖氨酸谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-衍生的aspB基因的克隆，重组载体(pDZ-2aspB)的构建和固着aspB的菌株的制备

[64]对参与赖氨酸生物合成途径的aspB基因进行PCR，用实施例2中制备的产赖氨酸的PCR谷氨酸棒状杆菌KFCC10881的核DNA作为模板。从NIH GenBank数据获得关于aspB基因的碱基序列(NCBI登记号NC_003450，Ncgl0237)的信息，并用于设计两对引物，以扩增范围从启动子区域到终止密码子的aspB基因(表2)。

[65]表2

[66]

[67]使用谷氨酸棒状杆菌KFCC10881的核DNA作为模板以及使用一组寡核苷酸SEQ ID NOS.1和2或寡核苷酸SEQ ID NOS.3和4作为引物，在PfuUltra^TM高保真性DNA聚合酶(Stratagene)存在下进行PCR，进行如下30个循环：96℃变性30秒，53℃退火30秒，72℃延伸2分钟。发现由此获得的PCR产物是两种类型的aspB基因(aspB-A和aspB-B)，每一种含有1,493bp-长的启动子区域，其分别用一组SEQ IDNOS.1和2以及一组SEQ ID NOS.3和4产生。在TOPO克隆试剂盒(TOPO Cloning Kit)(Invitrogen)帮助下，将PCR产物克隆进大肠杆菌载体pCR2.1，以得到重组载体pCR-aspB-A和pCR-aspB-B。这些pCR载体分别用对aspB-A和aspB-B的相反端特异的限制性酶(aspB-A：SmaI+HindIII、aspB-B：HindIII+NheI)处理，以从pCR载体分离aspB基因。这些片段通过3-片连接(3-piece ligation)克隆入pDZ载体的EcoRV-NheI位点，以产生重组载体pDZ-2aspB，其中克隆有串联的两个aspB拷贝。图2是核靶向入棒状杆菌的基因的pDZ-2aspB载体的图谱。

[68]重组载体pDZ-2aspB被转化入实施例2中制备的产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881中，然后通过交换在核DNA中紧靠aspB基因插入另外的aspB基因拷贝，以产生固着有两个aspB基因拷贝的产赖氨酸的菌株，命名为谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CJ1。使用引物对SEQID NOS.17和18(表3)，通过PCR证实两个aspB基因拷贝的相邻定位，引物对SEQ ID NOS.17和18设计用于扩增两个aspB基因拷贝之间的接触区域。

[69]表3

[70]

[71]实施例4：产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-衍生的lysC/asd基因的克隆，重组载体(pDZ-2lysC/asd)的构建和固着lysC/asd的菌株的制备

[72]从NIH GenBank的数据获得关于lysC/asd基因的碱基序列(NCBI登记号NC_003450，Ncgl0247～0248)的信息，并用于设计两对引物，以扩增从启动子区域到终止密码子的aspB基因(表4)，方式同实施例3。

[73]表4

[74]

[75]使用谷氨酸棒状杆菌KFCC10881的核DNA作为模板以及使用一组寡核苷酸SEQ ID NOS.1和2或寡核苷酸SEQ ID NOS.3和4作为引物，在PfuUltra^TM高保真性DNA聚合酶(Stratagene)存在下进行PCR，进行如下30个循环：在96℃变性30秒，在52℃退火30秒，在72℃延伸3分钟。

[76]发现由此获得的PCR产物是两种类型的lysC/asd基因：lysC/asd-A和lysC/asd-B，每一种含有2,805bp-长的启动子区域，其分别用一组SEQ ID NOS.5和6以及一组SEQ ID NOS.7和8产生。在TOPO克隆试剂盒(TOPO Cloning Kit)(Invitrogen)帮助下，将PCR产物克隆进大肠杆菌载体pCR2.1，以得到重组载体pCR-lysC/asd-A和pCR-lysC/asd-B。

[77]这些pCR载体分别用对lysC/asd-A和lysC/asd-B的相反端特异的限制性酶(lysC/asd-A：BamHI+SmaI，lysC/asd-B：SmaI+PvuI)处理，以从pCR载体分离lysC/asd基因。这些片段通过3-片连接反应克隆入pDZ载体的BamHI-PvuI位点，以构建重组载体pDZ-2lysC/asd，其中克隆有串联的两个lysC/asd拷贝。图3是核靶向入棒状杆菌的基因的pDZ-2lysC/asd载体的图谱。

[78]重组载体pDZ-2lysC/asd被转化入实施例3中制备的产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CJ1中，然后通过交换在核DNA中紧靠lysC/asd基因插入另外的lysC/asd基因拷贝，以产生固着有两个lysC/asd基因拷贝的产赖氨酸的菌株，命名为谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CJ2。使用一组引物(表5)，通过PCR鉴定两个aspB基因拷贝的相邻定位，所述一组引物设计用于扩增两个aspB基因拷贝之间的接触区域。

[79]表5

[80]

[81]实施例5：产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-衍生的dapA/dapB基因的克隆，重组载体(pDZ-2dapA/dapB)的构建和固着有dapA/dapB的菌株的制备

[82]从NIH GenBank的数据获得关于dapA/dapB基因的碱基序列(NCBI登记号NC_003450，Ncgl1896～1898)的信息。dapA基因被确定包含dapB基因和具有位于它们之间的功能未知的ORF(Ncgl1897)的操纵子。信息被用于设计两对引物，以扩增范围从dapB启动子到终止密码子的全dapB-ORF(Ncgl1897)-dapA基因(表6)。

[83]表6

[84]

[85]使用谷氨酸棒状杆菌KFCC10881的核DNA作为模板以及使用一组寡核苷酸SEQ ID NOS.9和10或寡核苷酸SEQ ID NOS.11和12作为引物，在PfuUltra^TM高保真性DNA聚合酶(Stratagene)存在下进行PCR，进行如下30个循环：96℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸3分钟。

[86]发现由此获得的PCR产物是两种类型的dapA/dapB基因：dapA/dapB-A和dapA/dapB-B，每一种含有3,210bp-长的启动子区域，其分别用一组SEQ ID NOS.9和10以及一组SEQ ID NOS.11和12产生。在TOPO克隆试剂盒(Invitrogen)帮助下，将PCR产物克隆进大肠杆菌载体pCR2.1，得到重组载体pCR-dapA/dapB-A和pCR-dapA/dapB-B。

[87]这些PCR载体用对dapA/dapB-A和dapA/dapB-B的相反端特异的相应限制性酶(dapA/dapB-A：EcoRI+SacI，dapA/dapB-B：SacI+XhoI)处理，以从PCR载体分离dapA/dapB基因。这些片段通过3-片连接(3-pieceligation)克隆入pDZ载体的EcoRI-XhoI位点，以构建重组载体pDZ-2dapA/dapB，其中克隆有串联的两个dapA/dapB拷贝。图4是pDZ-2dapA/dapB载体的图谱。

[88]重组载体pDZ-2dapA/dapB被转化入实施例4中制备的产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-CJ2中，然后通过交换在核DNA中紧靠dapA/dapB基因插入另外的dapA/dapB基因拷贝，以产生固着有两个dapA/dapB基因拷贝的产赖氨酸的菌株，命名为谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CJ3。使用一组引物对(表7)，通过PCR鉴定两个dapA/dapB基因拷贝的相邻定位，所述一组引物设计成扩增两个dapA/dapB基因拷贝之间的接触区域。

[89]表7

[90]

[91]实施例6：产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-衍生的lysA基因的克隆，重组载体(pDZ-2lysA)的构建和固着lysA的菌株的制备

[92]从NIH GenBank数据获得关于lysA基因的碱基序列(NCBI登记号NC_003450，Ncgl1132～1133)的信息。经分析，lysA基因包含argS基因(精氨酰-tRNA合成酶)和操纵子。该信息被用于设计两对引物，以扩增范围从argS启动子到终止密码子的全argS-lysA基因(表8)。

[93]表8

[94]

[95]使用谷氨酸棒状杆菌KFCC10881的核DNA作为模板以及使用一组寡核苷酸SEQ ID NOS.13和14或寡核苷酸SEQ ID NOS.15和16作为引物，在PfuUltra^TM高保真性DNA聚合酶(Stratagene)存在下进行PCR，进行如下30个循环：96℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸4分钟。

[96]发现由此获得的PCR产物是两种类型的argS/lysA基因：argS/lysA-A和argS/lysA-B，每一种含有3,359bp-长的启动子区域，其分别用一组SEQ ID NOS.13和14以及一组SEQ ID NOS.15和16产生。在TOPO克隆试剂盒(Invitrogen)帮助下，将PCR产物克隆进大肠杆菌载体pCR2.1，得到重组载体pCR-argS/lysA-A和pCR-argS/lysA-B。

[97]这些pCR载体用对argS/lysA-A和argS/lysA-B的相反端特异的相应限制性酶(argS/lysA-A：HindIII+NotI，argS/lysA-B：NotI+XbaI)处理，以从PCR载体分离argS/lysA基因。这些片段通过3-片连接克隆入pDZ载体的HindIII-XbaI位点，以构建重组载体pDZ-2lysA，其中克隆有串联的两个argS/lysA拷贝。图5是pDZ-2lysA载体的图谱。

[98]重组载体pDZ-2lysA被转化入实施例5中制备的产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-CJ3中，然后通过交换在核DNA中紧靠lysA基因插入另外的lysA基因拷贝，以产生固着有两个lysA基因拷贝的产赖氨酸的菌株，命名为谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CJ4。使用一组引物(表9)，通过PCR确定两个lysA基因拷贝的相邻定位，所述一组引物设计成扩增两个lysA基因拷贝之间的接触区域。

[99]表9

[100]

[101]产赖氨酸的菌株谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CJ4——其固着有六个负责体内赖氨酸生物合成的基因，于2006年8月21日保藏在韩国联邦菌物保藏中心，登录号KCCM10770P。

[102]

[103]实施例7：产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-衍生的pycGene的克隆，重组载体(pDZ-2pyc)的构建和固着pyc的菌株的制备

[104]从NIH GenBank数据获得关于pyc基因的碱基序列(NCBI登记号NC_003450，Ncgl0659)的信息，并用于设计两对引物)，以扩增范围从启动子区域到终止密码子的pyc基因(表10)，方式如实施例3。

[105]表10

[106]

[107]使用谷氨酸棒状杆菌KFCC10881的核DNA作为模板以及使用一组寡核苷酸SEQ ID NOS.31和32或寡核苷酸SEQ ID NOS.33和34作为引物，在PfuUltra^TM高保真性DNA聚合酶(Stratagene)存在下进行PCR，进行如下30个循环：96℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸4分钟。发现由此获得的PCR产物是两种类型的pyc基因：pyc-A和pyc-B，每一种含有3,925bp-长的启动子区域，其分别用一组SEQ ID NOS.31和32以及一组SEQ ID NOS.33和34产生。在TOPO克隆试剂盒(Invitrogen)帮助下，将PCR产物克隆进大肠杆菌载体pCR2.1，以得到重组载体pCR-pyc-A和pCR-pyc-B。

[108]这些pCR载体用对pyc-A和pyc-B的相反端特异的相应限制性酶(pyc-A：XbaI和EcoRV，pyc-B：EcoRV和HindIII)处理，以从pCR载体分离pyc基因。这些片段通过3-片连接克隆入pDZ载体的XbaI-HindIII位点，以构建重组载体pDZ-2pyc，其中克隆有串联的两个pyc拷贝。图6是pDZ-2pyc载体的图谱。

[109]重组载体pDZ-2pyc被转化入实施例6中制备的产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-CJ4中，然后通过交换在核DNA中紧靠pycA基因插入另外的pycA基因拷贝，以产生固着有两个pyc基因拷贝的产赖氨酸的菌株，命名为谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CJ5。使用一组引物(表11)，通过PCR确定两个pyc基因拷贝的相邻定位，所述一组引物设计成扩增两个pyc基因拷贝之间的接触区域。

[110]表11

[111]

[112]结果，产赖氨酸的菌株谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CJ5固着有七个参与赖氨酸生物合成的基因。

[113]

[114]实施例8：从固着负责赖氨酸生物合成的基因的菌株生产赖氨酸

[115]培养分别在实施例6和7中制备的产L-赖氨酸菌株谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-CJ4和KFCC-10881-CJ5，以生产L-赖氨酸，如下所述。

[116]将谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881、KFCC-10881-CJ4和KFCC-10881-CJ5接种在含有25ml下述种子培养基的240ml-角挡板瓶(corner baffle flask)中，并于30℃以200rpm振荡培养20小时。然后，将1ml的每一培养物接种入含有24ml下述生产培养基的250ml-角挡板瓶中，并于30℃以200rpm振荡培养120小时。种子培养基和生产培养基包含下面的组合物。

[117]

[118]种子培养基(pH 7.0)

[119]葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、尿素1.5g、KH₂PO₄ 4g、K₂HPO₄ 8g、MgSO₄7H₂O 0.5g、生物素100□、盐酸硫胺素1000□、泛酸钙2000□、烟酰胺2000□(于1升蒸馏水中)。

[120]生产培养基(pH 7.0)

[121]葡萄糖100g、(NH₄)₂SO₄ 40g、大豆蛋白2.5g、玉米浸泡固体5g、尿素3g、KH₂PO₄ 1g、MgSO₄ 7H₂O 0.5g、生物素100□、氯化硫胺素1000□、泛酸钙2000□、烟酰胺3000□和CaCO₃ 30g(于1升蒸馏水中)。

[122]

[123]培养完成后，进行HPLC分析以确定菌株生产的L-赖氨酸的量。谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881、KFCC10881-CJ4和KFCC10881-CJ5培养物中的L-赖氨酸浓度总结在下表12中。

[124]表12

[125]

[126]从表12可见，发现与母株KFCC-10881相比，固着有六个参与赖氨酸生物合成的基因的谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-CJ4增加赖氨酸生产力约7％。而且，测量到与母株KFCC-10881相比，谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-CJ5获得约8％的赖氨酸生产增加，谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-CJ5除了六种赖氨酸生物合成基因外还固着有pyc基因。

[127]

[128]实施例9：固着三个lysC/asd基因拷贝的产赖氨酸谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-衍生菌株的制备

[129]实施例4中制备的重组载体pDZ-2lysC/asd被转化入实施例6中制备的产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CJ4，然后通过交换在核DNA中紧靠两个相邻lysC/asd基因拷贝插入另外的lysC/asd基因拷贝，以产生固着有三个lysC/asd基因拷贝的产赖氨酸菌株，命名为谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CJ6。使用一组引物(表13)，通过PCR确定串联的三个lysC/asd基因拷贝的排列，所述一组引物设计成扩增三个lysC/asd基因拷贝之间的接触区域。

[130]表13

[131]

[132]经发现，产赖氨酸菌株谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CJ6的天冬氨酸激酶活性为KFCC10881-CJ4的2.1倍，这通过根据Pechere J.F.和Capony J.P.(Anal Biochem 22：536-539，1968)使用天冬氨酰异羟肟酸(aspartyl hydroxamate)的方法测量(表14)。

[133]表14

[134]

[135]实施例10：固着三个dapA/dapB基因拷贝的产赖氨酸谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-衍生菌株的制备

[136]实施例5中制备的重组载体pDZ-2dapA/dapB被转化入实施例9中制备的产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CJ6，然后通过交换在核DNA中紧靠两个相邻dapA/dapB基因拷贝插入另外的dapA/dapB基因拷贝，以产生固着有三个dapA/dapB基因拷贝的产赖氨酸菌株，命名为谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CJ7。使用一组引物(表15)，通过PCR确定串联的三个dapA/dapB基因拷贝的排列，所述一组引物设计成扩增三个dapA/dapB基因拷贝之间的接触区域。

[137]表15

[138]

[139]实施例11：从固着负责赖氨酸生物合成的复合基因的菌株生产赖氨酸

[140]培养在实施例10中制备的产L-赖氨酸菌株谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-CJ7，以生产L-赖氨酸，如下所述。

[141]将谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-CJ4和KFCC-10881-CJ7接种在含有25ml下述种子培养基的250ml-角挡板瓶中，并于30℃以200rpm振荡培养20小时。然后，将1ml的每一培养物接种入含有24ml下述生产培养基的250ml-角挡板瓶中，并于30℃以200rpm振荡培养120小时。种子培养基和生产培养基包含下面的组合物。

[142]

[143]种子培养基(pH 7.0)

[144]葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、尿素1.5g、KH₂PO₄ 4g、K₂HPO₄ 8g、MgSO₄ 7H₂O 0.5g、生物素100□、盐酸硫胺素1000□、泛酸钙2000□、烟酰胺2000□(于1升蒸馏水中)。

[145]生产培养基(pH 7.0)

[146]葡萄糖100g、(NH₄)₂SO₄ 40g、大豆蛋白2.5g、玉米浸泡固体5g、尿素3g、KH₂PO₄ 1g、MgSO₄ 7H₂O 0.5g、生物素100□、氯化硫胺素1000□、泛酸钙2000□、烟酰胺3000□、CaCO₃ 30g(于1升蒸馏水中)。

[147]

[148]培养完成后，进行HPLC分析以确定菌株生产的L-赖氨酸的量。谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-CJ4和KFCC-10881-CJ7培养物中的L-赖氨酸浓度总结在下表16中。

[149]表16

[150]

[151]从表16可见，发现与母株KFCC-10881-CJ4相比，参与赖氨酸生物合成的三个基因以三副本方式固着的谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-CJ7增加赖氨酸生产力约11％。

[152]

[153]实施例12：启动子置换载体的构建和置换赖氨酸生物合成基因的外源启动子的菌株的制备

[154]基于pDZ，对于赖氨酸生物合成基因，用外源有效CJ7启动子置换天然启动子。CJ7启动子是强大的、产氨棒状杆菌-衍生的启动子，其具有SEQ ID NOS.44至50表示的碱基。它公开在韩国专利号0620092中，授权给本申请人。当谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881的核lysC在CJ7启动子存在下表达时，发现天冬氨酸激酶活性被提高到使用固有启动子的2倍高。

[155]如下制备将CJ7启动子引入产赖氨酸菌株的核DNA的载体。

[156]首先，用限制性酶XbaI和NdeI处理pDZ载体。在作为引物的SEQ ID NOS.42和43(表17)存在下进行PCR，所述引物设计用于将XbaI和NdeI位点分别插入在PCR产物的5′-和3′-端，所述PCR产物由产氨棒状杆菌的核DNA的CJ7启动子扩增得到。在用XbaI和NdeI处理后，CJ7启动子PCR产物被连接到截短的pDZ载体，以得到pDZ-PCJ7载体，其用作将CJ7启动子引入菌株的核DNA的初级质粒(图7)。

[157]表17

[158]

[159]用实施例2中制备的产赖氨酸菌株谷氨酸棒状杆菌KFCC10881的核DNA作为模板，进行PCR，以获得两种类型的DNA片段，该片段是CJ7启动子置换引入核DNA的基因各自的天然启动子所必需的，也就是从碱基+2起向下游方向延伸的大约300bp长的部分天然启动子片段和大约300bp长的部分ORF。设计这样的用于PCR的引物，以便XbaI位点插入在部分天然启动子片段的PCR产物的相反端，NdeI位点插入在部分ORF的PCR产物的相反端。这些PCR产物用各自的限制性酶处理。pDZ-PCJ7用XbaI消化以连接到部分天然启动子片段的截短的PCR产物，然后用NdeI消化以连接到部分ORF的截短的PCR产物，从而构建重组质粒，分别称为pDZ-PCJ7-aspB、pDZ-PCJ7-lysCasd、pDZ-PCJ7-dapA、pDZ-PCJ7-dapB、pDZ-PCJ7-argSlysA和pDZ-PCJ7-pyc，每一种包含位于两个PCR DNA片段之间的CJ7启动子(图8至13)。

[160]质粒被用于目标基因的重组，如下所述。首先，将重组载体pDZ-PCJ7-aspB转化入产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881，然后在核DNA中aspB基因的启动子区域进行与CJ7启动子的交换。以同样的方式，其它重组质粒被转化以产生新菌株KFCC-10881-PCJ7-5，其中CJ7启动子位于aspB、lysCasd、dapA、dapB和argSlysA基因的启动子区域中。除了启动子，pyc基因的启动子用CJ7启动子置换以产生KFCC-10881-PCJ7-6。

[161]

[162]实施例13：在具有赖氨酸生物合成基因的外源启动子的菌株中生产赖氨酸

[163]培养产L-赖氨酸菌株——谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-PCJ7-5和KFCC-10881-PCJ7-6，以产生L-赖氨酸，如下所述。

[164]将谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881、KFCC-10881-PCJ7-5和KFCC-10881-PCJ7-6接种在含有25ml下述种子培养基的250ml-角挡板瓶中，并于30℃以200rpm振荡培养20小时。然后，将1ml的每一培养物接种入含有24ml下述生产培养基的250ml-角挡板瓶中，并于30℃以200rpm振荡培养120小时。种子培养基和生产培养基包含下面的组合物。

[165]

[166]种子培养基(pH 7.0)

[167]葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、尿素1.5g、KH₂PO₄ 4g、K₂HPO₄ 8g、MgSO₄ 7H₂O 0.5g、生物素100□、盐酸硫胺素1000□、泛酸钙2000□、烟酰胺2000□(于1升蒸馏水中)。

[168]生产培养基(pH 7.0)

[169]葡萄糖100g、(NH₄)₂SO4 40g、大豆蛋白2.5g、玉米浸泡固体5g、尿素3g、KH₂PO4 1g、MgSO₄ 7H₂O 0.5g、生物素100□、氯化硫胺素1000□、泛酸钙2000□、烟酰胺3000□和CaCO₃ 30g(于1升蒸馏水中)。

[170]

[171]培养完成后，进行HPLC分析以确定菌株生产的L-赖氨酸的量。谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881、KFCC-10881-PCJ7-5和KFCC-10881-PCJ7-6培养物中的L-赖氨酸浓度总结在下表18中。

[172]表18

[173]

[174]从表18可见，发现与母株KFCC-10881相比，其中固着有六个参与赖氨酸生物合成的基因和它们各自的外源CJ7启动子的谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-PCJ7-5，以及除了六个基因和启动子外还固着pyc基因和其CJ7启动子的谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-PCJ7-6，分别增加赖氨酸生产力约17.4％和18.6％。

[175]

[176]实施例14：在固着负责赖氨酸生物合成的额外基因和具有其置换的外源启动子的菌株中，赖氨酸生物合成酶的活性

[177]分析分别在实施例6、10和12中制备的产L-赖氨酸菌株——谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CJ4、KFCC10881-CJ7和KFCC-10881-PCJ7-5——的天冬氨酸激酶和二氨基庚二酸二羧化酶活性，这两种酶作为赖氨酸生物合成酶的代表，原因是它们的活性相对容易被测量。对于天冬氨酸激酶活性通过Pechere J.F.和Capony J.P.(AnalBiochem 22：536-539，1968)的方法测量，对于二氨基庚二酸二羧化酶活性通过J.Cremer等人的方法测量，发现与起始母株KFCC10881(表19)相比，修饰的产赖氨酸菌株增加酶活性。

[178]表19

[179]

序列表

<110>CJ株式会社

<120>具有增加的L-赖氨酸生产力的棒状杆菌

     和使用其生产L-赖氨酸的方法

<150>KR1020060089672

<151>2006-09-15

<160>50

<170>KopatentIn 1.71

<210>1

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>aspB扩增的正向引物

<400>1

cccggggcgg ttcagctaga gttatgc                                         27

<210>2

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>aspB扩增的反向引物

<400>2

aagcttttag ttagcgtaat gctccgc                                         27

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>aspB扩增的正向引物

<400>3

aagcttgcgg ttcagctaga gttatgc                                         27

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>aspB扩增的反向引物

<400>4

gctagcttag ttagcgtaat gctccgc                                         27

<210>5

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>lysCasd扩增的正向引物

<400>5

ttgcacggat cccagggtag ttgactaaag                                      30

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>lysCasd扩增的反向引物

<400>6

atggatcccg ggtatcaacg cgtcggtaga                                      30

<210>7

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>lysCasd扩增的正向引物

<400>7

ttgcaccccg ggcagggtag ttgactaaag                                      30

<210>8

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>lysCasd扩增的反向引物

<400>8

atggatcgat cgtatcaacg cgtcggtaga                                      30

<210>9

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>dapAdapB扩增的正向引物

<400>9

gacgaattct cattggcgtt tccggatcc                                       29

<210>10

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>dapAdapB扩增的反向引物

<400>10

tcagagctca caagcgccaa ggaactacc                                       29

<210>11

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>dapAdapB扩增的正向引物

<400>11

tgagagctct cattggcgtt tccggatcc                                       29

<210>12

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>dapAdapB扩增的反向引物

<400>12

tgtctcgaga caagcgccaa ggaactacc                                       29

<210>13

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>argSlysA扩增的正向引物

<400>13

attaagcttt gcatgggcac gtcgatg                                         27

<210>14

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>argSlysA扩增的反向引物

<400>14

attgcggccg ctccacggcg aaggtgaag                                       29

<210>15

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>argSlysA扩增的正向引物

<400>15

attgcggccg ctgcatgggc acgtcgatg                                       29

<210>16

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>argSlysA扩增的反向引物

<400>16

attctagatc cacggcgaag gtgaag                                          26

<210>17

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>17

gcagtggact gtccctgc                                                   18

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>18

cctgcagcga aactgaactc                                                 20

<210>19

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>19

catggcgagg atcccgttag aaatacgctc                                      30

<210>20

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>20

ttcacgccga attcgacaag gcaatcaccg                                      30

<210>21

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>21

aggcatttca ttggca                                                     16

<210>22

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>22

tttgcgtgcc gcagca                                                     16

<210>23

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>23

gagatcagct ggtgtcatgg                                                  20

<210>24

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>24

atccacagcg aactgggcg                                                   19

<210>25

<211>1488

<212>DNA

<213>谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<400>25

gcggttcagc tagagttatg cgaaggatcc cgtgcggcgt ttatcttgtg aactccccca      60

gggcaggaat gcagcaaggg tcagcgagct ctgacgggtg cgcgggatcc cctaaaacgt     120

ctagagtagt ggcttgaggt cactgctctt tttttgtgcc cttttttggt ccgtctattt     180

tgccaccaca tgcggaggta cgcagttatg agttcagttt cgctgcagga ttttgatgca     240

gagcgaattg gtttgttcca cgaggacatt aagcgcaagt ttgatgagct caagtcaaaa     300

aatctgaagc tggatcttac tcgcggtaag ccttcgtcgg agcagttgga tttcgctgat     360

gagttgttgg cgttgcctgg taagggtgat ttcaaggctg cggatggtac tgatgtccgt     420

aactatggcg ggctggatgg catcgttgat attcgccaga tttgggcgga tttgctgggt     480

gttcctgtgg agcaggtctt ggcgggggat gcttcgagct tgaacatcat gtttgatgtg     540

atcagctggt cgtacatttt cggtaacaat gattcggttc agccttggtc gaaggaagaa     600

accgttaagt ggatttgccc tgttccgggc tatgatcgcc atttctccat cacggagcgt     660

ttcggctttg agatgatttc tgtgccaatg aatgaagacg gccctgatat ggatgctgtt     720

gaggaattgg tgaagaatcc gcaggttaag ggcatgtggg ttgttccggt gttttctaac     780

ccgactggtt tcacggtgac agaagacgtc gcaaagcgtc taagcgcaat ggaaaccgca     840

gctccggact tccgcgttgt gtgggataat gcctacgccg ttcatacgct gaccgatgaa     900

ttccctgagg ttatcgatat cgtcgggctt ggtgaggccg ctggcaaccc gaaccgtttc     960

tgggcgttca cttctacttc gaagatcact ctcgcgggtg cgggcgtgtc gttcttcctc    1020

acctctgcgg agaaccgcaa gtggtacacc ggccatgcgg gtatccgtgg cattggccct    1080

aacaaggtca atcagttggc tcatgcgcgt tactttggcg atgctgaggg agtgcgcgcg    1140

gtgatgcgta agcatgctgc gtcgttggct ccgaagttca acaaggttct ggagattctg    1200

gattctcgcc ttgctgagta cggtgtcgcg cagtggactg tccctgcggg cggttacttc    1260

atttcccttg atgtggttcc tggtacggcg tctcgcgtgg ctgagttggc taaggaagcc    1320

ggcatcgcgt tgacgggtgc gggttcttct tacccgctgc gtcaggatcc ggagaacaaa    1380

aatctccgtt tggcaccgtc gctgcctcca gttgaggaac ttgaggttgc catggatggc    1440

gtggctacct gtgtgctgtt ggcagcagcg gagcattacg ctaactaa                 1488

<210>26

<211>1506

<212>DNA

<213>谷氨酸棒状杆菌

<400>26

cagggtagtt gactaaagag ttgctcgcga agtagcacct gtcacttttg tctcaaatat      60

taaatcgaat atcaatatat ggtctgttta ttggaacgcg tcccagtggc tgagacgcat     120

ccgctaaagc cccaggaacc ctgtgcagaa agaaaacact cctctggcta ggtagacaca     180

gtttattgtg gtagagttga gcgggtaact gtcagcacgt agatcgaaag gtgcacaaag     240

gtggccctgg tcgtacagaa atatggcggt tcctcgcttg agagtgcgga acgcattaga     300

aacgtcgctg aacggatcgt tgccaccaag aaggctggaa atgatgtcgt ggttgtctgc     360

tccgcaatgg gagacaccac ggatgaactt ctagaacttg cagcggcagt gaatcccgtt     420

ccgccagctc gtgaaatgga tatgctcctg actgctggtg agcgtatttc taacgctctc     480

gtcgccatgg ctattgagtc ccttggcgca gaagcccaat ctttcacggg ctctcaggct     540

ggtgtgctca ccaccgagcg ccacggaaac gcacgcattg ttgatgtcac tccaggtcgt     600

gtgcgtgaag cactcgatga gggcaagatc tgcattgttg ctggtttcca gggtgttaat     660

aaagaaaccc gcgatgtcac cacgttgggt cgtggtggtt ctgacaccac tgcagttgcg     720

ttggcagctg ctttgaacgc tgatgtgtgt gagatttact cggacgttga cggtgtgtat     780

accgctgacc cgcgcatcgt tcctaatgca cagaagctgg aaaagctcag cttcgaagaa     840

atgctggaac ttgctgctgt tggctccaag attttggtgc tgcgcagtgt tgaatacgct     900

cgtgcattca atgtgccact tcgcgtacgc tcgtcttata gtaatgatcc cggcactttg     960

attgccggct ctatggagga tattcctgtg gaagaagcag tccttaccgg tgtcgcaacc    1020

gacaagtccg aagccaaagt aaccgttctg ggtatttccg ataagccagg cgaggctgcg    1080

aaggttttcc gtgcgttggc tgatgcagaa atcaacattg acatggttct gcagaacgtc    1140

tcttctgtag aagacggcac caccgacatc accttcacct gccctcgttc cgacggccgc    1200

cgcgcgatgg agatcttgaa gaagcttcag gttcagggca actggaccaa tgtgctttac    1260

gacgaccagg tcggcaaagt ctccctcgtg ggtgctggca tgaagtctca cccaggtgtt    1320

accgcagagt tcatggaagc tctgcgcgat gtcaacgtga acatcgaatt gatttccacc    1380

tctgagattc gtatttccgt gctgatccgt gaagatgatc tggatgctgc tgcacgtgca    1440

ttgcatgagc agttccagct gggcggcgaa gacgaagccg tcgtttatgc aggcaccgga    1500

cgctaa                                                               1506

<210>27

<211>1299

<212>DNA

<213>谷氨酸棒状杆菌

<400>27

agttttaaag gagtagtttt acaatgacca ccatcgcagt tgttggtgca accggccagg      60

tcggccaggt tatgcgcacc cttttggaag agcgcaattt cccagctgac actgttcgtt     120

tctttgcttc cccacgttcc gcaggccgta agattgaatt ccgtggcacg gaaatcgagg     180

tagaagacat tactcaggca accgaggagt ccctcaagga catcgacgtt gcgttgttct     240

ccgctggagg caccgcttcc aagcagtacg ctccactgtt cgctgctgca ggcgcgactg     300

ttgtggataa ctcttctgct tggcgcaagg acgacgaggt tccactaatc gtctctgagg     360

tgaacccttc cgacaaggat tccctggtca agggcattat tgcgaaccct aactgcacca     420

ccatggctgc gatgccagtg ctgaagccac ttcacgatgc cgctggtctt gtaaagcttc     480

acgtttcctc ttaccaggct gtttccggtt ctggtcttgc aggtgtggaa accttggcaa     540

agcaggttgc tgcagttgga gaccacaacg ttgagttcgt ccatgatgga caggctgctg     600

acgcaggcga tgtcggacct tatgtttcac caatcgctta caacgtgctg ccattcgccg     660

gaaacctcgt cgatgacggc accttcgaaa ccgatgaaga gcagaagctg cgcaacgaat     720

cccgcaagat tctcggtctc ccagacctca aggtctcagg cacctgcgtc cgcgtgccgg     780

ttttcaccgg ccacacgctg accattcacg ccgaattcga caaggcaatc accgtggacc     840

aggcgcagga gatcttgggt gccgcttcag gcgtcaagct tgtcgacgtc ccaaccccac     900

ttgcagctgc cggcattgac gaatccctcg ttggacgcat ccgtcaggac tccactgtcg     960

acgataaccg cggtctggtt ctcgtcgtat ctggcgacaa cctccgcaag ggtgctgcgc    1020

taaacaccat ccagatcgct gagctgctgg ttaagtaaaa acccgccatt aaaaactccg    1080

cttgagtgct acactttaag cggggtttta atgtttgagg ggcgatgggg gtcgagcttg    1140

tgaagtggaa ttttccacaa gttttaagtt tctttagcag gggaaacact gctgatagca    1200

ctagcgataa agaacatgaa aatgcaacgg agctagcggc cgaagcttta gcggatgtca    1260

tttttcagtg gaaaaactgg gtctaccgac gcgttgata                           1299

<210>28

<211>1422

<212>DNA

<213>谷氨酸棒状杆菌

<400>28

cgcaaagctc acacccacga gctaaaaatt catatagtta agacaacatt tttggctgta      60

aaagacagcc gtaaaaacct cttgctcgtg tcaattgttc ttatcggaat gtggcttggg     120

cgattgttat gcaaaagttg ttaggttttt tgcggggttg tttaaccccc aaatgaggga     180

agaaggtaac cttgaactct atgagcacag gtttaacagc taagaccgga gtagagcact     240

tcggcaccgt tggagtagca atggttactc cattcacgga atccggagac atcgatatcg     300

ctgctggccg cgaagtcgcg gcttatttgg ttgataaggg cttggattct ttggttctcg     360

cgggcaccac tggtgaatcc ccaacgacaa ccgccgctga aaaactagaa ctgctcaagg     420

ccgttcgtga ggaagttggg gatcgggcga agctcatcgc cggtgtcgga accaacaaca     480

cgcggacatc tgtggaactt gcggaagctg ctgcttctgc tggcgcagac ggccttttag     540

ttgtaactcc ttattactcc aagccgagcc aagagggatt gctggcgcac ttcggtgcaa     600

ttgctgcagc aacagaggtt ccaatttgtc tctatgacat tcctggtcgg tcaggtattc     660

caattgagtc tgataccatg agacgcctga gtgaattacc tacgattttg gcggtcaagg     720

acgccaaggg tgacctcgtt gcagccacgt cattgatcaa agaaacggga cttgcctggt     780

attcaggcga tgacccacta aaccttgttt ggcttgcttt gggcggatca ggtttcattt     840

ccgtaattgg acatgcagcc cccacagcat tacgtgagtt gtacacaagc ttcgaggaag     900

gcgacctcgt ccgtgcgcgg gaaatcaacg ccaaactatc accgctggta gctgcccaag     960

gtcgcttggg tggagtcagc ttggcaaaag ctgctctgcg tctgcagggc atcaacgtag    1020

gagatcctcg acttccaatt atggctccaa atgagcagga acttgaggct ctccgagaag    1080

acatgaaaaa agctggagtt ctataaatat gaatgattcc cgaaatcgcg gccggaaggt    1140

tacccgcaag gcgggcccac cagaagctgg tcaggaaaac catctggata cccctgtctt    1200

tcaggcacca gatgcttcct ctaaccagag cgctgtaaaa gctgagaccg ccggaaacga    1260

caatcgggat gctgcgcaag gtgctcaagg atcccaagat tctcagggtt cccagaacgc    1320

tcaaggttcc cagaaccgcg agtccggaaa caacaaccgc aaccgttcca acaacaaccg    1380

tcgcggtggt cgtggacgtc gtggatccgg aaacgccaat ga                       1422

<210>29

<211>1787

<212>DNA

<213>谷氨酸棒状杆菌

<400>29

acaagcgcca aggaactacc tgcggaacgg gcggtgaagg gcaacttaag tctcatattt      60

caaacatagt tccacctgtg tgattaatcc ctagaacgga acaaactgat gaacaatcgt     120

taacaacaca gaccaaaacg gtcagttagg tatggatatc agcaccttct gaacgggtac     180

gtctagactg gtgggcgttt gaaaaactct tcgccccacg aaaatgaagg agcataatgg     240

gaatcaaggt tggcgttctc ggagccaaag gccgtgttgg tcaaactatt gtggcagcag     300

tcaatgagtc cgacgatctg gagcttgttg cagagatcgg cgtcgacgat gatttgagcc     360

ttctggtaga caacggcgct gaagttgtcg ttgacttcac cactcctaac gctgtgatgg     420

gcaacctgga gttctgcatc aacaacggca tttctgcggt tgttggaacc acgggcttcg     480

atgatgctcg tttggagcag gttcgcgact ggcttgaagg aaaagacaat gtcggtgttc     540

tgatcgcacc taactttgct atctctgcgg tgttgaccat ggtcttttcc aagcaggctg     600

cccgcttctt cgaatcagct gaagttattg agctgcacca ccccaacaag ctggatgcac     660

cttcaggcac cgcgatccac actgctcagg gcattgctgc ggcacgcaaa gaagcaggca     720

tggacgcaca gccagatgcg accgagcagg cacttgaggg ttcccgtggc gcaagcgtag     780

atggaatccc ggttcatgca gtccgcatgt ccggcatggt tgctcacgag caagttatct     840

ttggcaccca gggtcagacc ttgaccatca agcaggactc ctatgatcgc aactcatttg     900

caccaggtgt cttggtgggt gtgcgcaaca ttgcacagca cccaggccta gtcgtaggac     960

ttgagcatta cctaggcctg taaaggctca tttcagcagc gggtggaatt ttttaaaagg    1020

agcgtttaaa ggctgtggcc gaacaagtta aattgagcgt ggagttgata gcgtgcagtt    1080

cttttactcc acccgctgat gttgagtggt caactgatgt tgagggcgcg gaagcactcg    1140

tcgagtttgc gggtcgtgcc tgctacgaaa cttttgataa gccgaaccct cgaactgctt    1200

ccaatgctgc gtatctgcgc cacatcatgg aagtggggca cactgctttg cttgagcatg    1260

ccaatgccac gatgtatatc cgaggcattt ctcggtccgc gacccatgaa ttggtccgac    1320

accgccattt ttccttctct caactgtctc agcgtttcgt gcacagcgga gaatcggaag    1380

tagtggtgcc cactctcatc gatgaagatc cgcagttgcg tgaacttttc atgcacgcca    1440

tggatgagtc tcggttcgct ttcaatgagc tgcttaatgc gctggaagaa aaacttggcg    1500

atgaaccgaa tgcactttta aggaaaaagc aggctcgtca agcagctcgc gctgtgctgc    1560

ccaacgctac agagtccaga atcgtggtgt ctggaaactt ccgcacctgg aggcatttca    1620

ttggcatgcg agccagtgaa catgcagacg tcgaaatccg cgaagtagcg gtagaatgtt    1680

taagaaagct gcaggtagca gcgccaactg ttttcggtga ttttgagatt gaaactttgg    1740

cagacggatc gcaaatggca acaagcccgt atgtcatgga cttttaa                  1787

<210>30

<211>3360

<212>DNA

<213>谷氨酸棒状杆菌

<400>30

tgcatgggca cgtcgatgct gccacattga gcggaggcaa tatctacctg aggtgggcat      60

tcttcccagc ggatgttttc ttgcgctgct gcagtgggca ttgataccaa aaaggggcta     120

agcgcagtcg aggcggcaag aactgctact acccttttta ttgtcgaacg gggcattacg     180

gctccaagga cgtttgtttt ctgggtcagt taccccaaaa agcatataca gagaccaatg     240

atttttcatt aaaaaggcag ggatttgtta taagtatggg tcgtattctg tgcgacgggt     300

gtacctcggc tagaatttct ccccatgaca ccagctgatc tcgcaacatt gattaaagag     360

accgcggtag aggttttgac ctcccgcgag ctcgatactt ctgttcttcc ggagcaggta     420

gttgtggagc gtccgcgtaa cccagagcac ggcgattacg ccaccaacat tgcattgcag     480

gtggctaaaa aggtcggtca gaaccctcgg gatttggcta cctggctggc agaggcattg     540

gctgcagatg acgccattga ttctgctgaa attgctggcc caggcttttt gaacattcgc     600

cttgctgcag cagcacaggg tgaaattgtg gccaagattc tggcacaggg cgagactttc     660

ggaaactccg atcacctttc ccacttggac gtgaacctcg agttcgtttc tgcaaaccca     720

accggaccta ttcaccttgg cggaacccgc tgggctgccg tgggtgactc tttgggtcgt     780

gtgctggagg cttccggcgc gaaagtgacc cgcgaatact acttcaacga tcacggtcgc     840

cagatcgatc gtttcgcttt gtcccttctt gcagcggcga agggcgagcc aacgccagaa     900

gacggttatg gcggcgaata cattaaggaa attgcggagg caatcgtcga aaagcatcct     960

gaagcgttgg ctttggagcc tgccgcaacc caggagcttt tccgcgctga aggcgtggag    1020

atgatgttcg agcacatcaa atcttccctg catgagttcg gcaccgattt cgatgtctac    1080

taccacgaga actccctgtt cgagtccggt gcggtggaca aggccgtgca ggtgctgaag    1140

gacaacggca acctgtacga aaacgagggc gcttggtggc tgcgttccac cgaattcggc    1200

gatgacaaag accgcgtggt gatcaagtct gacggcgacg cagcctacat cgctggcgat    1260

atcgcgtacg tggctgataa gttctcccgc ggacacaacc taaacatcta catgttgggt    1320

gctgaccacc atggttacat cgcgcgcctg aaggcagcgg cggcggcact tggctacaag    1380

ccagaaggcg ttgaagtcct gattggccag atggtgaacc tgcttcgcga cggcaaggca    1440

gtgcgtatgt ccaagcgtgc aggcaccgtg gtcaccctag atgacctcgt tgaagcaatc    1500

ggcatcgatg cggcgcgtta ctccctgatc cgttcctccg tggattcttc cctggatatc    1560

gatctcggcc tgtgggaatc ccagtcctcc gacaaccctg tgtactacgt gcagtacgga    1620

cacgctcgtc tgtgctccat cgcgcgcaag gcagagacct tgggtgtcac cgaggaaggc    1680

gcagacctat ctctactgac ccacgaccgc gaaggcgatc tcatccgcac actcggagag    1740

ttcccagcag tggtgaaggc tgccgctgac ctacgtgaac cacaccgcat tgcccgctat    1800

gctgaggaat tagctggaac tttccaccgc ttctacgatt cctgccacat ccttccaaag    1860

gttgatgagg atacggcacc aatccacaca gcacgtctgg cacttgcagc agcaacccgc    1920

cagaccctcg ctaacgccct gcacctggtt ggcgtttccg caccggagaa gatgtaacaa    1980

tggctacagt tgaaaatttc aatgaacttc ccgcacacgt atggccacgc aatgccgtgc    2040

gccaagaaga cggcgttgtc accgtcgctg gtgtgcctct gcctgacctc gctgaagaat    2100

acggaacccc actgttcgta gtcgacgagg acgatttccg ttcccgctgt cgcgacatgg    2160

ctaccgcatt cggtggacca ggcaatgtgc actacgcatc taaagcgttc ctgaccaaga    2220

ccattgcacg ttgggttgat gaagaggggc tggcactgga cattgcatcc atcaacgaac    2280

tgggcattgc cctggccgct ggtttccccg ccagccgtat caccgcgcac ggcaacaaca    2340

aaggcgtaga gttcctgcgc gcgttggttc aaaacggtgt gggacacgtg gtgctggact    2400

ccgcacagga actagaactg ttggattacg ttgccgctgg tgaaggcaag attcaggacg    2460

tgttgatccg cgtaaagcca ggcatcgaag cacacaccca cgagttcatc gccactagcc    2520

acgaagacca gaagttcgga ttctccctgg catccggttc cgcattcgaa gcagcaaaag    2580

ccgccaacaa cgcagaaaac ctgaacctgg ttggcctgca ctgccacgtt ggttcccagg    2640

tgttcgacgc cgaaggcttc aagctggcag cagaacgcgt gttgggcctg tactcacaga    2700

tccacagcga actgggcgtt gcccttcctg aactggatct cggtggcgga tacggcattg    2760

cctataccgc agctgaagaa ccactcaacg tcgcagaagt tgcctccgac ctgctcaccg    2820

cagtcggaaa aatggcagcg gaactaggca tcgacgcacc aaccgtgctt gttgagcccg    2880

gccgcgctat cgcaggcccc tccaccgtga ccatctacga agtcggcacc accaaagacg    2940

tccacgtaga cgacgacaaa acccgccgtt acatcgccgt ggacggaggc atgtccgaca    3000

acatccgccc agcactctac ggctccgaat acgacgcccg cgtagtatcc cgcttcgccg    3060

aaggagaccc agtaagcacc cgcatcgtgg gctcccactg cgaatccggc gatatcctga    3120

tcaacgatga aatctaccca tctgacatca ccagcggcga cttccttgca ctcgcagcca    3180

ccggcgcata ctgctacgcc atgagctccc gctacaacgc cttcacacgg cccgccgtcg    3240

tgtccgtccg cgctggcagc tcccgcctca tgctgcgccg cgaaacgctc gacgacatcc    3300

tctcactaga ggcataacgc ttttcgacgc ctgaccccgc ccttcacctt cgccgtggag    3360

                                                                     3360

<210>31

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pyc扩增的正向引物

<400>31

ggctctagaa ggattgcttt gtgcactcct g                                     31

<210>32

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pyc扩增的反向引物

<400>32

gaagatatcg agccttggtc tccatcttc                                        29

<210>33

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pyc扩增的正向引物

<400>33

gaagatatca ggattgcttt gtgcactcct g                                    31

<210>34

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pyc扩增的反向引物

<400>34

gacaagcttg agccttggtc tccatcttc                                       29

<210>35

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>35

ctgaggaaga gcaggcgcac ctcg                                            24

<210>36

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>36

ttccgcacac tcgcgggcaa gctg                                            24

<210>37

<211>3925

<212>DNA

<213>谷氨酸棒状杆菌

<400>37

aggattgctt tgtgcactcc tgggttttca ctttgttaag cagttttggg gaaaagtgca     60

aagtttgcaa agtttagaaa tattttaaga ggtaagatgt ctgcaggtgg aagcgtttaa    120

atgcgttaaa cttggccaaa tgtggcaacc tttgcaaggt gaaaaactgg ggcggggtta    180

gatcctgggg ggtttatttc attcactttg gcttgaagtc gtgcaggtca ggggagtgtt    240

gcccgaaaac attgagagga aaacaaaaac cgatgtttga ttgggggaat cgggggttac    300

gatactagga cgcagtgact gctatcaccc ttggcggtct cttgttgaaa ggaataatta    360

ctctagtgtc gactcacaca tcttcaacgc ttccagcatt caaaaagatc ttggtagcaa    420

accgcggcga aatcgcggtc cgtgctttcc gtgcagcact cgaaaccggt gcagccacgg    480

tagctattta cccccgtgaa gatcggggat cattccaccg ctcttttgct tctgaagctg    540

tccgcattgg taccgaaggc tcaccagtca aggcgtacct ggacatcgat gaaattatcg    600

gtgcagctaa aaaagttaaa gcagatgcca tttacccggg atacggcttc ctgtctgaaa     660

atgcccagct tgcccgcgag tgtgcggaaa acggcattac ttttattggc ccaaccccag     720

aggttcttga tctcaccggt gataagtctc gcgcggtaac cgccgcgaag aaggctggtc     780

tgccagtttt ggcggaatcc accccgagca aaaacatcga tgagatcgtt aaaagcgctg     840

aaggccagac ttaccccatc tttgtgaagg cagttgccgg tggtggcgga cgcggtatgc     900

gttttgttgc ttcacctgat gagcttcgca aattagcaac agaagcatct cgtgaagctg     960

aagcggcttt cggcgatggc gcggtatatg tcgaacgtgc tgtgattaac cctcagcata    1020

ttgaagtgca gatccttggc gatcacactg gagaagttgt acacctttat gaacgtgact    1080

gctcactgca gcgtcgtcac caaaaagttg tcgaaattgc gccagcacag catttggatc    1140

cagaactgcg tgatcgcatt tgtgcggatg cagtaaagtt ctgccgctcc attggttacc    1200

agggcgcggg aaccgtggaa ttcttggtcg atgaaaaggg caaccacgtc ttcatcgaaa    1260

tgaacccacg tatccaggtt gagcacaccg tgactgaaga agtcaccgag gtggacctgg    1320

tgaaggcgca gatgcgcttg gctgctggtg caaccttgaa ggaattgggt ctgacccaag    1380

ataagatcaa gacccacggt gcagcactgc agtgccgcat caccacggaa gatccaaaca    1440

acggcttccg cccagatacc ggaactatca ccgcgtaccg ctcaccaggc ggagctggcg    1500

ttcgtcttga cggtgcagct cagctcggtg gcgaaatcac cgcacacttt gactccatgc    1560

tggtgaaaat gacctgccgt ggttccgact ttgaaactgc tgttgctcgt gcacagcgcg    1620

cgttggctga gttcaccgtg tctggtgttg caaccaacat tggtttcttg cgtgcgttgc    1680

tgcgggaaga ggacttcact tccaagcgca tcgccaccgg attcattgcc gatcacccgc    1740

acctccttca ggctccacct gctgatgatg agcagggacg catcctggat tacttggcag    1800

atgtcaccgt gaacaagcct catggtgtgc gtccaaagga tgttgcagct cctatcgata    1860

agctgcctaa catcaaggat ctgccactgc cacgcggttc ccgtgaccgc ctgaagcagc    1920

ttggcccagc cgcgtttgct cgtgatctcc gtgagcagga cgcactggca gttactgata    1980

ccaccttccg cgatgcacac cagtctttgc ttgcgacccg agtccgctca ttcgcactga    2040

agcctgcggc agaggccgtc gcaaagctga ctcctgagct tttgtccgtg gaggcctggg    2100

gcggcgcgac ctacgatgtg gcgatgcgtt tcctctttga ggatccgtgg gacaggctcg    2160

acgagctgcg cgaggcgatg ccgaatgtaa acattcagat gctgcttcgc ggccgcaaca    2220

ccgtgggata caccccgtac ccagactccg tctgccgcgc gtttgttaag gaagctgcca    2280

gctccggcgt ggacatcttc cgcatcttcg acgcgcttaa cgacgtctcc cagatgcgtc    2340

cagcaatcga cgcagtcctg gagaccaaca ccgcggtagc cgaggtggct atggcttatt    2400

ctggtgatct ctctgatcca aatgaaaagc tctacaccct ggattactac ctaaagatgg    2460

cagaggagat cgtcaagtct ggcgctcaca tcttggccat taaggatatg gctggtctgc    2520

ttcgcccagc tgcggtaacc aagctggtca ccgcactgcg ccgtgaattc gatctgccag    2580

tgcacgtgca cacccacgac actgcgggtg gccagctggc aacctacttt gctgcagctc    2640

aagctggtgc agatgctgtt gacggtgctt ccgcaccact gtctggcacc acctcccagc    2700

catccctgtc tgccattgtt gctgcattcg cgcacacccg tcgcgatacc ggtttgagcc    2760

tcgaggctgt ttctgacctc gagccgtact gggaagcagt gcgcggactg tacctgccat    2820

ttgagtctgg aaccccaggc ccaaccggtc gcgtctaccg ccacgaaatc ccaggcggac    2880

agttgtccaa cctgcgtgca caggccaccg cactgggcct tgcggatcgt ttcgaactca    2940

tcgaagacaa ctacgcagcc gttaatgaga tgctgggacg cccaaccaag gtcaccccat    3000

cctccaaggt tgttggcgac ctcgcactcc acctcgttgg tgcgggtgtg gatccagcag    3060

actttgctgc cgatccacaa aagtacgaca tcccagactc tgtcatcgcg ttcctgcgcg    3120

gcgagcttgg taaccctcca ggtggctggc cagagccact gcgcacccgc gcactggaag    3180

gccgctccga aggcaaggca cctctgacgg aagttcctga ggaagagcag gcgcacctcg    3240

acgctgatga ttccaaggaa cgtcgcaata gcctcaaccg cctgctgttc ccgaagccaa    3300

ccgaagagtt cctcgagcac cgtcgccgct tcggcaacac ctctgcgctg gatgatcgtg    3360

aattcttcta cggcctggtc gaaggccgcg agactttgat ccgcctgcca gatgtgcgca    3420

ccccactgct tgttcgcctg gatgcgatct ctgagccaga cgataagggt atgcgcaatg    3480

ttgtggccaa cgtcaacggc cagatccgcc caatgcgtgt gcgtgaccgc tccgttgagt    3540

ctgtcaccgc aaccgcagaa aaggcagatt cctccaacaa gggccatgtt gctgcaccat    3600

tcgctggtgt tgtcaccgtg actgttgctg aaggtgatga ggtcaaggct ggagatgcag    3660

tcgcaatcat cgaggctatg aagatggaag caacaatcac tgcttctgtt gacggcaaaa    3720

tcgatcgcgt tgtggttcct gctgcaacga aggtggaagg tggcgacttg atcgtcgtcg    3780

tttcctaaac ctttctgtaa aaagccccgc gtcttcctca tggaggaggc ggggcttttt    3840

gggccaagat gggagatggg tgagttggat ttggtctgat tcgacacttt taagggcaga    3900

gatttgaaga tggagaccaa ggctc                                          3925

<210>38

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>38

gggcgaattc tgcagat                                                     17

<210>39

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>39

atctgcagaa ttcgccc                                                     17

<210>40

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>40

aaacgccaat gagagctctc a                                                21

<210>41

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>41

cttggcgctt gtgagctctg a                                               21

<210>42

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>42

tctagaagaa acatcccagc gctac                                           25

<210>43<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>43

catatggagt gtttcctttc gttg                                            24

<210>44

<211>318

<212>DNA

<213>产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)CJHB100

<400>44

agaaacatcc cagcgctact aatagggagc gttgaccttc cttccacgga ccggtaatcg     60

gagtgcctaa aaccgcatgc ggcttaggct ccaagatagg ttctgcgcgg ccgggtaatg    120

catcttcttt agcaacaagt tgaggggtag gtgcaaataa gaacgacata gaaatcgtct    180

cctttctgtt tttaatcaac atacaccacc acctaaaaat tccccgacca gcaagttcac    240

agtattcggg cacaatatcg ttgccaaaat attgtttcgg aatatcatgg gatacgtacc    300

caacgaaagg aaacactc                                                  318

<210>45

<211>301

<212>DNA

<213>产氨棒状杆菌CJHB100

<400>45

caccgcgggc ttattccatt acatggaatg accaggaatg gcagggaatg cgacgaaatt     60

gactgtgtcg ggagcttctg atccgatgct gccaaccagg agagaaaata atgacatgtg    120

caggcacgct ggtgagctgg agatttatga tctcaagtac cttttttctt gcactcgagg    180

gggctgagtg ccagaatggt tgctgacacc aggttgaggt tggtacacac tcaccaatcc    240

tgccgtcgcg ggcgcctgcg tggaacataa accttgagtg aaacccaatc taggagatta    300

a                                                                    301

<210>46

<211>285

<212>DNA

<213>产氨棒状杆菌CJHB100

<400>46

aattccacca gacgttgttt agtaagtgcc cgaattctcg gttggtgcag ttgcttttcg     60

atgaatggga gaacctcgaa tacttccgcg tctctacttt ccggtacgtg ccacacagag    120

cagagcaatc ggtggaagag cacgacagat tagtagcgct tatcgaagcc caggcagaag    180

atttctacat cgaatcccaa gcccgcaacc accgcctgac aaccgcaacg acctaccgcc    240

aacgtttaaa ttccgaaaat catcacgaag aacaaggagt gcaca                    285

<210>47

<211>291

<212>DNA

<213>产氨棒状杆菌CJHB100

<400>47

gctgcctaca tctggacttc tgacctgaag cgctcccaca acttcgcgca aaacgttgaa     60

gccggcatgg tctggttgaa ctccaacaac gtccgtgacc tgcgcacccc attcggtggc    120

gtcaaggcat ccggtctggg gcatgagggc ggctaccgct ccattgactt ctacaccgac    180

caacaggccg tacacatcaa cttaggcgaa gtccacaacc cagtcttcgg caagcaaacc    240

aactaattct ccctcatcca cactcccctt ttaacctcac taggagtcat c             291

<210>48

<211>312

<212>DNA

<213>产氨棒状杆菌CJHB100

<400>48

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<213>产氨棒状杆菌CJHB100

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<211>332

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<213>产氨棒状杆菌CJHB100

<400>50

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