麦门冬汤与千金苇茎汤合方的正丁醇萃取物在制备抑制A549细胞增殖药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种中药提取物及其应用，具体涉及麦门冬汤与千金苇茎汤合方的正丁醇萃取物在制备抑制A549细胞增殖药物中的应用。

背景技术

肺癌是世界各国常见的恶性肿瘤之一，在所有恶性肿瘤中增长是最快的，是目前人类癌症死亡的主要原因，并被认为是当今世界对人类健康与生命危害最大的恶性肿瘤。全球大约每年新增300万病例，同时，每年有超过100万人死于肺癌。在我国，肺癌占恶性肿瘤发病、死亡的首位，年发病率为35例/10万人，患者5年生存率仅为10％，国际抗癌联盟(UICC)公布到2005年全世界恶性肿瘤患者男性肺癌占第一位，而中国的肺癌及患病绝对人数均占全世界的第一位，有资料称“中国的肺癌将占全球的一半”，约130.8万人。90年代以来我国肺癌的流行病学特点是年轻肺癌病例增多，腺癌病例的发病率在女性继续增长，男性鳞癌病例减少。首发症状不明显，就诊病人多为中、晚期，已无手术机会。

基于近来对肺癌认识的不断加深，由WHO和国际肺癌研究协会联合组成的专门小组对1981年WHO制定的肺肿瘤分类进行了修改，于1999年正式公布于众。肺癌患者中80％是NSCLC(non-small cell lung carcinoma，非小细胞肺癌)，20％是SCLC(smallcell lung carcinoma，小细胞肺癌)，基于两者在光镜下诊断的差异，二者在临床治疗中的方式也是不同的。NSCLC和SCLC是肺上皮源性肿瘤中最常见的2种类型，而其它良性肿瘤，非上皮源性肿瘤等在肺肿瘤中是很少见的。NSCLC包括肺腺癌，肺鳞癌和低分化甚至是未分化大细胞癌，这三种类型的肿瘤同属于NSCLC。

A549细胞(Human lung adenocarcinoma epithelial cell line)是人肺泡基底上皮肿瘤细胞，组织分型属于肺腺癌，常作为II型肺泡上皮细胞药物代谢的体外模型，细胞角蛋白阳性，p53基因为野生型，ras基因突变。

肺癌西医治疗方法的进展：肺癌中非小细胞肺癌(NSCLC)占80％以上，在国际上均一致承认肺癌是一个高发癌，在很多国家及城市中为各种癌症之首，65％在发现时为III和IV期，往往无手术条件，放疗的效果也不尽人意，而药物治疗中化疗虽说是一种全身性治疗药物，在近10余年较前有了较大进步，大量有效的新化疗药物及减低毒性药物的出现在疗效、耐受性方面较前有了一定的提高，但NSCLC具有耐药性高、疗效差的特点，尤对有远道转移的IV期患者，化疗虽仍为主要治疗方法，对该用多少周期和时间以及给患者带来的不适和痛苦，二者之间是否“合适”，均为目前肿瘤医师、患者所顾虑的问题。寻找一个耐受性高、毒性少而同样有效或更有效的另一种药物成为人们密切关注的事件，生物靶点治疗的发展自然成为肺癌新治疗的重中之重。

肺癌中医治疗方法的进展：肺癌属中医“息贲”、“肺积”等范畴。在中医学文献中类似肺癌证候有不少记载。如《素问·咳》：“肺咳之状，咳而喘息有音，甚至唾血。”《素问·奇病》：“病胁下满气上逆......病名息积，此不妨于食。”《难经·五十六难》称：“肺之积，名曰息贲，在右胁下，覆大如杯，久不已，令人洒淅寒热，喘咳，发肺壅。”明·张景岳说：“劳嗽，声哑，声不能出或喘息气促者，此肺脏败也，必死。”其发病原因，《诸病源候论》云：“积聚者，有阴阳不和，腑脏虚弱。受于风邪，搏于腑藏之气所为也。”清·顾松园认为：“烟为辛热之魁”，清·赵濂《医门补要》亦有论述：“表邪遏伏于肺，失于宣散，并嗜烟酒，火毒上熏，久郁热炽，烁腐肺叶”；同时中医学强调“邪之所凑，其气必虚”，《灵枢·刺节真邪》：“虚邪之入于身也深，寒与热相搏，久留而内著......邪气居其间而不反，发为瘤。”《景岳全书》：“凡脾肾不足及虚弱失调之人，多有积聚之病。”《活法机要》：“壮人无积，虚人则有之。”《医宗必读·积聚》指出：“积之成者，正气不足，而后邪气踞之”。病机如《杂病源流犀烛》中说：“邪积胸中，阻塞气道，气不得通，为痰、为食、为血，皆邪正相搏，邪积乃生，正不得制之，遂结成形而有块。”说明肺中积块的产生与正虚邪侵、气机不通、痰血搏结有关，对后世研究肺癌的发病和治疗具有重要启迪意义。许多学者对其病因病机有着不同的认识，但无外乎正气虚损和邪毒内积2个方面。病变部位在肺，与脾、肾有关，病理因素主要为气滞、痰浊、瘀血、热毒，病理性质为本虚标实，虚实错杂。刘嘉湘^[1]认为脏腑阴阳失调，正气虚损是患病的主要内在原因，“正气不足，而后邪气踞之”，肺、脾、肾三脏气虚均可导致肺气不足，加之嗜烟日久，热灼津液，或房事不节，精血内耗，均可导致肺阴不足，阴虚内热或气阴两虚；外在邪毒得以趁虚而入，客邪留滞，气机不畅，血行瘀滞，津液不布，聚津为痰，痰瘀交阻，日久形成积块。因此，认为肺癌是全身性疾病的一个局部表现，是因虚而致病，因虚而致实，早期的虚多见肺脾气虚或气阴两虚，晚期多为阴虚内热或阴阳两虚，局部的实不外乎气滞、血瘀、痰凝、毒聚的病理变化。洪广祥^[2]认为血瘀为肺癌的基本病理改变，瘀血阻肺为其基本证型，肺脾气虚则是其病理基础。陈玉琨^[3]则认为痰瘀既是邪毒侵肺，脏腑功能失调的病理产物，又是导致正气内虚，邪毒胶结成块的致病因素，因而痰瘀贯穿于肺癌的整个发病过程。

麦门冬汤源自张仲景《金匮要略·肺痿肺痈咳嗽上气病脉证治第七》，其曰：“火逆上气，咽喉不利，止逆下气者，麦门冬汤主之”^[4]。一般是治疗“虚热肺痿”的主方。后世对该方的主治范围有所扩大，用治肺阴不足及胃阴不足诸证。麦门冬汤由麦冬、半夏、人参、甘草、粳米、大枣等6味药组成，其主要有两大配伍特点：一是方中重用七升麦冬滋肺养胃，并清虚热，仅用一升半夏降逆下气，化其痰涎，半夏虽辛温，但与大量麦冬配伍则其燥被制，而麦冬得半夏则滋而不腻，两药配伍，相反相成。二是人参、甘草、粳米、大枣补脾益气，体现了虚则补母、培土以生金之法^[5]。全方共奏养胃阴而润肺燥，下逆气而止浊唾之功。因其用药精当，主从有序，配伍严谨，疗效显著，故为后世医家所推崇，并加以推广运用。现代药理学研究表明，麦门冬汤具有呼吸道净化、改善呼吸道高敏性、缓解支气管收缩、调节肺表面活性物质分泌等类固醇样药理作用^[6-9]，对咳嗽、呼吸道过敏、炎症等引起的呼吸道病变有重要的调节作用。

《千金》苇茎汤出自唐·孙思邈的《备急千金要方》卷十七肺脏方之肺痈第七，同时也见载于《金匮要略·肺痿肺痈咳嗽上气病脉证治第七》，由薏苡仁、瓜瓣、桃仁、苇茎组成，具有清热化痰、逐瘀排脓之功，主治肺痈。其中苇茎清泄肺热；冬瓜仁、生薏仁清化热痰，利湿排脓；桃仁活血祛瘀以消热结。由于麦门冬汤主治“肺中气阴亏虚”、《千金》苇茎汤清肺化痰活血^[10]，与现代中医所认为之肺癌的病机“气阴两虚、热毒痰瘀互结”^[11]基本相符。现代有人以其中一首方剂加味的方式应用于临床来治疗肺癌而取效者，如吴玉生氏^[12]用加味苇茎汤加减内服治疗124例晚期非小细胞肺癌患者，李柳宁^[13]等以千金苇茎汤加味应用在肺癌围放疗期的临床治疗等。

参考文献：

[1]刘嘉湘.肺癌的中医药治疗进展.中国肿瘤，2002，11(6)：326

[2]洪广祥.论中医药治疗肺癌.中医药通报，2007，6(2)：5-8、15

[3]陈玉琨.蒋梅.肺癌的中醫治療.新中医，1999，31(5)：31-32

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[5]包素珍，陈明显.麦门冬汤治疗慢性肺系疾病的药理学研究述要[J].辽宁中医学院学报，2005，(2)：168-169

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[10]范永升主编.新世纪全国高等中医药院校规划教材·金匮要略。中国中医药出版社2003.P114、118

[11]陈四清，周仲瑛.原发性支气管肺癌辨证分型探讨.新中医2002，34(11)：6-8

[12]吴玉生，吴凡.加味苇茎汤治疗晚期非小细胞肺癌124例疗效观察.新中医，2004，36(7)：13-14

[13]李柳宁，刘伟胜.千金苇茎汤加味在肺癌围放疗期的临床应用.辽宁中医杂志2006年第33卷第12期：1599

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种麦门冬汤与千金苇茎汤合方的正丁醇萃取物制备抑制肺腺癌细胞A549细胞增殖药物中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种麦门冬汤与千金苇茎汤合方的正丁醇萃取物在制备抑制肺腺癌细胞A549增殖药物中的应用，

其中，所述的麦门冬汤与千金苇茎汤合方的正丁醇萃取物按如下步骤制备得到：

(1)按重量份数取麦冬200～300份、法半夏100～150份、生晒参200～300份、甘草80～120份、苇茎200～300份、薏苡仁200～300份、冬瓜子200～300份、桃仁100～150份，粉碎后，加入总药材重量8～12倍的水，浸泡20～60min；加热至沸腾，并保持沸腾2～3小时；停止加热，冷却至室温，过滤得滤液，药渣再加入与第一次水煎相同量的水，同样方法再提取1～2次，合并提取液，减压浓缩，得到水提浓缩液；

(2)将步骤(1)制得的水提浓缩液加90～95％(v/v)乙醇至含醇量为80％(v/v)，静置20～30小时，得醇沉上清液和醇沉沉淀，将醇沉上清液减压浓缩至无醇味后，冷却至室温，过滤得到醇沉上清浓缩液；

(3)将步骤(2)得到的醇沉上清浓缩液，加入1～2倍容量的环己烷，摇匀后静置，待分层后分出上层环己烷溶液，下层水溶液再用环己烷用相同方法萃取1～2次后，合并下层水溶液；

(4)在步骤(3)得到的下层水溶液中加入1～2倍容量的乙酸乙酯，摇匀后静置，待分层后分出上层乙酸乙酯溶液，下层水溶液再用乙酸乙酯用相同方法萃取1～2次，合并下层水溶液；

(5)在步骤(4)得到的下层水溶液中加入1～2倍容量的正丁醇，摇匀后静置，待分层后分出上层正丁醇溶液，下层水溶液再用正丁醇用相同方法萃取1～2次，合并上层正丁醇溶液，减压回收溶剂后得到正丁醇萃取物。

步骤(1)中，加入水量为总药材重量的10倍。

步骤(1)中，浸泡时间为30min。

步骤(2)中，水提浓缩液加95％(v/v)乙醇至含醇量为80％(v/v)。

本发明采用麦门冬汤与千金苇茎汤合方，但对其进行的改进，即于麦门冬汤方中删去了组分粳米和大枣。这是因为粳米、大枣为食源性药物，对疾病治疗性功效较弱；本研究用处方是两首经典方剂的合用之方，考虑到全方总药味数的问题，故于方中减去此二物。

麦门冬汤和千金苇茎汤合用，具有清热养阴、润肺降气、祛瘀排脓之功，和现代中医所认为之肺癌的病机“气阴两虚、热毒痰瘀互结”基本相符。

“气阴两虚、热毒痰瘀互结”是肺癌的主要病机。“从多靶点综合考虑治疗肺癌是我国中医药治疗肺癌的特色之一”。中药复方的成分复杂、整体层次研究困难，单一成分研究较容易，但又常失去中医药的特色，因此，对于有效部位群的药效相关性研究就显得尤为重要，它在中药现代化研究中起着承前启后的作用。

有益效果：本发明的麦门冬汤与千金苇茎汤合方的正丁醇萃取物能够显著抑制肺腺癌细胞A549的生长，并对人体正常细胞(人胚肺成纤维细胞HFL-1)无显著影响。提示该提取部位具有细胞毒作用，可以进一步分离筛选抑制肺腺癌细胞A549增殖的组分及单体化合物。

附图说明

图1麦门冬汤合千金苇茎汤有效部位制备流程。

图2不同浓度正丁醇萃取部位对A549细胞增殖的影响(×400)。其中，A为对照组，B为1μg/mL正丁醇部位，C为10μg/mL正丁醇部位，D为100μg/mL正丁醇部位。

图3正丁醇萃取部位对A549细胞的生长抑制作用。

图4正丁醇萃取部位各浓度对A549细胞和HFL-1细胞增殖的影响。

图5不同浓度正丁醇萃取部位处理A549细胞克隆形成情况A为对照组，其中，B为1μg/mL正丁醇部位，C为10μg/mL正丁醇部位，D为100μg/mL正丁醇部位。

图6不同浓度正丁醇萃取部位诱导A549细胞凋亡的形态改变(×200)，其中，A为对照组，B为1μg/mL正丁醇部位，C为10μg/mL正丁醇部位，D为100μg/mL正丁醇部位。

具体实施方式：

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：麦门冬汤与千金苇茎汤合方的正丁醇萃取物的制备。

称取麦冬200g，法半夏100g，生晒参200g，甘草80g，苇茎200g，薏苡仁200g，冬瓜子200g，桃仁100g，组成全方共1280g，粉碎后置于20,000mL圆底烧瓶中，加药材量10倍量纯净水，振摇混合后，浸泡30min；连接回流冷凝装置，置电热套中缓缓加热至110℃沸腾，并保持微沸2小时后，停止加热，放置至溶液温度降为室温，拆掉回流冷凝装置，倾出烧瓶中的溶液，用纱布过滤。药渣再加入纯净水至与第一次相同刻度，同样方法再提取一次，合并提取液，分次用10,000mL圆底烧瓶进行减压浓缩，得到水提浓缩液(MW-01)；如此反复提取药材21.60kg，共得到水提浓缩液(MW-01)5.37kg。将上述浓缩液加95％(v/v)乙醇至含醇量为80％(v/v)，静置24小时，得醇沉上清液2700mL和醇沉沉淀(MW-02)3.85kg；将醇沉上清液减压回收溶剂至无醇味，过滤得到醇沉上清液回收溶剂后沉淀(MW-03)0.05kg和醇沉上清浓缩液(MW-04)1.4kg；将醇沉上清浓缩液平均分成两份，分别倒入两个5000mL的分液漏斗中，各加入1500mL环己烷，摇匀后静置，待分层后分出上层环己烷溶液，下层水溶液再用环己烷同样比例相同方法萃取两次后，减压回收溶剂，得到环己环萃取部分(MW-05)0.18kg；水层再各加入1500mL乙酸乙酯，摇匀后静置，待分层后分出上层乙酸乙酯溶液，下层水溶液再用乙酸乙酯同样比例相同方法萃取两次后，合并上层乙酸乙酯溶液，减压回收溶剂后得到乙酸乙酯萃取部分(MW-06)0.13kg；水层再各加入1500mL正丁醇，摇匀后静置，待分层后分出上层正丁醇溶液，下层水溶液再用正丁醇同样比例相同方法萃取两次后，合并上层正丁醇溶液，减压回收溶剂后得到正丁醇萃取部分(MW-07)0.46kg和水溶性部位(MW-08)0.65kg；具体制备流程图见图1。

实施例2：麦门冬汤与千金苇茎汤合方的正丁醇萃取物对A549细胞抑制作用实验。

1.1材料

1.1.1细胞系  肺癌细胞株A549和人胚肺成纤维细胞HFL-1均购自中科院上海生物细胞所。

1.1.2药物及处理  麦门冬汤合千金苇茎汤正丁醇萃取部位，按实施例1的方法制备而得。正丁醇萃取部位(MW-07)用二甲基亚砜(DMSO)助溶，配制成100mg/mL的母液，-20℃保存，临用前解冻。

1.1.3主要试剂  培养液RPMI1640为美国GIBCO公司产品；优级新生牛血清为杭州四季青生物制品厂产品；胰蛋白酶为AMRESCO公司产品；二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)为AMRESCO公司产品；噻唑蓝(3-[4，5-dimethylthiazol-2-yl]-2，5-diphenyltetrazoliumbromide，MTT)为AMRESCO公司产品；吉姆萨染液购自南京建成生物工程研究所；Hoechst33258染色剂为碧云天生物技术研究所产品；顺铂注射液(DDP，批号071201)为江苏豪森药业股份有限公司产品，其余试剂均为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1细胞培养  人非小细胞肺癌细胞A549和人胚肺细胞HFL-1用含10％小牛血清的RPMI1640(青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL，PH 7.4)培养液，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，取对数生长期的细胞进行实验，分别用各种浓度的正丁醇萃取部位处理细胞，未加药组为对照组(含1‰ DMSO)，阳性药对照组加入终浓度为1μg/mL的顺铂注射液(DDP)。

1.2.2形态学观察  取对数生长期的A549细胞以每孔5×10³个细胞接种于96孔板，培养过夜，于倒置显微镜下观察不同正丁醇萃取部位浓度(1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL)分别作用A549细胞后24h、48h、及72h时细胞形态变化。

1.2.3细胞增殖活性测定  采用噻唑蓝(MTT)比色法进行检测。取对数生长期的A549细胞和HFL-1细胞以每孔5×10³个细胞的密度接种于96孔板，设对照组、阳性药对照组和不同正丁醇萃取部位浓度处理组(1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL)，每组6个复孔。分别于作用后24、48、72h时，每孔加入5mg/mLMTT溶液20μL(以PBS配制)，37℃下继续培养4h，弃去上清，加入DMSO溶解蓝紫色颗粒后，490nm测定吸光度值(A值)，实验重复3次，按以下公式计算细胞生长抑制率。

细胞生长抑制率(％)＝(1-实验组平均A值/对照组平均A值)×100％

1.2.4集落形成测定  采用平板克隆形成实验。取对数生长期的A549细胞，以250个细胞/孔均匀接种于六孔板中，培养过夜，使细胞贴附，加入用含10％小牛血清的RPMI1640培养液稀释的终浓度为1μg/mL，10μg/mL，100μg/mL的正丁醇萃取部位，每组3个平行孔，置37℃、5％CO₂培养箱中培养7天，去除培养液，PBS洗2次，95％乙醇固定10min，吉姆萨染液染色10min，自来水冲洗，晾干，用Quantity One软件计算克隆数，按以下公式计算克隆形成率和克隆形成抑制率。

克隆形成率(％)＝克隆数/接种细胞数×100％；

克隆形成抑制率(％)＝1-(实验组克隆数/对照组克隆数)×100％。

1.2.5凋亡的细胞核形态学检测  采用Hoechst 33258荧光染色。取对数生长期的A549细胞，均匀接种于预置盖玻片的六孔板中，培养24h后，分别以RPMI1640培养液稀释的终浓度为1μg/mL，10μg/mL，100μg/mL的正丁醇萃取部位处理，同时设对照组和阳性药对照组，72h后，吸弃培养液，进行Hochest 33528染色，方法参照说明书进行，染色后荧光显微镜下观察细胞凋亡的形态学改变。结果判断：正常细胞的细胞核呈现弥散均匀荧光，出现细胞凋亡时，细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光，甚至可见DNA荧光碎片。

1.2.6统计学分析  采用统计软件SPSS 15.0行统计分析，所有定量数据均以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，以P≤0.05为差异有显著性统计学意义。

2结果

2.1细胞形态学观察结果  倒置荧光显微镜下(×400)见正常对照组细胞生长旺盛，分布密集，多呈多角形、细胞走向趋于一致，近于排列，并有一定的弧形，高倍镜下可见多角形细胞的细胞体饱满、有2～3个扁平而长的突起，细胞核较大，呈卵圆形且多居中。用正丁醇萃取部位处理A549细胞后，随着药物浓度的增大、作用时间的延长，细胞间隔增宽，突起缩短。细胞质减少，细胞体缩小，黑色颗粒增多(图2)。

2.2MTT比色法检测的结果  各实验组随着正丁醇萃取部位浓度的增大，或作用时间的延长，490nm光吸收A值越来越小(表1)。由此我们得知，正丁醇萃取部位对A549细胞增殖的抑制作用具有时间依赖性和浓度依赖性。

表1  正丁醇萃取部位对A549细胞生长的影响(A值，x±s)

与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与24h比较△P＜0.05，△△P＜0.01

2.3不同浓度正丁醇萃取部位在不同时段对A549细胞的抑制率随正丁醇萃取部位浓度的增大和作用时间的延长，对A549细胞的抑制率逐渐增大，同一时间以100μg/mL正丁醇萃取部位组最为明显，引起的细胞生长抑制率明显高于其他浓度的药物，P＜0.01；同一浓度以作用72h时最明显，作用72h后100μg/mL的正丁醇萃取部位组对细胞的生长抑制率可达＞80％(图3)，而正丁醇萃取部位对人胚肺细胞HFL-1的生存率无显著影响(图4)。

2.3对A549细胞集落形成的影响  经不同浓度正丁醇萃取部位处理后的细胞克隆形成数量明显减少(图5)，随正丁醇萃取部位浓度的增大，集落形成率明显降低，集落形成抑制率显著升高，以100μg/mL正丁醇萃取部位组为最明显，克隆形成抑制率可达88.8％(表2)。

表2不同浓度正丁醇萃取部位处理A549细胞后克隆形成率及克隆形成抑制率的比较

2.4Hoechst 33528染色检测细胞凋亡  经正丁醇萃取部位不同浓度作用72h后，用Hoechst 33528染色，荧光显微镜结果显示(图6)，对照组细胞所发荧光较弱，较均匀，经正丁醇萃取部位处理后，细胞数量减少，出现有高亮蓝色的典型凋亡小体，其细胞皱缩、细胞核固缩、碎裂、发泡、体积变小，荧光强度增高。说明正丁醇萃取部位有明显诱导A549细胞凋亡的作用。从细胞的形态上也可看出经药物作用的癌细胞生长明显受到抑制，有凋亡趋势，呈浓度依赖性。

3讨论

肺癌是世界各国常见的恶性肿瘤之一，在所有恶性肿瘤中增长是最快的，是目前人类癌症死亡的主要原因，并被认为是当今世界对人类健康与生命危害最大的恶性肿瘤，在我国，肺癌占恶性肿瘤发病、死亡的首位。大部分患者就诊时已处于中晚期阶段，现行的常规的治疗手段效果不甚理想。近年来，中医药治疗肺癌在稳定病灶、延长生存时间、改善生存质量等方面发挥了显著的疗效，不仅单用有效，而且可与手术、放疗、化疗联合运用提高临床疗效和减少毒副反应，应用廉价的中药治疗肺癌在临床实践中日益显示出优势。中药复方的成分复杂、整体层次研究困难，单一成分研究较容易，但又常失去中医药的特色，因此，对于有效部位群的药效相关性研究就显得尤为重要，它在中药现代化研究中起着承前启后的作用。

体外实验是目前抗肿瘤药物研究的重要方法，本研究采用人肺腺癌A549细胞为研究对象，对中药复方麦门冬汤合千金苇茎汤有效部位群的体外抑癌作用进行了研究。本研究的检测结果表明，正丁醇萃取部位能有效地抑制A549细胞的体外增殖，并能诱导肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞(人胚肺成纤维细胞HFL-1)无显著影响。细胞无限制快速生长是恶性肿瘤细胞的主要特征之一，从光镜观察及MTT细胞活力实验检测证实：正丁醇萃取部位对A549细胞的生长有明显抑制作用，其抑制率与药物浓度及作用时间呈正相关；集落形成抑制实验也得出一致的结论，克隆形成率是体外抗癌药物敏感性筛选的重要方法之一，由结果可看出正丁醇萃取部位对A549细胞的克隆形成率有明显抑制作用，其抑制率与药物浓度呈剂量依赖关系。而克隆形成率的降低说明经正丁醇萃取部位干预后肿瘤细胞群中有增殖能力的干细胞比例减少，从而抑制了肿瘤细胞的增殖。细胞发生凋亡时，染色质会固缩，Hoechst染色细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染。研究显示，经不同浓度正丁醇萃取部位作用的A549细胞，用Hoechst 33258染色荧光显微镜下观察，均能找到细胞核致密浓缩发白发亮的细胞，其细胞核染色质凝集、边移、并发生碎裂、出现凋亡小体，表明正丁醇萃取部位可以诱导A549细胞凋亡，综合以上结果，提示正丁醇萃取部位诱导A549细胞凋亡是其显著抑制肿瘤细胞增殖的重要途径。

细胞凋亡是一种与细胞坏死具有不同形态及生化特征，且受基因调控的主动性细胞死亡，它是正常细胞发育过程中细胞清除的正常途经，许多研究证据表明，肿瘤的发生与细胞凋亡的调节紊乱密切相关，畸变的凋亡是肿瘤发生的主要原因之一。所有肿瘤细胞都存在凋亡抑制现象。因此，通过诱导细胞凋亡来杀伤和清除肿瘤细胞，已经成为一种筛选抗癌药的快速有效的方法，而且采用外源性药物诱导肿瘤细胞凋亡与诱导细胞坏死相比，不会引起机体强烈的炎症反应，是一种非常理想的方法。

本实验证明正丁醇萃取部位在抑制A549细胞增殖的同时使细胞趋于凋亡，但作用机制尚不清楚，正丁醇萃取部位作为细胞外信号分子，作用于细胞后，其受体和信号转导的过程，以及如何启动细胞凋亡基因表达是值得我们进一步研究的课题。因此，对有效部位群及其进一步提取化合物单体对非小细胞肺癌的信号转导通路及相关作用机制研究值得进一步探讨，同时为丰富中医经典复方有效作用机制提供科学依据。