戊型肝炎病毒抗原、其抗原组合物、及其含有该抗原或抗原组合物的试剂盒和应用

技术领域

本发明涉及一种肝炎病毒抗原，尤其涉及一种戊型肝炎病毒抗原、其抗原组合物、及其含有该抗原或抗原组合物的试剂盒和应用。

背景技术

HEV是一种无包膜的单股正链RNA病毒，基因组全长约7.2kb，有三个开放型读码框(ORF)，从5’端依次为非编码区(NCR)、ORF1、ORF2、ORF3和3’端非编码区及PolyA尾巴。其中ORF3与ORF1 C末断的一个氨基酸和ORF2的N端部分氨基酸重叠。ORF1编码1690个氨基酸，主要是与病毒复制相关的非结构蛋白。ORF2编码660个氨基酸，为病毒的结构蛋白。ORF3编码123个氨基酸，功能尚不太清楚。目前国际病毒分类委员会(ICTV)暂未对其进行准确分类。Lu(Lu L，Li CH，Hagedorn.2006.Phylogenetic analysis of global hepatitis E virus sequences：geneticdiversity，subtypes and zoonosis.Rev Med Virol 16：5-36.)等对Genbank中421个HEV的核苷酸序列进行了分析，HEV主要分为4个基因型，而且具有明显的地域性。1型主要分布在亚洲和非洲等发展中国家，2型主要分布在墨西哥，3型主要在欧洲以及美洲等发达国家，4型主要在亚洲。中国即有1型，也有4型的流行。目前从猪等动物中分离出了大量的HEV 3型和4型的病毒株，认为HEV 3型和4型是人畜共患性，但1型和2型是否是人畜共患性传染病尚需进一步研究。

戊型肝炎(HE)是由戊型肝炎病毒(HEV)引起的一种非甲非乙型病毒性肝炎。HE属典型的自限型疾病，急性肝炎期约持续一到四周，一般不会发展成慢性肝炎。主要经粪-口途径传播，既有散发，也有流行，在卫生条件差的地区常引起大规模爆发流行，主要由水源污染所引起。感染率在15～40岁青壮年最高，孕妇感染HEV后死亡率可达20％，尤其是怀孕三个月左右的孕妇致死率甚至高达25％，幸存者也有着较高的流产率和死胎率。接触传染的几率较低，有可能存在垂直传播和血液传播。HE在亚洲、非洲和美洲等发展中国家人群中发生比较普遍，在一些地区可占到急性病毒性肝炎的50％，是导致发病和病死的重要因素。在一些非HE流行的国家的献血员中HEV抗体阳性率达1～5％。在非HE流行区的养猪者和与猪密切接触的兽医中，抗HEV抗体阳性率远高于普通献血员。

血清学和核酸检测是戊型肝炎流行病学和临床诊断的主要方法。其中前者主要是检测血清中的抗HEV抗体：IgM，IgG和IgA；核酸检测主要是通过检测血清，胆汁和粪便中的HEV RNA.，这些检测可以互补用于帮助临床区别新近感染和既往感染，以减少误诊。

现有的戊型肝炎病原学检测主要有以下几种方法：

1.免疫学检测

免疫学检测的方法主要针对抗HEV抗体，采用酶联免疫检测方法，检测血清中的抗HEV IgM，IgG和IgA抗体。

抗HEV IgG出现的较早，在急性期滴度升高，持续时间长，目前其检测主要采用间接ELISA法，利用重组的ORF2和ORF3抗原进行检测。世界范围内使用较为普遍的商业化试剂为Genelab公司和Abott公司的检测试剂盒。他们均采用HEV 1型和2型抗原为检测抗原。但是，由于抗HEV IgG抗体持续时间较长，所以无法区别既往感染和近期感染。

Chau et al认为，IgA抗体也可以作为HEV近期或急性感染的标识抗体，虽然其阳性持续时间与HEV诊断中的意义还有待临床和流行病学研究的进一步证实。但是，在急性期感染的诊断中，IgA的检测可以作为IgM检测的辅助试验，确证诊断。

通常认为，IgM作为急性感染最重要的标志性抗体出现的要比IgG早。一个理想的IgM检测试剂应该具有以下特点：灵敏，假阳性率低，持续时间短，能够区别近期感染和既往感染。目前国内市面上广泛应用的商业化试剂是新加坡Genelab公司和北京的万泰公司所产。而大多数试剂所采用的抗原都是ORF2的C端和部分或全长的ORF3抗原。

另外，Zhang et al还报道了利用组合的单克隆抗体检测血清中的HEV抗原的方法来诊断急性感染。其ELISA使用的是源于1型和4型的ORF2抗原。

2.分子生物学检测

分子生物学检测是指使用RT-PCR方法检测血清，粪便，胆汁和组织等样本中的HEV RNA.。然而，HEV病毒血症持续时间很短，许多病人就医时已经错过病毒血症或已接近末期，血液中的病毒RNA拷贝数很低，难以通过RT-PCR检出，这种情况在医药卫生条件不发达的发展中国家尤其突出，粪便排毒虽然持续时间略长于病毒血症，但样品采集困难，易受污染且粪便中可能存在影响PCR的物质。

目前报道的RT-PCR在HE病人中检出的阳性率存在很大的差异，从30％到80％不等，这可能与样品采集时间，保存情况，引物匹配，PCR条件和其他不确定因素有关。因此，目前检测HEV RNA的RT-PCR诊断方法仅用于实验室研究，还没有在临床广泛推广应用的商品化试剂。

综上，目前急需一种稳定，快速，高灵敏度和特异性的HEV感染的诊断试剂和基因分型的试剂。为此，本发明人通过对HEV的ORF2和ORF3进行分段表达，并经检测不通抗原片段的抗原性筛选出了最佳的检测抗HEV IgM的抗原片段组合，获得了灵敏度高，特异性强，可以尽早检测样品中出现的抗HEV IgM抗体的试剂盒，从而实现了在HEV感染的早期进行准确检测诊断。

发明内容

本发明的目的在于提供一种戊型肝炎病毒抗原，该抗原的抗原性较佳，特异性强。

为实现本发明的目的，采用如下技术方案：

一种戊型肝炎病毒抗原，其中：

所述抗原的抗原片段为pS1-6、pS4-6、pS1-1或pS4-1；

所述pS1-6为1型HEV ORF2的C末端抗原，其位点为351～391到640～660aa；

所述pS4-6为4型HEV ORF2的C末端抗原，其位点为365～405到654～674aa；

所述pS1-1为1型HEV ORF2的N末端抗原，其位点为1～20到90～130aa；

所述pS4-1为4型HEV ORF2的N末端抗原，其位点为1～20到104～144aa。

优选如下抗原片段：

所述pS1-6为1型HEV ORF2的C末端抗原，其位点为371-660aa；

所述pS4-6为4型HEV ORF2的C末端抗原，其位点为385-674aa；

所述pS1-1为1型HEV ORF2的N末端抗原，其位点为1-110aa；

所述pS4-1为4型HEV ORF2的N末端抗原，其位点为1-124aa。

本发明中，所述的1型HEV ORF2和4型HEV ORF2参见“1型与4型戊型肝炎病毒ORF2抗原性比较”(何鹏、张华远、王佑春和李卓的“1型与4型戊型肝炎病毒ORF2抗原性比较”，中华微生物学和免疫学杂志2006年3月第26卷第3期：210-214)，其中1型HEV ORF2编码660个氨基酸，4型HEV ORF2编码674个氨基酸。

如上述优选的抗原片段具体如下：

pS1-6为编码660个氨基酸的1型HEV ORF2中取371-660aa的片段；

pS4-6为编码674个氨基酸的4型HEV ORF2中取385-674aa的片段；

pS1-1为编码660个氨基酸的1型HEV ORF2中取1-110aa的片段；

pS4-1为编码674个氨基酸的4型HEV ORF2中取1-124aa的片段。

本发明的另一目的在于提供一种戊型肝炎病毒抗原组合物，该抗原组合物抗原性强，特异性强，检出时间早，更适于临床应用。

本发明所述的抗原组合物为所述的抗原组合物为将pS1-6的C末端和pS1-1的N末端组合、pS4-6的C末端和pS4-1的N末端组合、pS1-6的C末端与pS4-1的N末端组合或pS1-1的N末端与pS4-6的C末端组合。

优选的，本发明所提供的抗原组合物为将pS1-6的C末端与pS1-1的N末端组合或将pS4-6的C末端与pS4-1的N末端组合而成的。

本发明还提供一种检测戊型肝炎病毒IgM抗体的试剂盒，该试剂盒实现了在HEV感染的早期进行准确检测诊断的目的，用于间接ELISA方法检测HEV IgM抗体

本发明所提供的试剂盒含有本发明所述的任一抗原或抗原组合物。

本发明还提供所述的抗原或抗原组合物在检测戊型肝炎病毒抗体中的应用，即利用间接ELISA方法检测样本中HEV IgM抗体的体外方法。

以下为本发明的详细描述。

现已确认的HEV基因组共存在3个开放读码框(ORF1-3)。ORF1(28-5106nt)

编码HEV病毒最大的蛋白，该蛋白约186kDa，包括至少4个结构区。到目前为止只有很少实验室能够表达完整的ORF1蛋白，分段表达的ORF1蛋白多用于功能学研究，目前ORF1片段仅在HEV抗体Western印迹检测试剂中应用，ELISA检测试剂中很少使用。

ORF2基因长1980bp(约5147-7126nt)，编码分子量约为72kDa的病毒衣壳蛋白。ORF2蛋白有一个111氨基酸的信号序列和三个可能用于分泌表达的潜在的羰基化位点。在HEV感染中ORF2蛋白抗体具有重要的意义，虽然HEV的感染极力仍未阐明，但作为HEV衣壳蛋白的ORF2蛋白在感染过程中很可能扮演着与宿主细胞膜上的受体结合并诱发病毒衣壳和进入细胞的角色，因此目前一经发现的多数中和抗体都为抗ORF2蛋白抗体。

目前用于抗体检测的ORF2蛋白主要来源于昆虫细胞系统表达的完整ORF2蛋白和大肠杆菌系统表达的ORF2蛋白片段，但不同的抗原表现出不同的抗体结合力，比如ORF2蛋白片段比ORF2蛋白全长能更有效的结合恢复期病人血清中的抗HEV抗体。目前市场上所使用的试剂使用的抗原多为ORF2的C端片段，几乎没有使用其N端抗原的试剂。而且，其基因来源多为1型和2型。但是，在中国既有1型，也有4型，且4型的ORF2蛋白较1型的ORF2蛋白长14个氨基酸。

ORF3编码HEV病毒的一个小磷酸化蛋白，分子量约为13.5kDa。它同被成为AMBP的肝细胞骨架蛋白相互作用。ORF3蛋白较小，其含有的抗原表位也相对较少，其C端，尤其是105-122aa据说抗原性较高，HE病人中针对该表位的抗体阳性率较高，目前抗体诊断试剂中多包含ORF3蛋白的部分片段，其基因来源同ORF2，也多为1型和2型。而中国流行的4型HEV其ORF3蛋白较1型的ORF3蛋白短9个氨基酸。

为了获得检测HEV IgM抗体的高灵敏度检测方法，本发明人从患者的粪便样品中钓出1型和4型的两株病毒基因，将其在大肠杆菌中分段表达，比较两个基因型间统一区域和基因型内不通区域抗原片段的抗原性，筛选出最佳抗原，进行ELISA检测。

除非另外定义，这里所有的技术和科学名词都表达的是在本发明涉及领域里熟练技术人员所理解的通常含义。这里所用的命名和在细胞培养，分子遗传学，核酸化学，免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。

本发明的一方面，涉及两个基因型HEV ORF2抗原的C末端和N末端抗原位点，其为：

所述抗原的抗原片段为pS1-6、pS4-6、pS1-1或pS4-1；

所述pS1-6为1型HEV ORF2的C末端抗原，其位点为351～391到640～660aa；

所述pS4-6为4型HEV ORF2的C末端抗原，其位点为365～405到654～674aa；

所述pS1-1为1型HEV ORF2的N末端抗原，其位点为1～20到90～130aa；

所述pS4-1为4型HEV ORF2的N末端抗原，其位点为1～20到104～144aa。

优选如下抗原片段：

所述pS1-6为1型HEV ORF2的C末端抗原，其位点为371-660aa；

所述pS4-6为4型HEV ORF2的C末端抗原，其位点为385-674aa；

所述pS1-1为1型HEV ORF2的N末端抗原，其位点为1-110aa；

所述pS4-1为4型HEV ORF2的N末端抗原，其位点为1-124aa。

本发明的另一方面，涉及抗原组合物，戊型肝炎的一型和四型的ORF2抗原的两端组合，即对应亚型的N端和C端组合。具体为将所述的抗原组合物为将pS1-6的C末端和pS1-1的N末端组合、pS4-6的C末端和pS4-1的N末端组合、pS1-6的C末端与pS4-1的N末端组合或pS1-1的N末端与pS4-6的C末端组合。优选将pS1-6的C末端与pS1-1的N末端组合或将pS4-6的C末端与pS4-1的N末端组合而成的。

本发明的再一方面，涉及一种利用前述任一抗原组合物及其中的任何一种抗原用于间接ELISA方法检测HEV IgM抗体的试剂盒。

本发明涉及一种利用间接ELISA方法检测样本中HEV IgM抗体的体外方法。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1)本发明所提供的抗原或抗原组合物抗原性强、特异性强；

2)本发明所提供的试剂盒灵敏度高，特异性强，可以尽早检测样品中出现的抗HEV IgM抗体的试剂盒，从而实现了在HEV感染的早期进行准确检测诊断；

3)本发明所提供的抗原或抗原组合物可应用在检测戊型肝炎病毒抗体中，从而利用间接ELISA方法检测样本中HEV IgM抗体的体外方法。

附图说明

图1-A为纯化后的融合多肽pS1-1到6的SDS-PAGE检测；

图1-B为纯化后的融合多肽pS4-1到6的SDS-PAGE检测；

图1-C为纯化后的融合多肽pS1-9，pS1-7，pS1-8，pS4-9，pS4-7和pS4-8的SDS-PAGE检测，其中M表示预染蛋白质marker；

图2-A为免疫印迹分析已纯化的融合多肽pS4-1到9的抗HEV IgM抗体反应，图中M表示预染蛋白质marker；

图2-B为免疫印迹分析已纯化的融合多肽pS1-9到1的抗HEV IgM抗体反应，其中M表示预染蛋白质marker，一抗为抗HEV IgM抗体反应阳性的猴子免疫血清；

图3-A、图3-B、图3-C和图3-D为接种了人源的1型HEV感染的猴子的系列血清测多肽的HEV IgM反应；

图3-E和图3-F为接种了人源的4型HEV感染的猴子的系列血清测多肽的HEVIgM反应；

图3-G、图3-H、图3-I和图3-J为接种了猪源的4型HEV感染的猴子的系列血清测多肽的HEV IgM反应；

其中图3-A-J中0周为接种前，接种后依次每周采血。其抗HEV IgM抗体用ELISA方法检测，包被以下抗原：1型的pS1-1，pS1-6和pS1-8，4型的pS4-1，pS4-6和pS4-8。其值使用S/CO表示，1作为阳性临界。

图4-A-J分别使用1型和4型的组合抗原pS1-1+pS1-6和pS4-1+pS4-6，应用ELISA方法检测图3-A-J中的系列血中的抗HEV IgM反应。

图5-A-C检测急性肝炎患者系列血清中的IgM抗体。检测方法是ELISA，包被抗原为1型和4型的单个抗原或组合抗原。