一种筛选动物抗病育种的方法和筛选猪抗病育种的遗传标记

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步地解释，但具体实施例并不对本发明做任何限定。

实施例1  两个猪种F4受体黏附差异研究

解剖1周龄内沙子岭猪33头、大约克猪30头，取猪小肠组织用于制备上皮细胞刷状缘和保存于液氮中用于提取RNA。

取大肠杆菌悬液和仔猪小肠黏膜上皮细胞刷状缘悬液各0.1ml置于1.5mL离心管中，加入甘露糖(0.4mg/mL)1μl，轻轻混合，室温培养30min，不时轻摇；混悬后滴一滴于载玻片上，酒精灯下微热烘干，再加一滴结晶紫染色液，3min后用水冲洗载玻片，酒精灯下微热烘干，油镜下观察，随机计数20个形态清晰的细胞上所黏附的细菌数。

判断标准：在油镜下随机检测20或更多形态清晰的刷状缘，对于单个的刷状缘，多于两个细菌黏附其上判为黏附；对于仔猪个体样，样品中至少有10％的刷状缘结合多于2个细菌才判为黏附；少于10％的刷状缘结合多于2个细菌，但多于10％的刷状缘结合1～2个细菌，判为弱黏附；最后用数码相机进行拍照(黏附型见图1，不黏附型见图2)。

图1和图2分别是黏附与不黏附型图，由图1可见，刷状缘结合了多个细菌，而图2则不然，试验结果表明，此方法在显微镜下能够非常清楚的观察到黏附情况，从而对个体黏附型进行准确判定。

实施例2  差异的获得

一、cDNA的合成

取实施例1中保存于液氮中的猪小肠组织，采用常规方法提取总RNA，并进行定量、纯度和完整性检测，再用无RNase的DNase I处理总RNA，采用Fermentas公司的第一链cDNA合成试剂盒中的oligo(dT)引物进行cDNA的合成。分别取粘附型(有受体)和不黏附型样品(无受体)各6个cDNA样品构建cDNA池用于扩增。

二、δ差异显示引物

δ差异显示引物由上海英骏生物有限公司合成，每个引物浓度为20μM，引物序列如下：

(1)5’P随机引物共10条：

P1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示；

P2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示；

P3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示；

P4，其核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示；

P5，其核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示；

P6，其核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示；

P7，其核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示；

P8，其核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示；

P9，其核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示；

P10，其核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示；

(2)3’oligo(dT)引物共9条：

T1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示；

T2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：22所示；

T3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示；

T4，其核苷酸序列如SEQ ID NO：24所示；

T5，其核苷酸序列如SEQ ID NO：25所示；

T6，其核苷酸序列如SEQ ID NO：26所示；

T7，其核苷酸序列如SEQ ID NO：27所示；

T8，其核苷酸序列如SEQ ID NO：28所示；

T9，其核苷酸序列如SEQ ID NO：29所示。

三、长距离PCR(LD-PCR)

1、PCR循环参数

前4个循环使用低严谨条件，后28个循环使用严谨条件。

1个循环：94℃，6min；40℃，5min；68℃，5min。

3个循环：94℃，2min；40℃，5min；68℃，5min。

28个循环：94℃，1min；60℃，1min；68℃，2min。

另外68℃，7min。

2、PCR操作流程

(1)融化下述试剂：

10×PCR反应缓冲液(试剂盒搭配的)、25mM Mgcl₂、上述已合成好的cDNA样品、dNTP混合物(试剂盒搭配的)、上述10条5’P随机引物、9条3’oligo(dT)引物和纯水，完全融化后保持上述溶液在冰上，使用之前混合好，以避免盐浓度的局部差异；

(2)对每一个差异显示即样品与引物组合，在0.2ml PCR管中加入如下反应成分：

0.8μL    已合成好的cDNA样品

0.8μL    5’P引物(SEQ ID NO：11～20)

0.8μL    3’oligo(dT)引物(SEQ ID NO：21～29)

当单独使用一个P引物或一个T引物时，加该引物1.6μL；

(3)根据表1所示准备主体混合物：

表1  PCR反应体系成分

主体混合物体积应比PCR操作分析的总数量大10％，如总共分析10个反应管，则应准备11个反应管上述成分，因为由于操作或tips与移液枪等原因存在误差。在每一个实验中，另准备一个否定控制(没有模板DNA)。Taq DNA聚合酶最后加入，然后通过上下移液彻底混合；

(4)每个PCR反应管加入上述主体混合物17.6μL，用去离子水补足总体积为20ul；

(5)旋涡混合器上混合后轻轻离心；

(6)开启PCR仪，当PCR仪达到94℃时，放PCR管到PCR仪中(简单的热起始)；

(7)PCR结束后将进行聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染显示。

四、结果讨论

两个猪种共63头猪小肠总RNA浓度与纯度检测结果表明，总RNA浓度在560～1152μg/ml之间，纯度在1.75～2.00之间，一般在1.85左右，说明采用提取的总RNA质量高，基本无蛋白质污染，可保证mRNA扩增的顺利进行，通过检测总RNA完整性表明提取的总RNA分子完整，没有发生降解。

本发明的差异指：在δ差异显示中，在黏附型样品中表达，但在非黏附型样品中不表达，或者在非黏附型样品中表达，但在黏附型样品中不表达的基因。

图3给出109个δ差异显示引物组合中随即挑选的9对δ差异显示引物的电泳结果图，图中三处箭头所分别指出的三条条带，均是相对照样品中没有出现的，因此这三条条带可判定为差异片段。

δ差异显示结果为：在δ差异显示的109个引物组合的PCR中，在F4 ac黏附差异带检测中，共检测到24条差异片带，其中有13条在黏附型中特异表达，11条在不黏附型样品中特异表达。

实施例3  差异的回收、再扩增、纯化与Northern blot

本实施例的差异即为实施例2中F4ac黏附差异带检测到的24条。

用干净的手术刀从实施例2中得到的银染凝胶片上切下所需的差异带，回收其中的DNA，并对差异实施再扩增、纯化与回收步聚，之后进行Northern印迹杂交，确定总RNA中样品同源RNA的存在与否或样品中特定RNA分子的大小和丰度。

本实施例所涉及到的差异扩增、纯化、回收以及Northern印迹杂交等均为本领域的通用操作。

结果显示：

1、在24条δ差异的再扩增PCR中，有1条差异没能实现特异性扩增，表现为多带或无带，估计这些差异实际可能包含几条大小相近的，需要通过其它方法才能分离出来，本实施例将其作为假阳性差异，没作进一步分析；

2、其余23条δ差异的再扩增Northern blot结果判断原则都如图4所示，图4中给出23条δ差异的再扩增Northern blot结果中的3条δ差异的Northern blot结果电泳图，其中1号和2号这两条δ差异片段的对照(R₁和R₂)显示为空白，而S₁和S₂显示为有条带，说明1号和2号为阳性，3号δ差异片段的对照R₃显示为有条带，而S₃也显示为有条带，因此判定为假阳性。

根据Northern blot电泳结果图，本实施例确定23条δ差异片段中有20条为阳性差异，阳性率为87％(20/23)。

实施例4  阳性差异的克隆、测序与序列分析

本实施例中的材料为通过实施例3确定的纯化后的20个阳性差异，通过感受态细胞的制备、连接、转化、筛选、鉴定等过程，克隆阳性差异，然后送上海英骏生物有限公司测序，将测序结果到NCBI网站通过BLAST程序进行同源比对，再根据比对结果确定该片段是否为新基因或者与某一基因有较大长度的高同源性。

克隆载体送测序公司测序后，到NCBI网站进行BLAST比对，本实施例共测序了20条片段，其中比对结果有高同源性(＞85％)且同源的长度大于60个碱基的片段有2条；有同源性但低于85％或同源的长度较短的片段有2条，其余16条为新基因片段。20条片段序列已登录到GenBank中，登录号分别为DQ217772、EC268686、DW286736～DW286739、EB739624～EB739627和EE392468～EE392477。

实施例5  猪相关基因SNP筛选

本实施例从实施例1中已经鉴定的黏附型和不黏附型样本中分别随机选择4个共8个样品，并分别提取其基因组DNA。

根据猪PMCA 1基因mDNA序列设计了4对引物，如下所示：

引物1上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：30；

引物1下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：31；

引物2上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9；

引物2下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：10；

引物3上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：32；

引物3下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：33；

引物4上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：34；

引物4下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：35。

用上述4对引物分别对所选择的四个黏附型个体和所选择的四个不黏附型个体进行了扩增，扩增产物经纯化后送测序公司测序，测序结果SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示。

采用DNAStar软件之Seqman程序对上述8条序列(SEQ ID NO：1～8)进行同源比对，筛选与黏附性有关的SNP，其中引物2的扩增测序比对结果如图5所示。

结果表明，其中由引物2扩增产物在142碱基处，所有黏附型个体的碱基均为A，而所有不黏附型个体的碱基均为T，该位点经NCBI进行同源比对，结果表明即为PMCA 1基因(NM_001001331.1)的mRNA第4210碱基处。

另外，图5所示在第10碱基位点，也存在SNP，但分析表明，该SNP与黏附性不存在相关。

该结果表明，引物2所扩增产物在第142碱基位置的突变很可能就是影响F4ac受体黏附性差异的原因，而在其它位点，虽然发现一些SNP，但这些SNP与样品的黏附性无关，因此不予考虑。

对其它3对引物的测序结果分析，未发现一SNP在所有黏附/不黏附个体中特异表现，因此认为该区段不存在影响黏附性的多态位点。

由此可见，与粘附性有关的SNP为PMCA 1基因的mRNA第4210碱基处有一个碱基突变A4210-T4210。

实施例6  与黏附性有关的SNP在生产实践中的验证

在湖南农业大学种猪场用ETEC F4ac病原菌感染初生仔猪，采集腹泻和未腹泻的初生仔猪各30头血样，提取基因组DNA，利用实施例5中的引物2扩增，并检测其SNP。

1、引物

引物2上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9；

引物2下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：10。

2、PCR

PCR反应体系，如表2所示：

表2  PCR反应体系中各组成成分

PCR循环参数如下：

34个循环：94℃，4min；94℃，30s；59℃，40s。

72℃，7min。

结果表明，在30头腹泻的初生仔猪中，引物扩增产物在142碱基处的碱基均为A，由此证明这30头腹泻的初生仔猪均为黏附型个体；而在30头不腹泻的初生仔猪中，引物扩增产物在142碱基处的碱基均为T，说明这30头不腹泻的初生仔猪均为不黏附型个体。

上述结果表明PMCA 1基因为F4ac受体相关基因，通过验证PMCA 1基因可以筛选动物抗ETEC的品种进行培育，对于猪来说，可通过判断PMCA 1基因核苷酸中第4210位碱基的多态性(A4210-T4210)来筛选对ETEC具有抗性的猪。

        一种筛选动物抗病育种的方法和筛选猪抗病育种的遗传标记  序列表

        SEQUENCE LISTING

<110>湖南农业大学

     刘，定发

     蒋，隽

<120>一种筛选动物抗病育种的方法和筛选猪抗病育种的遗传标记

<130>

<160>35

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>256

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<400>1

gccaatcaag ccgatccatg attgggttag gtagagcttt ggggccaggt catcgccacc     60

atccccacca gcagacacaa gttcctcaag gaggcaggca ggctcacgtg ttcctgcctg    120

cactgtcaac tccaacccac cagcccgctg gctgcgatgc tgtttgaact ccttttcact    180

tcaaggcaag ggccgggatc tccactgggg gcttacggga gtgagcgttt ttcccaaaac    240

aagccttcct ggctcc                                                    256

<210>2

<211>256

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<400>2

gccaatcaag ccgatccatg attgggttag gtagagcttt ggggccaggt catcgccacc     60

atccccacca gcagacacaa gttcctcaag gaggcaggca ggctcacgtg ttcctgcctg    120

cactgtcaac tccaacccac ctgcccgctg gctgcgatgc tgtttgaact ccttttcaca    180

tcaaggcaag ggccgggatc tccactgggg gcttacggga gtgagcgttt ttcccaaaac    240

aagccttcct ggctcc                                                    256

<210>3

<211>248

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<400>3

gccaatcaag ccgatccatg attgggttag gtagagcttt ggggccaggt catcgccacc     60

atccccacca gcagacacaa gttcctcaag gaggcaggca ggctcacgtg ttcctgcctg    120

cactgtcaac tccaacccac cagcccgctg gctgcgatgc tgtttgaact ccttttcact    180

tcaaggcaag ggccgggatc tccactgggg gcttacggga gtgagcgttt ttcccaaaac    240

aagccttt                                                             248

<210>4

<211>257

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<400>4

gccaatcaag ccgatccatg attgggttag gtagagcttt ggggccaggt catcgccacc     60

atccccacca gcagacacaa gttcctcaag gaggcaggca ggctcacgtg ttcctgcctg    120

cactgtcaac tccaacccac ctgcccgctg gctgcgatgc tgtttgaact ccttttcaca    180

tcaaggcaag ggccgggatc tccactgggg gcttacggga gtgagcgttt ttcccaaaac    240

aagccttcct tgctcgg                                                   257

<210>5

<211>251

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<400>5

gccaatcaac ccgatccatg attgggttag gtagagcttt ggggccaggt catcgccacc     60

atccccacca gcagacacaa gttcctcaag gaggcaggca ggctcacgtg ttcctgcctg    120

cactgtcaac tccaacccac ctgcccgctg gctgcgatgc tgtttgaact ccttttcaca    180

tcaaggcaag ggccgggatc tccactgggg tcttacggga gtgagcgttt ttcccaaaac    240

aagccttcct g                                                         251

<210>6

<211>255

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<400>6

gccaatcaac ccgatccatg attgggttag gtagagcttt ggggccaggt catcgccacc     60

atccccacca gcagacacaa gttcctcaag gaggcaggca ggctcacgtg ttcctgcctg    120

cactgtcaac tccaacccac cagcccgctg gctgcgatgc tgtttgaact ccttttcact    180

tcaaggcaag ggccgggatc tccactgggg gcttacggga gtgagcgttt tcccaaaaca    240

agccttcctg gctcc                                                     255

<210>7

<211>258

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<400>7

gccaatcaac ccgatccatg attgggttag gtagagcttt ggggccaggt catcgccacc     60

atccccacca gcagacacaa gttcctcaag gaggcaggca ggctcacgtg ttcctgcctg    120

cactgtcaac tccaacccac cagcccgctg gctgcgatgc tgtttgaact ccttttcact    180

tcaaggcaag ggccgggatc tccactgggg gcttacggga gtgagcgttt ttcccaaaac    240

aagccttcct ggctccgt                                                  258

<210>8

<211>253

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<400>8

gccaatcaag ccgatccatg attgggttag gtagagcttt ggggccaggt catcgccacc     60

atccccacca gcagacacaa gttcctcaag gaggcaggca ggctcacgtg ttcctgcctg    120

cactgtcaac tccaacccac ctgcccgctg gctgcgatgc tgtttgaact ccttttcact    180

tcaaggcaag ggccgggatc tccactgggg gcttacggga gtgagcgttt ttcccaaaac    240

aagccttcct ggc                                                       253

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>9

caggacgtga cacttatgag                                                 20

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>10

gccagtctga gagttcacac                                                 20

<210>11

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<400>11

attctctaaa tgctgggga                                                  19

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>12

attctctaaa tcggtcatag                                                 20

<210>13

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<400>13

attctctaaa tgctggtgg                                                  19

<210>14

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<400>14

attctctaaa tgctggtag                                                  19

<210>15

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<400>15

attctctaaa gatctgtg                                                   18

<210>16

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<400>16

attctctaaa tgctgggtg                                                  19

<210>17

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<400>17

attctctaaa tgctgtatg                                                  19

<210>18

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<400>18

attctctaaa tggagctgg                                                  19

<210>19

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<400>19

attctctaaa tgtggcagg                                                  19

<210>20

<211>17

<212>DNA

<213>人工合成

<400>20

attctctaaa gccgtcc                                                    17

<210>21

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成

<400>21

cattatgctg agtgatatct ttttttttaa                                      30

<210>22

<211>28

<212>DNA

<213>人工合成

<400>22

cattatgctg agtgatatct tttttttt                                        28

<210>23

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成

<400>23

cattatgctg agtgatatct ttttttttag                                      30

<210>24

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成

<400>24

cattatgctg agtgatatct ttttttttca                                      30

<210>25

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成

<400>25

cattatgctg agtgatatct ttttttttcc                                      30

<210>26

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成

<400>26

cattatgctg agtgatatct ttttttttcg                                      30

<210>27

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成

<400>27

cattatgctg agtgatatct ttttttttga                                      30

<210>28

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成

<400>28

cattatgctg agtgatatct ttttttttgc                                      30

<210>29

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成

<400>29

cattatgctg agtgatatct ttttttttgg                                      30

<210>30

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>30

actgacagca gtcgaggaga                                                 20

<210>31

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>31

ttgatcttga ccacagcctc                                                 20

<210>32

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>32

agatgcagcc tctgaagagt                                                 20

<210>33

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>33

aaggatcttg gtggtgtagg                                                 20

<210>34

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>34

gcctcggaga ttgtgctcaa                                                 20

<210>35

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>35

gccaccacgt tgacagtcag                                                 20