SR蛋白质的磷酸化控制方法以及以包含SR蛋白质活性控制剂的试剂为有效成分的抗病毒剂

具体实施方式

通过抑制SR蛋白质磷酸化的SRPK酶可抑制HIV的复制，由此本发明人对是否可广泛应用该现象提供相对于广泛的病毒的抗病毒剂进行了研究。

I.SR蛋白质活性的降低：分解和稳定化

(1)本发明人研究了细胞的HIV病毒感染与SR蛋白质的磷酸化状态以及细胞中是否存在SR蛋白质的关系。具体而言，使NL4-3型HIV病毒感染293细胞后，利用SR蛋白质的抗体和磷酸化的SR蛋白质的抗体研究了细胞中的磷酸化蛋白质和细胞中的SR蛋白质(总量)。

另外，研究了强制表达了磷酸化SR蛋白质的SRPK的细胞的HIV病毒感染与同细胞内SR蛋白质的磷酸化状态和细胞中是否存在SR蛋白质的关系。具体而言，同上，NL4-3型HIV病毒感染强制表达SRPK-2的293细胞后，利用SR蛋白质的抗体和磷酸化SR蛋白质的抗体研究同细胞中的磷酸化蛋白质和细胞中SR蛋白质(总量)。

由上述结果可知，SR蛋白质由于被磷酸化而在细胞中稳定化，相反，通过将SR蛋白质脱磷酸化，可使SR蛋白质分解。

为了验证，本发明人使SR-HA融合蛋白质在293细胞内表达，通过作为泛素、蛋白酶体抑制剂的MG132的添加与否，测定与抗HA-抗体反应的融合SR-HA的信号强度，发现蛋白质分解被MG132抑制，因此，可知SR蛋白质经泛素、蛋白酶体途径分解。

即推测对应于病毒感染，宿主作为防御机构进行SR蛋白质的分解。但是，在SR蛋白质的磷酸化酶强制表达的状态下，SR蛋白质由于被磷酸化而不分解，被稳定化，破坏了防御机构，促进了病毒的产生。

即，可知SR蛋白质由于被脱磷酸化而经泛素、蛋白酶体途径分解。SR蛋白质对基因转录是不可缺少的，因此通过将SR蛋白质脱磷酸化，可抑制病毒增殖。

(2)下面研究SR蛋白质磷酸化酶的抑制。作为磷酸化SR蛋白质的磷酸化酶，可考虑SRPK1/2、Clk/Sty家族激酶、PRP4、DNA拓扑异构酶I等，对各自在剪接中的功能差异还有很多不明了之处。因此，本发明人通过使用作为SRPK抑制剂的SRPIN-1研究了抑制SRPK导致的病毒感染细胞的病毒产生状态。

于是，发现利用SRPIN-1抑制SRPK引起积极的SR蛋白质分解。

(3)进一步，感染HIV的同时，使促进剪接的SR蛋白质和已知在体外具有拮抗剪接作用的hnRNPA1在细胞中强制表达，首次发现SRp40和SRp75在体内进一步使HIV产生亢进，并且hnRNPA1的量依赖性地抑制HIV产生。

由以上可知，SR蛋白质的脱磷酸化是生物体(人体)对病毒的防御反应，已经证实腺病毒和牛痘病毒感染动物细胞后，该动物细胞内的SR蛋白质发生脱磷酸化(Nature Vol.393pp.185-187，EMBO RepVol.3PP.1088-1093)，如上所述，如SR蛋白质脱磷酸化则会迅速分解，从而不能用于病毒基因的表达，结果这些病毒也不能增殖。

本发明人还发现，对于与HIV不同的病毒的辛德比斯病毒、巨细胞病毒(Cytomegalovirus)以及SARS冠状病毒，也与HIV同样，通过SRPK抑制剂抑制SR蛋白质的活性可抑制病毒增殖。因此，可以说利用控制SR蛋白质的活性的抗病毒作用对广泛的病毒有效。

II.本申请发明包括通过抑制SR蛋白质的活性的抗病毒剂、病毒产生抑制方法以及病毒病治疗方法。本发明包括含有SR蛋白质活性控制剂作为有效成分的抗病毒剂。在此，SR蛋白质活性控制包括表达控制和稳定化控制。例如，通过抑制SR蛋白质的转录或翻译，或者降低编码SR蛋白质的mRNA的稳定性或SR蛋白质的稳定性，来降低SR蛋白质活性。在本发明的SR蛋白质活性控制中，优选使用直接或间接降低SR蛋白质活性或表达量的SR蛋白质活性抑制剂。为了降低SR蛋白质活性或表达量，除了将SR蛋白质作为直接目标以外，优选例如通过SRPK抑制SR蛋白质的磷酸化和/或促进脱磷酸化。例如，通过活化蛋白质磷酸酶2A(也记作磷酸酶2A)促进SR蛋白质的脱磷酸化。因此，可用提高蛋白质磷酸酶2A的表达和/或活性的化合物抑制病毒的增殖。另外，通过抑制SRPK的表达和/或活性可抑制SR蛋白质的磷酸化。因此，SRPK抑制剂是本发明优选的抗病毒剂。

[控制对象SR蛋白质]

在本申请发明中要降低或抑制其活性的SR蛋白质包括任意的SR蛋白质，即X16/SRp20、SF2/ASF/SRp30a、SC35/PR264/SRp30b、SRp30c、9G8、HRS/SRp40、SRp46、SRp55、SRp75和p54，优选SF2/ASF/SRp30a、SC35/PR264/SRp30b、SRp30c、HRS/SRp40、SRp46和SRp75，特别优选SRp40和SRp75。以下在提到SR蛋白质时，是指SF2/ASF/SRp30a、SC35/PR264/SRp30b、SRp30c、HRS/SRp40、SRp46或SRp75。

编码X16/SRp20的基因序列示于例如登录号L10838的1-492中。另外，X16/SRp20的氨基酸序列示于登录号NP_003008、AAA36648(Zahler，A.等人，1992，SR proteins：a conserved familyof pre-mRNA splicing factors，Genes Dev.6：837-847)。编码SF2/ASF/SRp30a的基因序列示于例如登录号NM_006924的91-834中。另外，SF2/ASF/SRp30a的氨基酸序列示于登录号NP_008855、Q07955(Ge，H.等人，Cell 66，373-382(1991))。编码SC35/PR264/SRp30b的基因序列示于例如登录号M90104的156-818中。另外，SC35/PR264/SRp30b的氨基酸序列示于登录号AAA60306、Q01130(Fu，X.D.and Maniatis，T.Science 256，535-538(1992))。编码SRp30c的基因序列示于例如登录号U30825的53-715、NM_003769的147-809中。另外，SRp30c的氨基酸序列示于登录号AAA93069、Q13242、NP_003760(Screaton，G.R.等人，EMBO J.14，4336-4349(1995))。编码9G8的基因序列示于例如登录号NM_006276的54-464中。另外，9G8的氨基酸序列示于登录号NP_006267、Q16629等中(Lejeune，F.等人，J.Biol.Chem.276，7850-7858(2001)；Popielarz，M.等人，J.Biol.Chem.270，17830-17835(1995)；Cavaloc，Y.等人，EMBO J.13，2639-2649(1994))。编码HRS/SRp40的基因序列示于例如登录号AF020307中(join(2406-2531，2864-2925，3049-3147，3433-3503，4740-4812，5269-5382，5472-5492))，氨基酸序列示于登录号AAC39543、Q13243等(Du，K.And Taub，R.，Gene204(1-2)，243-249(1997)；Screaton，G.R.等人，EMBO J.14，4336-4349(1995))。编码SRp46的基因序列示于例如登录号AF031166的1-816中。另外，SRp46的氨基酸序列示于登录号AAK54351等(Soret，J.等人，Mol.Cell.Biol.18，4924-4934(1998))。编码SRp55的基因序列示于例如登录号U30883的106-1137中。另外，SRp55的氨基酸序列示于登录号AAA93073、Q13247等(Screaton，G.R.等人，EMBO J.14，4336-4349(1995)；Zahler，A.M.等人，Gene Dev.6，837-847(1992)；Barnard，D.C.and Patton，J.G.，Mol.Cell.Biol.20，3049-3057(2000))。编码SRp75的基因序列示于例如登录号BC002781的98-1579、NM_005626的98-1579中。另外，SRp75的氨基酸序列示于登录号AAH02781、NP-005617、Q08170等(Zahler，A.M.等人，Mol.Cell.Biol.13，4023-4028(1993))。编码p54的基因序列示于例如登录号M74002的84-1535中。另外，p54的氨基酸序列示于登录号AAA35554、Q05519等(Chaudhary，N.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88，8189-8193(1991))。

[对象病毒]

本发明的抗病毒剂特别适合于抑制HIV的增殖，但不限于人免疫缺陷病毒(HIV)，对包括属于RNA病毒的严重急性呼吸道综合症(SARS)、脊髓灰质炎病毒、人类鼻病毒、成人T细胞白血病病毒(HTLV-I)、甲型、丙型、丁型或戊型等乙型以外的肝炎病毒、牛痘病毒、日本脑炎病毒、登革热病毒、人冠状病毒、Ebola出血热病毒、流感病毒、辛德比斯病毒也由同样的效果。要说明的是，人冠状病毒包括SARS冠状病毒(SARS-associated eoronavirus或SARS病毒)。

另外也报道了感染了作为DNA病毒的单纯疱疹病毒、人腺病毒的宿主的防御机构的SR蛋白质的脱磷酸化，因此，SRPIN-1的效果对包括单纯疱疹病毒、人腺病毒，对乙型肝炎病毒、巨细胞病毒、EB病毒、疱疹病毒、人疱疹病毒、天花病毒、多瘤病毒、人乳头瘤病毒也具有同样的活性。

在本发明中，作为特别优选的目标病毒，可列举逆转录病毒科病毒(Retroviridae；包括慢病毒属病毒)、披膜病毒科病毒(披盖病毒；包括甲病毒属病毒)、疱疹科病毒(Herpesviridae；包括巨细胞病毒属病毒)、冠状病毒科病毒(Coronaviridae，包括冠状病毒属病毒)。

[抗病毒剂]

本发明包括(1)降低或抑制SR蛋白质的活性的抗病毒剂、更具体地包括(i)促进SR蛋白质脱磷酸化的抗病毒剂、以及(ii)抗病毒剂，其抑制磷酸化SR蛋白质的蛋白质。

进一步，本发明包括(2)抑制SR蛋白质的表达的抗病毒剂、以及(3)活化具有与SR蛋白质相反功能的蛋白质的抗病毒剂。

特别是，本发明涉及包括抑制SRPK的活性和/或表达的化合物的抗病毒剂。通过抑制SRPK的活性和/或表达，抑制有利于SR蛋白质稳定化的磷酸化，结果促进SR蛋白质分解，降低了SR蛋白质的活性。因此，SRPK(SRPK1和/或SRPK2)是本发明的特别优选的抑制目标。

[病毒产生抑制方法]

另外，本发明中包括(1)降低或抑制SR蛋白质的活性的病毒产生抑制方法、更具体地包括(i)促进SR蛋白质的脱磷酸化的病毒产生抑制方法、以及(ii)抑制磷酸化SR蛋白质的蛋白质的病毒产生抑制方法。特别是，本发明涉及包括抑制SRPK的活性和/或表达步骤的病毒产生抑制方法。通过抑制SRPK，抑制了SR蛋白质的磷酸化，SR蛋白质水平降低，SR蛋白质的活性降低。

进一步，本发明包括(2)抑制SR蛋白质的表达的病毒产生抑制方法、以及(3)活化具有与SR蛋白质相反功能的蛋白质的病毒产生抑制方法。

即，本发明包括下述发明：

[M1]抑制病毒增殖的方法，其包括降低SR蛋白质的活性或表达量的步骤，

[M2] [M1]所述的方法，其中，SR蛋白质为SF2/ASF/SRp30a、SC35/PR264/SRp30b、SRp30c、HRS/SRp40、SRp46或SRp75，

[M3] [M1]或[M2]所述的方法，其中，降低SR蛋白质的活性或表达量的步骤为抑制SR蛋白质的磷酸化或促进脱磷酸化的步骤，

[M4] [M3]所述的方法，其中，抑制SR蛋白质的磷酸化或促进脱磷酸化的步骤为提高蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A)活性的步骤，

[M5] [M4]所述的方法，其中，提高蛋白磷酸酶2A活性的步骤为将选自HIV的tat基因、腺病毒的E4-ORF4基因以及牛痘病毒的VH1基因中的1种或以上基因导入表达载体的步骤。

[M6] [M3]所述的方法，其中，抑制SR蛋白质的磷酸化或促进脱磷酸化的步骤为抑制SRPK的表达或活性的步骤。

[M7] [M6]所述的方法，其中，SRPK为SRPK1或SRPK2。

[M8] [M6]或[M7]所述的方法，其中，抑制SRPK的表达或活性的步骤为施用下述通式表示的苯胺衍生物、其可药用的盐或它们的水和物的步骤，

上式中的R¹、R²、R³、R⁴、Q和W与本说明书上述[16]相同。

[M9] [M8]所述的方法，其中，上述R¹为氢原子、可以具有取代基的C_1-6烷基或卤原子。

[M10] [M8]或[M9]所述的方法，其中，上述R²为氢原子或C_1-6烷基。

[M11] [M8]～[M11]任意一项所述的方法，其中，上述R³为可以具有取代基的C_6-10芳基或可以具有取代基的5～10元含氮杂芳基。

[M12] [M8]～[M11]任意一项所述的方法，其中，上述R⁴为氢原子。

[M13] [M8]～[M12]任意一项所述的方法，其中，上述W为氢原子、卤原子或下述通式(II)

(式中，R⁵和R⁶同上)。

[M14] [M8]所述的方法，其中，[M8]所述的苯胺衍生物选自本说明书所述的化合物编号为340、348、613、616、618、622、624。

[M15] [M6]所述的方法，其中，抑制SRPK的表达或活性的步骤是导入SRPK的miRNA或siRNA或吗林代低聚物、或该miRNA或siRNA的表达载体的步骤，

[M16] [M1]或[M2]所述的方法，其中，降低SR蛋白质的活性或表达量的步骤为施用具有与SR蛋白质相反活性的物质的步骤。

[M17] [M16]所述的方法，其中，具有与SR蛋白质相反活性的物质为hnRNP A1表达载体，

[M18] [M1]或[M17]的任意一项所述的方法，其中，病毒为(1)人免疫缺陷病毒(HIV)、严重急性呼吸道综合症(SARS)、脊髓灰质炎病毒、人类鼻病毒、成人T细胞白血病病毒(HTLV-I)、甲型、丙型、丁型或戊型肝炎病毒、牛痘病毒、日本脑炎病毒、登革热病毒、人冠状病毒、Ebola出血热病毒、流感病毒、或辛德比斯病毒中的任意一种RNA病毒、或者(2)单纯疱疹病毒、人腺病毒、乙型肝炎病毒、巨细胞病毒、EB病毒、疱疹病毒、人疱疹病毒、天花病毒、多瘤病毒、或人乳头瘤病毒中的任意一种DNA型病毒。

[M19]抑制SRPK的方法，其中包括施用[M8]所述的苯胺衍生物、其可药用的盐或它们的水和物的步骤，

[M20] [M19]所述的方法，其中，SRPK为SRPK1或SRPK2。

[M21] [M19]或[M20]所述的方法，其中，上述R¹为氢原子、可以具有取代基的C_1-6烷基或卤原子。

[M22] [M19]～[M21]任意一项所述的方法，其中，上述R²为氢原子或C_1-6烷基。

[M23] [M19]～[M22]任意一项所述的方法，其中，上述R³为可以具有取代基的C_6-10芳基或可以具有取代基的5～10元含氮杂芳基。

[M24] [M19]～[M23]任意一项所述的方法，其中，上述R⁴为氢原子。

[M25] [M19]～[M24]任意一项所述的方法，其中，上述W为氢原子、卤原子或下述通式(II)表示的结构，

(式中，R⁵和R⁶同上)。

[M26] [M19]所述的方法，其中，[M8]所述的苯胺衍生物选自本说明书所述的化合物编号为340、348、613、616、618、622、624的化合物、其可药用的盐或它们的水和物。

另外，本发明还涉及降低SR蛋白质表达和/或活性的化合物在抑制病毒增殖中的用途，以及在制备抗病毒剂(用于抑制病毒增殖的试剂和/或药物)中的用途，具体而言，本发明涉及以下发明：

[U1]降低SR蛋白质的活性或表达量的化合物在抑制病毒增殖的用途、或在制备抗病毒剂中的用途。

[U2] [U1]所述的用途，其中，SR蛋白质为SF2/ASF/SRp30a、SC/35/PR264/SRp30b、SRp30c、HRS/SRp40、SRp46或SRp75，

[U3] [U1]或[U2]所述的用途，其中，降低SR蛋白质的活性或表达量的化合物为抑制SR蛋白质磷酸化或促进SR蛋白质脱磷酸化的化合物，

[U4] [U3]所述的用途，其中，抑制SR蛋白质磷酸化或促进SR蛋白质脱磷酸化的化合物为提高蛋白磷酸酶2A活性的化合物，

[U5] [U4]所述的用途，其中，提高蛋白磷酸酶2A活性的化合物为选自表达HIV的tat基因、腺病毒的E4-ORF4基因以及牛痘病毒的VH1基因中的1种或以上的基因的载体。

[U6] [U3]所述的用途，其中，抑制SR蛋白质磷酸化或促进SR蛋白质脱磷酸化的化合物为抑制SRPK表达或活性的化合物。

[U7] [U6]所述的用途，其中，SRPK为SRPK1或SRPK2。

[U8] [U6]所述的用途，其中，抑制SRPK表达或活性的化合物是下述通式表示的苯胺衍生物、其可药用的盐或它们的水和物，

上式中的R¹、R²、R³、R⁴、Q和W与本说明书上述[16]相同。

[U9] [U8]所述的用途，其中，上述R¹为氢原子、可以具有取代基的C_1-6烷基或卤原子。

[U10] [U8]或[U9]所述的用途，其中，上述R²为氢原子或C_1-6烷基。

[U11] [U8]～[U10]任意一项所述的方法，其中，上述R³为可以具有取代基的C_6-10芳基或可以具有取代基的5～10元含氮杂芳基。

[U12] [U8]～[U11]任意一项所述的用途，其中，上述R⁴为氢原子。

[U13] [U8]～[U12]任意一项所述的用途，其中，上述W为氢原子、卤原子或用下述通式(II)表示，

(式中，R⁵和R⁶同上)。

[U14] [U8]所述的用途，其中，[U8]所述的苯胺衍生物选自本说明书所述化合物编号340、348、613、616、618、622、624的化合物。

[U15] [U6]所述的用途，其中，抑制SRPK表达或活性的化合物为针对SRPK的miRNA或siRNA或吗林代低聚物、或该miRNA或siRNA的表达载体，

[U16] [U1]或[U2]所述的用途，其中，降低SR蛋白质的活性或表达量的步骤为施用具有与SR蛋白质相反活性的物质的步骤。

[U17] [U16]所述的用途，其中，具有与SR蛋白质相反活性的物质为hnRNP A1表达载体。

[U18] [U1]～[U17]的任意一项所述的用途，其中，病毒为(1)人免疫缺陷病毒(HIV)、严重急性呼吸道综合症(SARS)、脊髓灰质炎病毒、人类鼻病毒、成人T细胞白血病病毒(HTLV-I)、甲型、丙型、丁型或戊型肝炎病毒、牛痘病毒、日本脑炎病毒、登革热病毒、人冠状病毒、Ebola出血热病毒、流感病毒、或辛德比斯病毒中的任意一种RNA病毒、或者(2)单纯疱疹病毒、人腺病毒、乙型肝炎病毒、巨细胞病毒、EB病毒、疱疹病毒、人疱疹病毒、天花病毒、多瘤病毒、或人乳头瘤病毒中的任意一种DNA型病毒。

[U19] [U8]所述的苯胺衍生物、其可药用的盐或它们的水和物在抑制SRPK中的用途、或在制备SRPK抑制剂中的用途，

[U20] [U19]所述的用途，其中，SRPK为SRPK1或SRPK2。

[U21] [U19]或[U20]所述的用途，其中，上述R¹为氢原子、可以具有取代基的C_1-6烷基或卤原子。

[U22] [U19]～[U21]任意一项所述的用途，其中，上述R²为氢原子或C_1-6烷基。

[U23] [U19]～[U22]任意一项所述的用途，其中，上述R³为可以具有取代基的C_6-10芳基或可以具有取代基的5～10元含氮杂芳基。

[U24] [U19]～[U23]任意一项所述的用途，其中，上述R⁴为氢原子。

[U25] [U19]～[U24]任意一项所述的用途，其中，上述W为氢原子、卤原子或下述通式(II)表示的结构，

(式中，R⁵和R⁶同上)。

[U26] [U19]所述的用途，其中，[U8]所述的苯胺衍生物为选自本说明书所述的化合物编号为340、348、613、616、618、622、624的化合物、其可药用的盐或它们的水和物。

[治疗方法]

本发明包括(1)降低或抑制SR蛋白质活性的病毒病的治疗或预防方法、更具体地包括(i)通过使SR蛋白质脱磷酸化治疗或预防病毒病的方法、以及(ii)通过抑制使SR蛋白质磷酸化的蛋白质的治疗或预防病毒病方法。特别是，本发明涉及包括抑制SRPK的活性和/或表达步骤的病毒病的治疗或预防方法。通过抑制SRPK，抑制了SR蛋白质的磷酸化，SR蛋白质水平降低，从而抑制病毒增殖。

进一步，本发明包括(2)抑制SR蛋白质的表达的病毒治疗或预防方法、以及(3)活化具有与SR蛋白质相反功能的蛋白质的病毒治疗或预防方法。

III.本申请还包括抗病毒剂的筛选方法以及SRPK酶抑制剂的利用。

[抗病毒剂的筛选方法]

本申请还包括(1)SR蛋白质或2个或2个以上的RS或SR的肽作为SRPK的基质的SRPK酶抑制剂的筛选方法。

[SRPK酶抑制剂及其利用]

本发明还包括(1)含有SRPIN-1或其类似物作为有效成分的SRPK酶抑制剂、(2)含有SRPIN-1或其类似物作为有效成分的病毒增殖抑制剂以及(3)含有SRPIN-1或其类似物作为有效成分的抗病毒治疗药。

IV.本发明的具体公开

(1)降低或抑制SR蛋白质活性的抗病毒剂

(i)使SR蛋白质脱磷酸化的抗病毒剂

作为使SR蛋白质脱磷酸化的抗病毒剂，包括活化磷酸酶2A(Mumby，M.C.and Walter，G.(1993)Physiol.Rev.73，673-680；Lechward，K.，Awotunde，O.S.，Swiatek，W.and Muszynska，G.(2001)Acta Biochem.Pol.48，921-933；Cohen，P.(1989)The structure andregulation of protein phosphatases.Annu.Rev.Biochem.58，453-508；Janssens，V.and Goris，J.(2001)Biochem.J.353，417-39)的活化剂，具体而言，编码HIV的tat基因的多肽(例如，登录号AAK08486)、编码腺病毒的E4-ORF4的多肽(例如，登录号AAB37507)、或编码牛痘病毒的VH1基因的多肽(例如，登录号AAV38329)。还包括载有HIV的tat基因、腺病毒的E4-ORF4基因或牛痘病毒的VH1基因的基因治疗用的表达载体。作为tat基因，可列举登录号AF324493的CDS(5830-6044和8369-8411)，作为E4-ORF4，可列举登录号S82508的CDS(1634-1993)，作为牛痘病毒的VH1，可列举登录号BT019522的CDS(1-555)。

(ii)SR蛋白质的磷酸化酶抑制剂

(ii-1)作为磷酸化SR蛋白质的酶，已知各种磷酸化酶，这些酶的RS结构域的磷酸化部位不同，这些RS磷酸化酶中，作为可进行有助于SR蛋白质稳定化的特定的磷酸化的酶，本发明人发现仅为SRPK。因此，为了防止SR蛋白质因磷酸化而被稳定化，作为磷酸化目标SR蛋白质的酶，可特别列举SR蛋白质磷酸化酶中的SRPK。作为SRPK，可列举SRPK1(Nature(1994)Vol.369，PP.678-682)和SRPK2(Biochem.Biophys.Res.Commun.(1998)Vol.242：pp.357-364；Wang，H.Y.等人，J.Cell.Biol.1998，140：737-750)二者。SRPK1的碱基序列可参照登录号NM-003137的124-2088、U09564的109-2073，AJ318054的10-2487、NM_016795的43-1986等，氨基酸序列可参照NP_003128、AAA20530、CAC39299、CAA11833、NP_058075等。另外，SRPK2基因的碱基序列可参照登录号U88666的188-2245，NM_009274的208-2253等，氨基酸序列可参照AAC05299、NP_033300等(Nikolakaki，E.等人，J.Biol.Chem.276，40175-40182(2001)；Papoutsopoulou，S.，等人，Nucleic Acids Res.27，2972-2980(1999)；Wang，H.Y.等人，Genomics 57，310-315(1999)；Gui，J.F.等人，Nature 369，678-682(1994)；Wang，H.Y.等人，J.Cell Biol.140，737-750(1998)；Papoutsopoulou，S.，等人，Nucleic Acids Res.27，2972-2980(1999)；Kuroyahagi，N.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.242，357-364(1998)；Bedford，M.T.等人，EMBO J.16，2376-2383(1997))。SRPK1中还包括SRPK1a。

作为在本发明的方法忠使用的具有抑制磷酸化酶(SRPK)功能的物质，可使用下述通式表示的化合物(包括SRPIN-1及其类似物)、以及它们可药用的盐和水和物。

(式中，R¹表示氢原子、可以具有取代基的C_1-6烷基、可以具有取代基的C_2-6烯基、可以具有取代基的C_2-6炔基、可以具有取代基的C_6-10芳基、卤原子、硝基、氰基、叠氮基、羟基、可以具有取代基的C_1-6烷氧基、可以具有取代基的C_1-6烷硫基、可以具有取代基的C_1-6烷基磺酰基、羧基、甲酰基、可以具有取代基的C_1-6烷氧基羰基、酰基、酰基氨基、或氨磺酰基；

R²表示氢原子、可以具有取代基的C_1-6烷基或可以具有取代基的芳基；

R³表示可以具有取代基的C_1-6烷基、可以具有取代基的C_2-6烯基、可以具有取代基的C_6-10芳基、可以具有取代基的含氮杂环或可以具有取代基的稠合芳杂环；

R⁴表示氢原子或卤原子；

Q表示-C(O)-、-C(S)-、-SO₂-、-C(S)NHC(O)-、-C(O)NHC(O)-或-C(O)NHC(S)-；

W表示氢原子、可以具有取代基的C_1-6烷基、可以具有取代基的C_6-10芳基、卤原子、羟基、可以具有取代基的C_1-6烷氧基、可以具有取代基的C_1-6烷硫基、可以具有取代基的含氮杂环或可以具有取代基的稠合芳杂环、或下述通式(II)

(式中，R⁵和R⁶相同或不同，表示氢原子、可以具有取代基的C_1-6烷基、可以具有取代基的含氮杂环、可以具有取代基的稠合芳杂环、酰基或酰基氨基；而且

上述R⁵和R⁶可以与相邻的氮原子连接，形成可以具有取代基的杂环，该杂环可以是可以具有取代基的稠合芳杂环；

上述R⁵和R⁶也可以是可以具有取代基的环亚烷基氨基或可以具有取代基的芳环稠合环亚烷基)，

作为上述化合物的一例，可列举以下化合物：

作为X，可列举F、Cl、Br、I或At。

具体地可列举下面的SRPIN-1：

本发明的SRPIN-1可从Maybridge公司(Trevillett，Tintagel，Cornwall PL34 OHW，England)和Ambinter公司(46 quai LouisBleriot，Paris，F-75016 France)得到，大致可如下进行化学合成。

(ii-2)利用针对SRPK1基因和SRPK2基因的RNAi的抗病毒剂

在细胞内，可利用siRNA、吗啉代低聚物或miRNA降低编码SRPK1和SRPK2的基因的表达水平。

可使用公知的方法设计siRNA，例如可用下述方法。

(ii-2-1)作为siRNA的靶序列，可避开5′端和3′端的UTR(非翻译区)或起始密码子，使用距起始密码子50碱基以上的下游的、OFR中从AA或NA开始的19～21碱基(一般为19碱基)，CG含量为50％左右的，并且向5′和3′的偏嗜或重复序列尽可能少的序列。

siRNA从AA开始时，可用dTdT或UU2碱基的突出端，从NA开始的靶序列时，可用dTdN、dTdT或UU进行制备。

为了防止与目标靶序列以外的序列发生交叉反应，影响目标以外的蛋白质的表达，用BLAST检索等确认选出的序列与其它RNA序列的同源性。

要说明的是，使用将设计的siRNA在细胞内表达而制备的siRNA表达载体的方案也包括在本发明中。

吗啉代低聚物是指多个具有碱基的吗啉代亚单位连成链状的化合物，含有吗啉环和非离子性磷酸二酰胺化物(phosphorodiamidate)的亚单位键合的结构(US Patents 5,142,047，5,185,444)。细胞内的稳定性高，对mRNA亲和性高，因此吗啉代反义低聚可适用于抑制目标基因的表达(Summerton JE.，Ann NY Acad Sci 2003；1002：189)。有效的吗啉代低聚物的设计方法是已知的(参照Summerton，1989，In：Discoveries in Antisense Nuleic acids；Ed.：C.Brakel；Pub.：The Portfolio Publishing Co.，Woodlands，Texas；pages 71-80；Summerton & Weller，1997，Antisense Nuc.Acid DrugDev.7，187；以及Gene Tools公司网站)。吗啉代低聚物可从GeneTools公司(Gene Tools，LLC，Philomath，OR)得到。

(2)抑制编码SR蛋白质的基因表达的抗病毒剂包括例如：siRNA、吗啉代低聚物或miRNA。

(2-1)siRNA

siRNA的设计可适用上述(ii-2)的方法。

(3)活化具有与SR蛋白质相反功能的蛋白质或活化该蛋白质的抗病毒剂

(3-1)与SR蛋白质相反的功能是指例如在剪接中，促进选择内含子远位的3′剪接部位的功能。即，用与促进选择内含子近位的3′剪接部位的SR蛋白质相反的剪接调节因子，可抵消SR蛋白质的活性。具体而言，作为发挥与SR蛋白质相反功能的蛋白质，可列举hnRNP A1、A2以及B1等的核内不均一核糖核蛋白(hnRNP)，可优选列举hnRNP A1。更优选包含载有编码hnRNP A1的基因的基因治疗用表达载体的抗病毒剂。编码hnRNP A1的基因序列示于例如登录号NM_002136的105-1064、NM_031157的105-1220。另外，hnRNPA1的氨基酸序列示于登录号NP_002127、NP_112420等(Expert-Bezan，Sureau，A.等人，J.Biol.Chem.279，38249-38259(2004)；Zahler，A.M.等人，J.Biol.Chem.279，10077-10084(2004)；Marchand，V.etal.，J.Mol.Biol.323，629-652(2002)；Buvoli，M.等人，EMBO J.9，1229-1235(1990)；Biamonti，G.等人，J，Mol.Biol.207，491-503(1989)；Buvoli，M.等人，Nucleic Acids Res.16，3751-3770(1988)；Michael，W.M.等人，Cell 83，415-422(1995))。编码hnRNP A2/B1的基因序列示于例如登录号NM_002137的170-1192、NM_031243的170-1228。另外，hnRNPA2/B1的氨基酸序列示于登录号NP_002128、NP_112533等(Kozu，T.，等人，Genomics 25，365-371(1995)；Biamonti，G.等人，NucleicAcids Res.22，1996-2002(1994)；Burd，C.G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86，9788-9792(1989)；Kumar，A.等人，J.Biol.Chem.261，11266-11273(1986))。

(4)通过筛选抑制SRPK的物质来筛选抗病毒剂的方法。

本发明的抗病毒剂的筛选方法例如为包括筛选SRPK抑制剂的方法，筛选SRPK抑制剂包括使试验化合物作用于SRPK的步骤、以及检测SRPK的磷酸化SR蛋白质能力的步骤。降低该能力的化合物(SRPK抑制剂)可用作抗病毒剂。特别是，本发明中还包括抗病毒剂的筛选方法，该方法将以SRPK1和SRPK2为靶的各种化合物，SR蛋白质，或者2个或2个以上连续的RS或SR的肽作为SRPK的基质筛选SRPK抑制剂。利用2个或以上重复的Arg-Ser(RS)或Ser-Arg(SR)的肽作为SRPK的基质，通过选择使磷酸化该基质的能力降低的化合物(SRPK抑制剂)，可有效选择抑制SRPK的SR蛋白质磷酸化活性的化合物。

更具体地，本发明的筛选包括以下步骤：

(a)在被检化合物存在下，使SRPK与其基质接触的步骤，

(b)检测该基质的磷酸化的步骤

(c)选择与不存在被检化合物或被检化合物用量少的情况相比，磷酸化降低的化合物。

作为基质，可使用上述SR蛋白质、含有RS结构域的部分肽，或者2个或2个以上连续的RS或SR的肽(参照实施例)。作为SRPK，只要可维持野生型SRPK1或SRPK2、或磷酸化活性，也可以是加有标记肽的融合蛋白质或其它蛋白质。在本发明中，只要可维持对SR蛋白质的磷酸化活性，具有变异的SRPK等也称为SRPK。

更具体地，在本发明中，SRPK1包括(a)含有登录号NP-003128、AAA20530、CAC39299、CAA11833或NP_058075中所示的氨基酸序列的蛋白质、(b)与该氨基酸序列具有80％或以上、优选85％或以上、进一步优选90％、更优选95％以上的同源性的氨基酸序列的蛋白质，并且是具有磷酸化活性的蛋白质、(c)或与含有登录号NM-003137的124-2088、U09564的109-2073、AJ318054的10-2487、NM_016795的43-1986的一部分或全部的核酸的互补链在严格条件下杂交的核酸所编码的蛋白质，并具有磷酸化活性的蛋白质。另外，本发明中，SRPK2包括(a)含有登录号AAC05299或NP_033300中所述的氨基酸序列的蛋白质、(b)与该氨基酸序列具有80％或以上、优选85％或以上、进一步优选90％、更优选95％以上的同源性的氨基酸序列的蛋白质，并且是具有磷酸化活性的蛋白质、(c)或与含有登录号U88666的188-2245、NM_009274的208-2253的一部分或全部的核酸的互补链在严格条件下杂交的核酸所编码的蛋白质，并具有磷酸化活性的蛋白质。在此，一部分是指例如连续20个碱基或以上、优选25个碱基或以上、更优选30个碱基或以上、40个碱基或以上、45个碱基或以上、50个碱基或以上。

氨基酸序列的同源性可利用例如BLAST程序(Altschul，S.F.等人，1990，J.Mol.Biol.215：403-410)确定。例如，在NCBI(National Center forBiothchnology Information)的BLAST的网页中将Low complexity的滤过器全部设为OFF状态，用默认的参数进行检索(Altschul，S.F.等人(1993)Nature Genet.3：266-272；Madden，T.L.等人(1996)Meth.Enzymol.266：131-141；Altschul，S.F.等人(1997)NucleicAcids Res.25：3389-3402；Zhang，J.& Madden，T.L.(1997)GenomeRes.7：649-656)。参数的设定如下：open gap的值为11，extend gap的值为1，wordsize为2、Dropoff(X)for blast extension in bits为7、X Dropoff value for gapped alignment(in bits)为15、final X dropoffvalue for gapped alignment(in bits)为25。作为score的matrix使用BLOSUM62。例如进行2个序列的比对，可通过blast2 sequences程序(Tatiana A等人(1999)FEMS Microbiol Lett.174：247-250)做成2序列的排列，确定序列的同源性。GAP与错配同样处理，计算相对于上述登录号所示的野生型蛋白质的氨基酸序列整体(例如序列号：2或4的全长)的同源性值。可忽略排列中的野生型蛋白质的氨基酸序列外侧的gap计算同源性值。另外，在杂交中，制备含有野生型蛋白质的编码序列(例如序列编号：1或3)的核酸、或从杂交对象核酸的一部分制备探针，检测其是否与其它核酸杂交，由此进行鉴定。严格的杂交条件为例如在含有5xSSC(1×SSC含有150mM NaCl，15mM柠檬酸钠)、7％(W/V)SDS、10μg/ml变性鲑精子DNA、5xDenhardt试剂(1×Denhardt试剂含有0.2％聚乙烯吡咯烷酮、0.2％牛血清蛋白以及0.2％的Ficoll)的溶液中，在48℃下、优选50℃下、更优选52℃下进行杂交，然后，在与杂交相同的温度下、更优选60℃下、进一步优选65℃下、最优选在68℃下在2xSSC中、优选在1xSSC、更优选在0.5xSSC中、更优选在0.1xSSC中边振荡边洗涤2小时。

SRPK的磷酸化活性例如可用标记的ATP进行SRPK和基质的反应，通过定量标记的基质来检测。具体而言，可按照实施例4B的方法。

所得化合物进一步通过下述步骤检测抗病毒作用，再进一步筛选出抗病毒作用显著的化合物。

(d)在筛选的被检化合物的存在下，检测病毒增殖或病毒基因表达的步骤，

(e)选择与不存在该化合物或该化合物用量少的情况相比，使该病毒增殖或病毒基因表达降低的化合物的步骤。

病毒增殖或病毒基因的表达如实施例所示，可通过检测导入病毒基因的细胞的病毒蛋白质的产生等测定。

本发明涉及含有利用本发明的上述筛选方法选择的化合物的SRPK抑制剂和抗病毒剂。另外，本发明涉及利用本发明的上述筛选方法选择的化合物在制备SRPK抑制剂和/或抗病毒剂中的用途以及利用SRPK抑制和/或抗病毒进行治疗的用途。例如，选自CASRegistry Nos.218156-96-8、674360-18-0、494830-83-0、672919-05-0、54231-51-5、10338-55-3、1692-79-1、1496-40-81、496012-09-0、445406-05-3、445412-62-4以及388071-30-5的化合物作为SRPK抑制和/或抗病毒剂是有用的。

另外，本发明还包括将上述抗病毒剂用作病毒增殖抑制剂或抗病毒治疗药。例如，将SRPIN-1用作抗病毒剂时，可添加SRPIN-1以外的公知的制药辅料，例如，可添加AZT、或蛋白水解酶抑制剂。

本发明的病毒增殖抑制剂或抗病毒治疗药可间歇或持续地经口、经皮、粘膜下、皮下、肌肉内、血管内、脑内或腹腔内给药，使体内浓度达到100nM-1mM之间的任意值。

以下详细说明本发明的SRPIN-1类似物。本发明涉及具有下述结构的化合物及其用途。

本发明的化合物为下述通式(I)表示的苯胺衍生物、其可药用的盐或它们的水合物，

(式中，R¹表示氢原子、可以具有取代基的C_1-6烷基、可以具有取代基的C_2-6烯基、可以具有取代基的C_2-6炔基、可以具有取代基的C_6-10芳基、卤原子、硝基、氰基、叠氮基、羟基、可以具有取代基的C_1-6烷氧基、可以具有取代基的C_1-6烷硫基、可以具有取代基的C_1-6烷基磺酰基、羧基、甲酰基、可以具有取代基的C_1-6烷氧基羰基、酰基、酰基氨基、或氨磺酰基；

R²表示氢原子、可以具有取代基的C_1-6烷基或可以具有取代基的芳基；

R³表示可以具有取代基的C_1-6烷基、可以具有取代基的C_2-6烯基、可以具有取代基的C_6-10芳基、可以具有取代基的含氮杂环或可以具有取代基的稠合芳杂环；

R⁴表示氢原子或卤原子；

Q表示-C(O)-、-C(S)-、-SO₂-、-C(S)NHC(O)-、-C(O)NHC(O)-或-C(O)NHC(S)-；

W表示氢原子、可以具有取代基的C_1-6烷基、可以具有取代基的C_6-10芳基、卤原子、羟基、可以具有取代基的C_1-6烷氧基、可以具有取代基的C_1-6烷硫基、可以具有取代基的含氮杂环或可以具有取代基的稠合芳杂环、或下述通式(II)

(式中，R⁵和R⁶相同或不同，表示氢原子、可以具有取代基的C_1-6烷基、可以具有取代基的含氮杂环、可以具有取代基的稠合芳杂环、酰基或酰基氨基；而且

上述R⁵和R⁶可以与相邻的氮原子连接，形成可以具有取代基的杂环，该杂环可以是可以具有取代基的稠合芳杂环；

上述R⁵和R⁶也可以是可以具有取代基的环亚烷基氨基或可以具有取代基的芳环稠合环亚烷基)，

在这些通式(I)表示的化合物中，作为优选的化合物，可列举例如以下化合物：

(1)上述R¹为氢原子、可以具有取代基的C_1-6烷基或卤原子的化合物，

(2)上述R¹为氢原子、C_1-6烷基、卤代C_1-6烷基或卤原子的化合物，

(3)上述R¹为氢原子、甲基、三氟甲基、氯原子或氟原子的化合物，

(4)上述R¹为氢原子或三氟甲基的化合物，

(5)上述R²为氢原子或C_1-6烷基的化合物，

(6)上述R²为氢原子或甲基的化合物，

(7)上述R²为氢原子的化合物，

(8)上述R³为可以具有取代基的C_6-10芳基、可以具有取代基的5～10元含氮杂芳环的化合物，

(9)上述R³为苯基；具有C_1-6烷基、C_1-6烷氧基或硝基作为取代基的C_6-10芳基；或5～10元含氮杂芳基的化合物，

(10)上述R³为苯基；具有C_1-6烷基、C_1-6烷氧基或硝基作为取代基的C_6-10苯基；或吡啶基的化合物，

(11)上述R³为苯基、甲苯基、甲氧基苯基或硝基苯基或吡啶基的化合物，

(12)上述R³为甲苯基或吡啶基的化合物。

(13)上述R³为4-吡啶基的化合物

(14)上述R⁴为氢原子的化合物，

(15)上述Q为-C(O)-或-C(O)NHC(S)-的化合物。在此，C(O)表示氧原子通过双键与碳原子键合，C(S)表示硫原子通过双键与碳原子键合。

(16)上述Q为-C(O)-化合物。

(17)上述W为氢原子、卤原子或下述通式(II)表示结构的化合物，

(式中，R⁵和R⁶相同或不同，表示可以具有取代基的C_1-6烷基；而且

上述R⁵和R⁶可以与相邻的氮原子连接，形成可以具有取代基的杂环基，该杂环基可以是可以具有取代基的稠合芳杂环基)。

(18)上述W为可以具有C_1-6烷基作为取代基的含有1个氮原子的4～8元杂环基、可以具有C_1-6烷基作为取代基的含有1个氮原子和1个氧原子的4～8元杂环基、稠和了苯基的含有1个氮原子的4～8元杂环基的化合物。

(19)上述W为可以具有C_1-6烷基作为取代基的含有1个氮原子的4～8元杂环基的化合物。

(20)上述W为可以具有C_1-6烷基作为取代基的哌啶基或全氢氮杂(perhydroazopine)的化合物。

(21)上述W为氢原子、卤原子、二乙基氨基、吡咯烷基、哌啶基、2-甲基哌啶基、全氢氮杂、吲哚基、异吲哚基或1，2，3，4-四氢喹啉基的化合物。

其中，关于R¹，(1)-(4)中，更优选(4)。关于R²，(5)-(7)中，更优选(7)。关于R³，(8)-(13)中，更优选(13)。关于Q，(15)-(16)中，更优选(16)。关于W，(17)-(20)中，更优选(20)。另外还优选(21)。

关于上述通式(I)表示的化合物，更优选选择(1)-(4)、(5)-(7)、(8)-(13)、(14)、(15)-(16)、(17)-(21)的各个取代基中优选的方式，并将它们任意组合而成的化合物。

以下，作为通式(I)表示的具体化合物，列举如下，但本发明并不限于以下列举的化合物。

[表1]

[表2]

[表3]

本发明涉及以上列举的任意化合物，但这些列举的化合物中，优选列举上述列举的化合物编号为340、341、342、343、344、345、346、347、348、608、613、615、616、618、619、620、621、622、623、624、625、626的化合物，更优选列举340、341、342、343、345、347、348、608、613、615、616、618、619、620、622、623、624、625、626的化合物，进一步优选上述列举的化合物编号为340、348、613、616、618、622、624的化合物、更优选列举化合物编号为340、348、613、618、624的化合物。

本发明涉及以上列举的任意化合物。特别是，本发明涉及选自列举的化合物编号为341、342、346、347、348、349、612、613、614、616、617、618、619、620、621、622和624的新化合物。

这些化合物(苯胺衍生物)、其可药用的盐或它们的水合物作为SRPK抑制剂是有效的。

另外，这些化合物(苯胺衍生物)、其可药用的盐或它们的水合物作为抗病毒剂是有效的。

本发明的上式(I)表示的化合物代表性的制备方法如下：

以下，R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、Q和W定义同上。室温是指20～30℃左右的温度。

制备方法A

步骤1

是化合物1a和化合物2a反应生成化合物3a的步骤。原料硝基苯衍生物1a可购买市售品或导入适当官能团得到。X为作为离去基团的卤原子或磺酸酯。化合物2a为含有引入的NR⁵R⁶的试剂。化合物2a优选使用1-2当量。反应可在碱存在下在溶剂中进行。

作为碱，可使用三乙胺、二异丙基乙胺、吡啶、4-(二甲基氨基)吡啶等。优选使用1～5当量碱。另外，可使用过量的(1～5当量)H-NR⁵R⁶作为碱。

作为溶剂，可列举例如二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二噁烷、四氢呋喃、甲苯等。

反应可在反应温度为0℃～150℃下进行，可优选在室温下进行。

步骤2

是将化合物3a的硝基还原为氨基，得到化合物4a的步骤。

作为还原方法，可以在溶剂中，在氯化锡等存在下，与浓盐酸等接触进行。另外，也可以利用接触氢化等一般的还原反应。

作为反应溶剂，可以用甲醇、乙醇、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、1，2-二甲氧基乙烷、1，4-二噁烷、水或者它们的混合溶剂。

优选使用以质量比计为1～20当量的量的还原剂氯化锡。反应温度可在0℃～100℃进行。

如果可以得到化合物3a和4a的市售品，使用市售品也可。特别是通式(I)的W为氢或者卤原子时，基本上都可以得到市售品。例如，本说明书的化合物编号为608、612、623～626等就属于此。

步骤3a

是化合物4a和化合物5a反应得到化和物6a的步骤。L为卤原子等。

反应可在溶剂中，在碱存在下，根据需要添加催化剂进行。此时，优选使用1～3当量的化合物5a。

反应溶剂可以使用二氯甲烷、氯坊、1，4-二噁烷、四氢呋喃、甲苯、吡啶、N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮等。

作为碱，可以使用三乙基胺、二异丙基乙胺、吡啶、4-(二甲氨基)吡啶等。

另外，可以利用L为羟基时的使用缩合剂的一般的叠氮键形成反应等；也可以利用L为琥珀酰亚胺基或咪唑基等离去基团时的一般的叠氮键形成反应。

作为催化剂可列举4-(二甲氨基)吡啶等。

反应可在反应温度为0℃～100℃进行。

步骤3b

是化合物4a和化合物5b反应得到化和物6b的步骤。

反应可在溶剂中，在碱存在下使酰基异硫氰酸盐作用而进行。酰基异硫氰酸盐可以使用市售品或者直接使用将合适的酰卤和硫氰酸盐在反应溶液中制备得到的物质。优选使用1～5当量酰基异硫氰酸盐。作为硫氰酸盐，可以使用硫氰酸钾、硫氰酸钠、硫氰酸铵等，优选使用1～5当量。

作为溶剂，可列举例如乙腈、N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、四氢呋喃、乙二醇二甲醚、1，4-二噁烷等。

作为碱，可以使用例如三乙基胺、二异丙基乙胺、吡啶、4-(二甲氨基)吡啶等。优选使用1～5当量碱。

反应可在反应温度为0℃～150℃进行。

工程4a

是将化合物6a的叠氮基部分烷基化(R²)得到化合物7a的步骤。

反应可在溶剂中、在碱存在下使用烷基化试剂(R²-X)进行。X为作为离去基团的卤原子或者磺酸酯。烷基化试剂(R²-X)优选使用1～5当量。

作为溶剂，可列举例如N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、四氢呋喃、乙二醇二甲醚、1，4-二噁烷、乙腈、醚等。

作为碱，可使用氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、丁基锂、甲基锂、苯基锂、二异丙基氨基锂等。碱优选使用1～5当量。

反应可在反应温度为0℃～150℃下进行。

工程4b

是将化合物6a的酰胺键的羰基变成硫羰基得到化合物7b的步骤。

反应在溶剂中使用硫羰化试剂进行。

作为硫羰化试剂，可以使用例如Lawesson’s试剂(2，4-双(4-甲氧基苯基)-1，3，2，4-二硫杂二磷杂环丁烷(diphosphetane)2，4-二硫化物)、五硫化二磷(十硫化四磷、P₄S₁₀)等。优选使用1～5当量硫羰化试剂。

溶剂可列举例如甲苯、苯、氯苯、二甲苯、N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、乙二醇二甲醚、1，4-二噁烷、四氢呋喃等。

反应可在反应温度为0℃～200℃下进行。

以上为本发明的化合物(I)的制备方法的代表例，本发明化合物的制备中的原料化合物、各种试剂也可以形成盐、水合物或溶剂和物，均因起始原料、使用的溶剂等而不同，只要不妨碍反应，没有特别限制。所使用的溶剂也因起始原料、试剂等而不同，而且只要不妨碍反应，某种程度溶解起始物质则没有特别限制。本发明的化合物(I)作为游离体得到时，可按照常法转变为上述的化合物(I)可以形成的盐、或者它们的水合物的状态。

本发明的化合物(I)作为化合物(I)的盐或者化合物(I)的水合物得到时，可按照常法转变为上述化合物(I)的游离体。

另外，对于得到的本发明化合物(I)的各种异构体(例如几何异构体、以手性碳为基础的光学异构体、旋转异构体、立体异构体、互变异构体等)可通过通常的分离方法，例如重结晶、成非对映异构体盐法、酶分离法、各种色谱法(例如薄层色谱、柱色谱、气相色谱等)进行纯化、分离。

在本发明中，SRPIN-1类似物可用于抑制SRPK的活性。即，通过施用本说明书所述的SRPIN-1类似物，可抑制SRPK1和/或SRPK2的磷酸化活性。本发明涉及SRPIN-1类似物在SRPK活性抑制中的用途。另外，本发明涉及含有SRPIN-1类似物的SRPK抑制剂。另外，本发明涉及SRPIN-1类似物在SRPK抑制剂制备中的用途。另外，本发明涉及包括使SRPIN-1类似物与SRPK接触步骤的抑制SRPK活性的方法。在此，与SRPK接触可以是在体内或体外向表达SRPK的细胞、组织和/或个体施用SRPIN-1类似物。

另外，在本发明中，SRPIN-1类似物可用于抑制病毒的增殖。即，通过施用本说明书所述的SRPIN-1类似物，抑制SRPK1和/或SRPK2的磷酸化活性，从而抑制病毒增殖。本发明涉及SRPIN-1类似物在病毒增殖抑制中的用途。另外，本发明涉及含有SRPIN-1类似物的抗病毒剂。另外，本发明涉及SRPIN-1类似物在制备抗病毒剂中的用途。进一步本发明涉及包括使SRPIN-1类似物与SRPK接触的步骤的抑制病毒增殖的方法。在此，与SRPK接触可以是在体内或体外向表达SRPK的细胞、组织和/或个体施用SRPIN-1类似物。

另外，本发明提供一种药盒(package)，其是含有上述SRPIN-1类似物、其可药用盐、或者它们的水合物的药盒，该化合物具有SRPK抑制活性和/或抗病毒作用记载在该药盒或该药盒的内容物中。在此，药盒是指含有该SRPIN-1类似物、其可药用盐、或者它们的水合物的包装物，可以含有用于装入该SRPIN-1类似物、其可药用盐、或者它们的水合物的容器，还可以包括收容该容器的袋子或外箱等。

另外，本发明提供一种药盒，其是含有使SR蛋白质活性或表达量降低的化合物的药盒，该化合物具有抗病毒作用记载在该药盒或该药盒的内容物中。特别是本发明提供一种药盒，该化合物为具有抑制SRPK表达和/或活性的活性的化合物。

本发明的化合物可与可药用的载体一起制成组合物。例如，可采用公知的制剂技术，做成医药组合物。将本发明的医药组合物用作SRPK抑制剂、或抗病毒剂(即病毒疾病的预防剂或治疗剂)或其他医药时，其给药形态可以列举通过例如片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、丸剂、锭剂或糖浆剂等经口给药；或通过注射剂、气雾剂、栓剂、贴剂、糊剂、溶液剂、擦剂、软膏剂或滴眼剂等非经口给药。这些制剂可用赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、稳定剂、矫味矫臭剂、稀释剂等添加剂通过公知的方法制备。

作为赋形剂，可列举例如淀粉、马铃薯淀粉、玉米淀粉等淀粉、乳糖、结晶纤维素、磷酸氢钙等。

作为包衣剂，可列举例如乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素、虫胶、滑石、巴西棕榈蜡、石蜡等。

作为粘合剂，可列举例如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和与上述赋形剂相同的化合物。

作为崩解剂，可列举例如与上述赋形剂相同的化合物和交联羧甲基纤维素钠(Croscarmellose Sodium)、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮等经化学修饰的淀粉·纤维素类。

作为稳定剂，可列举例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯等对羟基苯甲酸酯类；氯丁醇、苄基醇、苯乙醇等醇类；苯扎氯铵、苯酚、甲酚等酚类；硫柳汞、脱氢乙酸；以及山梨酸等

作为矫味矫臭剂，可列举例如通常使用的甜味剂、酸味剂、芳香剂等。

另外，作为制备液体制剂的溶剂，可列举乙醇、苯酚、氯甲酚、纯化水、蒸馏水等。

作为表面活性剂或乳化剂，可列举例如聚山梨酯80、硬脂酸聚烃氧酯40、聚月桂乙二醇等。

本发明的医药组合物用作SRPK抑制剂或抗病毒剂时，本发明的化合物或其可药用盐的用量因症状、年龄、给药方法等而有所不同。例如，口服时，优选根据症状对患者(恒温动物、特别是人)每天一次或者分数次给药，下限为(0.01)mg(优选为(0.1)mg)，上限为(2000)mg(优选为(500)mg，更优选为(100)mg)。静脉给药时，成人每天一次或者分数次，下限为(0.001)mg(优选为(0.01)mg)，上限为(500)mg(优选为(50)mg)。

实施例

以下，根据实施例更详细地说明本发明，他们仅作为示例，本发明并不限于这些实施例。要说明的是，本说明书中引用的文献均作为本说明书的一部分。

以下，柱色谱使用硅胶(MERCK 9385-5B，70-230目)进行。薄层色谱(TLC)使用预先涂布了硅胶的玻璃板(MERCK5715，silicalgel 60 F₂₅₄)进行。熔点使用Yanaco公司生产的微熔点测定装置YANACO MP-500D测定。¹H-NMR谱用日本电子(JEOL)公司生产的JNM AL-400核磁共振装置测定。NMR谱测定用溶剂使用CDCl₃或CD₃OD(ISOTEC公司产)。化学位移以四甲基硅烷((CH₃)₄Si)为内标(0ppm)的相对值表示，偶合常数(J)以Hz表示。符号s、d、t、m以及br分别表示单峰、双峰、三重峰、四重峰、多重峰以及宽峰。

[参考例1]SRPIN-1的合成

SRPIN-1(编号GIF-0340)的代表的合成方法如下。

[参考例1-1A]

在室温下向1-氟-2-硝基-4-(三氟甲基)苯(1-fluoro-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene)(427mg，2.04mmol，商品名)的N，N-二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide(DMF))(1mL)溶液中依次添加哌啶(piperidine)(220μL，2.22mnol)和N，N-二异丙基乙胺(N，N-diisopropylethylamine)(220μL，2.40mmol)。将混合物搅拌1小时。向其中添加水，用乙醚(×3)萃取混合物。用盐水洗涤萃取得到的有机层，在Na₂SO₄上干燥，过滤，在减压下浓缩。

残渣用硅胶柱色谱(40g，己烷/乙酸乙酯-10/1)纯化，得到1-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]哌啶(1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl)piperidine(561mg，2.04mmol，quant.)的橙色固体.

TLC和¹H NMR(CDCl₃，400MHz)的结果如下：TLCR_f0.47(己烷/丙酮＝16/1)；¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ1.61-1.68(m，2H，CH₂)，1.72(tt，4H，J＝5.3，5.3Hz，2CH₂)，3.13(t，4H，J＝5.3Hz，2CH₂)，7.13(d，1H，J＝8.8Hz，芳香性)7.61(dd，1H，J＝2.0，8.8Hz，芳香性)，8.03(d，1H，J＝2.0Hz，芳香性).

[参考例1-2A]

在0℃下向参考例1-1A得到的1-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]哌啶(1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl)piperidine(559mg，2.03mmol)的甲醇(10mL)溶液中依次添加浓盐酸(2.00mL，24.0mmol)和无水二氯化锡(2.50g，13.1mmol)。将混合物恢复至室温，搅拌17.5小时。向其中添加碳酸氢钠的饱和水溶液。用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用盐水洗涤得到的有机层，在Na₂SO₄上干燥，过滤，减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(50g，己烷/乙酸乙酯＝14/1)纯化，得到2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯胺(2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline(448mg，1.83mmol，90.4％)的淡黄色固体。

TLC和¹H NMR(CDCl₃，400MHz)的结果如下：TLC R_f0.30(己烷/丙酮＝18/1)；¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ1.59-1.60(m，2H，CH₂)，1.71(tt，4H，J＝5.4，5.4Hz，2CH₂)，2.85(brs，4H，2CH₂)，4.09(brs，2H，NH₂)，6.92(d，1H，J＝1.9Hz，芳香性)，6.97(dd，1H，J＝1.9，8.4Hz，芳香性)，7.01(d，1H，J＝8.4Hz，芳香性).

[参考例1-3A]

在0℃下向参考例1-2A得到的2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯胺(2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline(173mg，0.708mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(5mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloride hydrochloride)(151mg，0.850mmol，商品名)、三乙基胺(triethylamine)(450μL，3.23mmol)和催化量的4-(二甲基氨基)吡啶(4-(dimethylamino)pyridine)。将混合物恢复至室温，搅拌19.5小时。向其中添加水，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用碳酸氢钠饱和水溶液洗涤得到的有机层，在Na₂SO₄上干燥，过滤，然后减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(10g，己烷/乙酸乙酯＝1.5/1)和重结晶(己烷)纯化，得到N-[2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(SRPIN-1，编号GIF-0340)(83.3mg，0.240mmol，33.9％)的无色固体。

熔点、TLC和¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)的结果如下。

熔点96-98℃；TLC R_f 0.40(己烷/乙酸乙酯＝1/1)；¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ1.67-1.68(m，2H，CH₂)，1.78(tt，4H，J＝5.5，5.5Hz，2CH₂)，2.88(t，4H，J＝5.5Hz，2CH₂)，7.29(d，1H，J＝8.2Hz，芳香性)，7.40(dd，1H，J＝1.8，8.2Hz，芳香性)，7.76(dd，2H，J＝2.0，4.4Hz，芳香性)，8.86(dd，2H，J＝2.0，4.4Hz，芳香性)，8.87(d，1H，J＝1.8Hz，芳香性)，9.53(s，1H，NH).

[参考例1-1B]

在0℃下向1-氯-2-硝基-4-(三氟甲基)苯(1-chloro-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene)(5.00g，22.4mmol，商品名)的N，N-二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide(DMF))(7mL)溶液中添加哌啶(piperidine)(5.50mL，55.5mmol，商品名)，将混合物搅拌40分钟。向其中添加水后，用乙酸乙酯萃取混合物(×3)。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压下浓缩。残渣用硅胶柱色谱(200g，己烷/乙酸乙酯＝8/1)纯化，得到1-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]哌啶(1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl)piperidine(6.13g，quant.)的橙色固体。

[参考例1-2B]

在0℃下向参考例1-1B得到的1-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]哌啶(1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl)piperidine(6.13g，22.4mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(10mL)溶液中依次添加浓盐酸(12.2mL，146mmol)和无水二氯化锡(12.7g，67.2mmol)，将混合物搅拌7小时。向其中加水，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。将得到的有机层用饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(200g，己烷/乙酸乙酯＝15/1)纯化，得到2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯胺(2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline(4.55g，83.0％)的淡黄色固体。

[参考例1-3B]

在0℃下向参考例1-2B得到的2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯胺(2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline(4.45g，18.2mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(10mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloride hydrochloride)(6.48g，36.4mmol，商品名)和三乙基胺(triethylamine)(5.57mL，54.6mol)。将混合物搅拌0.5小时。向其中加水，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水溶液洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(200g，己烷/乙酸乙酯＝1/1)和重结晶(己烷)纯化，得到N-[2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluorom ethyl)phenyl]isonicotinamide)(SRPIN-1，编号GIF-0340)(5.49g，86.3％)的无色固体。

[参考例2]编号GIF-0613的合成

[参考例2-1]

在室温下向1-氟-2-硝基-4-(三氟甲基)苯(1-fluoro-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene)(211mg，1.00mmol，商品名)的N，N-二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide(DMF))(0.5mL)溶液中依次添加(S)-2-甲基哌啶((S)-2-methylpiperidine)(270μL，2.24mmol，商品名)，将混合物搅拌2小时。向其中加水后，用乙酸乙酯萃取混合物(×3)。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(20g，己烷/乙酸乙酯＝12/1)纯化，得到(S)-1-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]-2-甲基哌啶((S)-1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl)-2-methylpiperidine(286mg，99.2％)的橙色油状物质。

TLC R_f 0.44(己烷/乙酸乙酯＝16/1)。

[参考例2-2]

在0℃下向[参考例2-1]得到的(S)-1-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]-2-甲基哌啶((S)-1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl)-2-methylpiperidine(275mg，0.953mmol)的甲醇(5mL)溶液中依次添加浓盐酸(1.00mL，12.0mmol)和无水二氯化锡(903mg，4.76mmol)。将混合物恢复至室温，搅拌17小时。向其中添加饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层后，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(50g，己烷/乙酸乙酯＝12/1)纯化，得到(S)-2-(2-甲基-1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯胺(S)-(2-(2-methyl-1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline(233mg，94.6％)的无色油状物质。

TLC R_f 0.38(己烷/乙酸乙酯＝16/1)。

[参考例2-3]

在0℃下向[参考例2-2]得到的(S)-2-(2-甲基-1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯胺((S)-(2-(2-methyl-1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline(233mg，0.863mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(5mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloride hydrochloride)(466mg，2.61mmol，商品名)和三乙基胺(triethylamine)(600μL，4.30mmol)。将混合物恢复至室温，搅拌19.5小时。向其中加水，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水溶液洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(25g，己烷/乙酸乙酯＝1.5/1)纯化，得到(S)-N-[2-(2-甲基-1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺((S)-N-[2-(2-methyl-1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(编号GIF-0613)(293mg，93.4％)的无色油状物质。

TLC和¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)的结果如下。

TLC R_f0.40(己烷/乙酸乙酯＝1/1)；¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ0.84(d，3H，J＝6.4Hz，CH₃)，1.39-1.69(m，3H，CH₂，CH)，1.82-1.86(m，1H，CH)，1.92-1.95(m，2H，CH₃)，2.65-2.72(m，1H，CH)，2.89-2.92(m，1H，CH)，2.98-3.02(m，1H，CH)，7.35(d，1H，J＝8.4Hz，芳香性)，7.40(dd，1H，J＝2.2，8.4Hz，芳香性)，7.75(dd，2H，J＝1.8，4.4Hz，芳香性)，8.86(dd，2H，J＝1.8，4.4Hz，芳香性)，8.93(d，1H，J＝1.8Hz，芳香性)，10.1(s，1H，NH)。

[参考例3]编号GIF-0617的合成。

[参考例3-1]

在0℃下向1-氟-2-硝基-4-(三氟甲基)苯(1-fluoro-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene)(1.02g，4.89mmol，商品名)的N，N-二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide(DMF))(4mL)溶液中添加吡咯烷(pyrrolidine)(983μL，12.0mmol，商品名)。将混合物恢复至室温，搅拌4.5小时。向其中加水后，用乙酸乙酯萃取混合物(×3)。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(50g，己烷/乙酸乙酯＝5/1)纯化，得到1-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]吡咯烷(1-[2-nitro-4-(triffuoromethyl)phenyl)pyrrolidine(1.26g，99.3％)的橙色固体。

TLC R_f 0.45(己烷/乙酸乙酯＝5/1)。

[参考例3-2]

在0℃下向参考例3-1得到的1-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]吡咯烷(1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl)pyrrolidine(606mg，2.33mmol)的甲醇(4mL)溶液中依次添加浓盐酸(1.36mL，16.3mmol)和无水二氯化锡(1.55g，8.16mmol)，将混合物搅拌4小时。向其中添加饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(50g，己烷/乙酸乙酯＝15/1)纯化，得到1-[2-氨基-4-(三氟甲基)苯基]吡咯烷(1-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]pyrrolidine)(550mg，quant.)的橙红色油状物质。

TLC R_f 0.63(己烷/乙酸乙酯＝1/1)。

[参考例3-3]

在0℃下向参考例3-2得到的1-[2-氨基-4-(三氟甲基)苯基]吡咯烷(1-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]pyrrolidine)(516mg，2.24mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(10mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloride hydrochloride)(705mg，3.96mmol，商品名)和三乙基胺(triethylamine)(823μL，5.94mmol)。将混合物恢复至室温，搅拌5小时。向其中加水，用二氯甲烷(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(25g，己烷/乙酸乙酯＝1/2)纯化，得到N-[2-(1-吡咯烷基)-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-[2-(1-pyrrolidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF-0617)(734mg，97.8％)的无色固体。

熔点、TLC和¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)的结果如下。

熔点134-135℃；TLC R_f 0.29(己烷/乙酸乙酯＝1/1)；¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ2.01(tt，4H，J＝3.2Hz，6.4Hz，2CH₃)，3.15(t，4H，J＝6.4Hz，2CH₂)，7.19(d，1H，J＝8.5Hz，芳香性)，7.38(dd，1H，J＝2.2，8.5Hz，芳香性)，7.71(dd，2H，J＝1.6，4.4Hz，芳香性)，8.53(d，1H，J＝2.2，Hz，芳香性)，8.79(s，1H，NH)，8.83(dd，2H，J＝1.6，4.4Hz，芳香性)。

[参考例4]编号GIF-0618的合成

[参考例4-1]

在0℃下向1-氟-2-硝基-4-(三氟甲基)苯(1-fluoro-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene)(506mg，2.42mmol，商品名)的N，N-二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide(DMF))(2mL)溶液中依次添加六氢-1H-氮杂(hexahydro-1H-azepine)(682μL，6.05mmol，商品名)。将混合物恢复至室温，搅拌1小时。向其中加水后，用乙酸乙酯萃取混合物(×3)。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(20g，己烷/乙酸乙酯＝7/1)纯化，得到六氢-1-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]-1H-氮杂(hexahydro-1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]-1H-azepine)(680mg，97.5％)的橙色固体.

TLC和¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)的结果如下。

TLC R_f 0.49(己烷/乙酸乙酯＝5/1)；¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ1.57-1.63(m，4H，2CH₂)，1.79-1.83(m，4H，2CH₂)，3.31(t，4H，J＝5.5Hz，2CH₂)，7.11(d，1H，J＝9.1Hz，芳香性)7.53(dd，1H，J＝2.0，9.1Hz，芳香性)，7.99(d，1H，J＝2.0Hz，芳香性)。

[参考例4-2]

在0℃下向参考例4-1得到的六氢-1-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]-1H-氮杂(hexahydro-1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]-1H-azepine)(675mg，2.34mmol)的甲醇(5mL)溶液中依次添加浓盐酸(1.27mL，15.2mmol)和无水二氯化锡(1.43g，7.54mmol)，将混合物搅拌2小时。向其中添加饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(30g，己烷/乙酸乙酯＝20/1)纯化，得到1-[2-氨基-4-(三氟甲基)苯基]-六氢-1H-氮杂(1-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]-hexahydro-1H-azepine(522mg，86.3％)的无色固体。

TLC和¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)的结果如下。

TLC R_f 0.81(己烷/乙酸乙酯＝3/1)；¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ1.70-1.84(m，8H，4CH₂)，3.04(t，4H，J＝5.4，Hz，2CH₂)，4.10(brs，2H，NH₂)，6.92(d，1H，J＝1.2Hz，芳香性)，6.94(dd，1H，J＝1.2，7.9Hz，芳香性)，7.05(d，1H，J＝7.9Hz，芳香性)。

[参考例4-3]

在0℃下向参考例4-2得到的1-[2-氨基-4-(三氟甲基)苯基]-六氢-1H-氮杂(1-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]-hexahydro-1H-azepine(512mg，1.98mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(6mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloride hydrochloride)(704mg，3.95mmol，商品名)和三乙基胺(triethylamine)(823μL，5.94mol)，将混合物搅拌1.5小时。向其中加水，用二氯甲烷(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(30g，己烷/乙酸乙酯＝2/1)纯化，得到N-[2-(1-六氢-1H-氮杂基)-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-[2-(1-hexahydro-1H-azepinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF-0618)(697mg，97.0％)的无色固体。

熔点、TLC和¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)的结果如下。

熔点138-139℃；TLC R_f 0.40(己烷/乙酸乙酯＝1/1)；¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ1.79(br，8H，4CH₂)，3.06-3.10(m，4H，2CH₂)，7.31(d，1H，J＝8.2Hz，芳香性)，7.37(dd，1H，J＝1.6，8.2Hz，芳香性)，7.76(dd，2H，J＝2.0，6.0Hz，芳香性)，8.85(m，3H，芳香性)，9.66(s，1H，NH)。

[参考例5]编号GIF-0346的合成

[参考例5-1]

在室温下向1-氟-2-硝基-4-(三氟甲基)苯(1-fluoro-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene)(209mg，1.00mmol，商品名)的N，N-二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide(DMF))(0.5mL)溶液中依次添加吗啉(morpholine)(190μL，2.17mmol，商品名)，将混合物搅拌3小时。向其中加水后，用乙酸乙酯萃取混合物(×3)。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(20g，己烷/乙酸乙酯＝3/1)纯化，得到4-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]吗啉(4-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]morpholine)(270mg，97.7％)的橙色油状物质。

TLC R_f 0.27(己烷/乙酸乙酯＝3/1)。

[参考例5-2]

在0℃下向参考例5-1得到的4-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]吗啉(4-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]morpholine)(263mg，0.952mmol)的甲醇(5mL)溶液中依次添加浓盐酸(1.00mL，12.0mmol)和无水二氯化锡(905mg，4.77mmol)。将混合物恢复至室温，搅拌20小时。向其中添加饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(20g，己烷/乙酸乙酯＝2/1)纯化，得到4-[2-氨基-4-(三氟甲基)苯基]吗啉(1-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]morpholine(214mg，91.2％)的无色固体。

TLC R_f 0.31(己烷/乙酸乙酯＝3/1)。

[参考例5-3]

在0℃下向参考例5-2得到的4-[2-氨基-4-(三氟甲基)苯基]吗啉(1-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]morpholine(196mg，0.796mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(5mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloride hydrochloride)(320mg，1.80mmol，商品名)和三乙基胺(triethylamine)(480μL，3.44mol)。将混合物恢复至室温，搅拌60小时。向其中加水，用二氯甲烷(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(30g，己烷/乙酸乙酯＝2/1)纯化，得到N-[2-(4-吗啉基)-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-[2-(4-morpholinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF-0346)(65.1mg，23.2％)的无色固体。

熔点、TLC和¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)的结果如下。

熔点172-173℃；TLC R_f 0.23(己烷/乙酸乙酯＝1/3)；¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ2.96(t，4H，J＝4.4Hz，2CH₂)，3.92(t，4H，J＝4.4Hz，2CH₂)，7.34(d，1H，J＝8.4Hz，芳香性)，7.44(dd，1H，J＝1.6，8.4Hz，芳香性)，7.75(dd，1H，J＝1.6，4.4Hz，芳香性)，8.87-8.88(m，3H，芳香性)9.48(s，1H，NH)。

[参考例6]编号GIF-0347的合成

[参考例6-1]

在室温下向1-氟-2-硝基-4-(三氟甲基)苯(1-fluoro-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene)(211mg，1.01mmol，商品名)的N，N-二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide(DMF))(0.5mL)溶液中添加二乙胺(diethylamine)(230μL，2.22mmol，商品名)，将混合物搅拌3小时。向其中加水后，用乙酸乙酯萃取混合物(×3)。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(20g，己烷/乙酸乙酯＝8/1)纯化，得到1-二乙基氨基-2-硝基-4-(三氟甲基)苯基(1-diethylamino-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene)(258mg，98.3％)的橙色油状物质。

TLC R_f 0.37(己烷/乙酸乙酯/乙醚＝16/1/1)。

[参考例6-2]

在0℃下向参考例6-1得到的1-二乙基氨基-2-硝基-4-(三氟甲基)苯(1-diethylamino-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene)(251mg，0.957mmol)的甲醇(5mL)溶液中依次添加浓盐酸(1.00mL，12.0mmol)和无水二氯化锡(908mg，4.78mmol)。将混合物恢复至室温，搅拌22小时。向其中添加饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(20g，己烷/乙酸乙酯＝20/1～10/1)纯化，得到2-氨基-1-二乙氨基-4-(三氟甲基)苯(2-amino-1-diethylamino-4-(trifluoromethyl)benzene)(144mg，64.7％)的无色油状物质。

TLC R_f 0.22(己烷/乙酸乙酯＝30/1)。

[参考例6-3]

在0℃下向参考例6-2得到的2-氨基-1-二乙氨基-4-(三氟甲基)苯(2-amino-1-diethylamino-4-(trifluoromethyl)benzene)(103mg，0.443mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(3mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloride hydrochloride)(88.2mg，0.495mmol，商品名)和三乙基胺(triethylamine)(140μL，1.00mol)。将混合物恢复至室温，搅拌1.5小时。向其中加水，用二氯甲烷(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(30g，己烷/乙酸乙酯＝2/1)纯化，得到N-[2-二乙基氨基-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-[2-diethylamino-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF-0347)(51.0mg，34.1％)的无色固体。

熔点、TLC和¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)的结果如下。

熔点78-80℃；TLC R_f 0.31(己烷/乙酸乙酯＝1/1)；¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ1.01(t，6H，J＝7.1Hz，2CH₃)，3.04(q，4H，J＝7.1Hz，2CH₂)，7.33(d，1H，J＝8.2Hz，芳香性)，7.41(dd，1H，J＝1.8，8.2Hz，芳香性)，7.73(dd，2H，J＝1.8，4.4Hz，芳香性)，8.60(d，1H，J＝2.6Hz，芳香性)，8.85(dd，2H，J＝1.8，4.4Hz，芳香性)，8.91(d，1H，J＝1.8Hz，芳香性)9.90(s，1H，NH)。

[参考例7]编号GIF-0343的合成

在0℃下向参考例1-2得到的2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯胺(2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline(152mg，0.662mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(5mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloride hydrochloride)(122mg，0.685mmol，商品名)和三乙基胺(triethylamine)(250μL，1.79mol)。将混合物恢复至室温，搅拌16.5小时。向其中加水，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(15g，己烷/乙酸乙酯＝1.5/1)纯化，得到N-[2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF-0343)(98.4mg，45.3％)的无色固体。

熔点、TLC和¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)的结果如下。

熔点145-146℃；TLC R_f 0.40(己烷/乙酸乙酯＝1/1)；¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ1.62-1.69(m，2H，CH₂)，1.79(tt，4H，J＝5.8，5.8Hz，2CH₂)，2.88(t，4H，J＝5.8Hz，2CH₂)，7.29(d，1H，J＝8.4Hz，芳香性)，7.39(dd，1H，J＝2.0，8.4Hz，芳香性)，7.51(dd，1H，J＝4.8，8.0Hz，芳香性)，8.30(ddd，1H，J＝1.6，2.4，8.0Hz，芳香性)，8.82(dd，1H，J＝1.6，4.8Hz，芳香性)，8.87(d，1H，J＝2.0Hz，芳香性)，9.16(d，1H，J＝2.4Hz，芳香性)，9.53(s，1H，NH)。

[参考例8]编号GIF-0344的合成

在0℃下向参考例1-2得到的2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯胺(2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline(102mg，0.417mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(3mL)溶液中依次添加苯甲酰氯(benzoylchloride)(50.0μL，0.430mmol，商品名)和三乙基胺(triethylamine)(170μL，1.21mol)。将混合物恢复至室温，搅拌18小时。向其中加水，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(20g，己烷/乙酸乙酯＝10/1)纯化，得到N-[2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯基]苯甲酰胺(N-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]benzamide)(GIF-0344)(126mg，86.7％)的无色固体。

熔点、TLC和¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)的结果如下。

熔点128-129℃、TLC R_f 0.46(己烷/乙酸乙酯＝4/1)；¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ1.62-1.70(m，2H，CH₂)，1.78(tt，4H，J＝5.2，5.2Hz，2CH₂)，2.88(t，4H，J＝5.2Hz，2CH₂)，7.26(d，1H，J＝8.6Hz，芳香性)，7.35(d，1H，J＝0.8，8.6Hz，芳香性)，7.52-7.61(m，1H，芳香性)，8.10(m，2H，芳香性)，7.94(m，2H，芳香性)，8.91(d，1H，J＝0.8Hz，芳香性)，9.44(s，1H，NH)。

[参考例9]编号GIF-0345

在0℃下向参考例1-2得到的2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯胺(2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline(51.2mg，0.209mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(2mL)溶液中依次添加4-硝基苯甲酰氯(4-nitrobenzoyl chloride)(64.2mg，0.345mmol，商品名)和三乙基胺(triethylamine)(120μL，0.859mol)。将混合物恢复至室温，搅拌60小时。向其中加水，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(30g，己烷/乙酸乙酯＝8/1～6/1)纯化，得到N-[2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯基]-4-硝基苯甲酰胺(N-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]-4-nitrobenzamide)(GIF-0345)(46.3mg，56.3％)的黄色固体。

熔点、TLC和¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)的结果如下。

熔点125-136℃；TLC R_f 0.33(己烷/乙酸乙酯＝4/1)；¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ1.62-1.70(m，2H，CH₂)，1.77(tt，4H，J＝5.0，5.0Hz，2CH₂)，2.88(t，4H，J＝5.0Hz，2CH₂)，7.30(d，1H，J＝8.0Hz，芳香性)，7.40(dd，1H，J＝1.6，8.2Hz，芳香性)，8.10(dd，2H，J＝1.8，6.8Hz，芳香性)，8.41(d，2H，J＝1.8，6.8Hz，芳香性)，8.86(d，1H，J＝2.0Hz，芳香性)，9.54(s，1H，NH)。

[参考例10]编号GIF-0615的合成

在0℃下向参考例1-2得到的2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯胺(2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline(147mg，0.602mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(4mL)溶液中依次添加4-甲氧基苯甲酰氯(4-methoxybenzoyl chloride)(250mg，1.47mmol，商品名)和三乙基胺(triethylamine)(254μL，1.83mol)。将混合物恢复至室温，搅拌17小时。向其中加水，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(20g，己烷/乙酸乙酯＝5/1)纯化，得到N-[2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯基]-4-甲氧基苯甲酰胺(N-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]-4-methoxybenzamide)(GIF-0615)(240mg，quant.)的无色固体。

熔点、TLC和¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)的结果如下。

熔点111-114℃；TLC R_f 0.33(己烷/乙酸乙酯＝4/1)；¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ1.64-1.68(m，2H，CH₂)，1.78(tt，4H，J＝5.4，5.4H z.2CH₂)，1.60-1.70(m，2H，CH₂)，2.39-2.41(m，2H，CH₂)，2.87(t，4H，J＝5.4H z.2CH₂)，3.89(s，3H，CH₃)，7.03(dd，2H，J＝2.0，7.0Hz，芳香性)，7.23(d，1H，J＝8.0Hz，芳香性)，7.32(dd，1H，J＝1.6，8.0Hz，芳香性)，7.91(dd，2H，J＝2.0，7.0Hz，芳香性)，8.88(d，1H，J＝1.6Hz，芳香性)，9.34(s，1H，NH)。

[参考例11]编号GIF-0622的合成

在室温下向参考例1-2得到的2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯胺(2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline(149mg，0.610mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(5mL)溶液中依次添加对甲苯磺酰氯(p-toluenesulfonyl chloride)(233g，1.22mmol，商品名)和三乙基胺(triethylamine)(254μL，1.83mol)，将混合物搅拌60小时。向其中加水，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(20g，己烷/乙酸乙酯＝10/1)纯化，得到N-[2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯基]-对甲苯磺酰胺(N-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]-p-toluenesulfonamide)(GIF-0622)(243mg，quant)的无色固体。

熔点、TLC和¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)的结果如下。熔点117-134℃；TLC R_f0.49(己烷/乙酸乙酯＝5/1)；¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ1.55-1.60(m，2H，CH₂)，1.66(tt，4H，J＝5.2，5.2Hz，2CH₂)，2.36(s，3H，CH₃)，2.51(t，4H，J＝5.2Hz，2CH₂)，7.11(d，1H，J＝8.0Hz，芳香性)，7.22-7.28(m，3H，芳香性)，7.71(dd，2H，J＝1.8，8.6Hz，芳香性)，7.85(d，1H，J＝2.0Hz，芳香性)，7.94(s，1H，NH)。

[参考例12]编号GIF-0624的合成

在70℃下将硫氰化钾(potassium thiocyanate，商品名)(119mg，1.22mmol)和烟酰氯盐酸盐(nicotinoyl chloride hydrochloride)(352mg，1.97mmol)的乙腈(15mL)溶液搅拌40分钟。恢复至室温后，向其中依次添加参考例1-2得到的2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯胺(2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline(244mg，1.00mmol)的乙腈(5mL)溶液和三乙基胺(triethylamine)(278μL，2.00mmol)，将混合物在50℃搅拌1小时。向其中加水，用二氯甲烷(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(25g，己烷/乙酸乙酯＝4/1～1/1)纯化，得到1-烟酰基-3-[2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯基]磺脲(1-nicotinoyl-3-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]thiourea)(GIF-0624)(383mg，93.7％)的淡黄色固体。

熔点、TLC和¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)的结果如下。

熔点142-144℃；TLC R_f0.26(己烷/乙酸乙酯＝1/1)；¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ1.58-1.67(m，2H，CH₂)，1.75-1.85(m，4H，2CH₂)，2.89-2.95(m，4H，2CH₂)，7.33-7.40(m，1H，芳香性)，7.44-7.48(m，1H，芳香性)，7.60-7.65(m，1H，芳香性)，8.76-8.78(m，1H，芳香性)，9.05(s，0.6H，芳香性)，9.09-9.14(m，1H，芳香性)，8.37-8.39(m，1H，芳香性)，8.49(s，0.4H，芳香性)。

[参考例13]编号GIF-0614的合成

在0℃下向参考例1-3得到的N-[2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(SRPIN-1，GIF-0340)(121mg，0.496mmol)的N，N-二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide(DMF))(0.5mL)溶液中添加氢氧化钠(60％w/w油混合物)(200mg，0.500mmol)，将混合物搅拌1小时。在0℃下向其中添加碘代甲烷的N，N-二甲基甲酰胺溶液(N，N-dimethylformamide(DMF))(0.8M，0.62mL，0.496mmol)，再将混合物搅拌3小时。向其中加水，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(12g，己烷/乙酸乙酯＝1/1)纯化，得到N-甲基-N-[2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-methyl-N-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF-0614)(65.9mg，51.5％)的无色固体。

熔点、TLC和¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)的结果如下。

熔点119-121℃；TLC R_f 0.36(己烷/乙酸乙酯＝1/1)；¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ1.50-1.60(m，2H，CH₂)，1.60-1.70(m，2H，CH₂)，1.60-1.70(m，2H，CH₂)，2.39-2.41(m，2H，CH₂)，2.80-2.82(m，2H，CH₂)，3.20(s，3H，CH₃)，6.86(d，1H，J＝8.3Hz，芳香性)，7.15(d，2H，J＝4.4Hz，芳香性)，7.41(d，2H，J＝8.3Hz，芳香性)，7.48(s，1H，芳香性)，8.44(d，2H，J＝4.4Hz，芳香性)。

[参考例14]编号GIF-0616的合成

向参考例1-3得到的N-[2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(SRPIN-1，GIF-0340)(528mg，1.51mmol)的甲苯(2.5mL)溶液中添加Lawesson’s试剂(328mg，0.811mmol，商品名)，将混合物在100℃下回流搅拌12小时。恢复至室温后，向其中加入2M的氢氧化钠水溶液，使成碱性，再用12M的氢氧化钠水溶液(×3)逆萃取混合物。向得到的水层中加入2M盐酸使溶液成酸性，然后用乙醚(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(50g，己烷/乙酸乙酯＝1/1)纯化，得到N-[2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯基]硫代异烟酰胺(N-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinthioamide)(GIF-0616)(186mg，33.7％)的无色固体。

熔点、TLC和¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)的结果如下。

熔点108-109℃；TLC R_f 0.27(己烷/乙酸乙酯＝1/1)；¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ1.61-1.62(m，2H，CH₂)，1.68(tt，4H，J＝5.0，5.0Hz，2CH₂)，2.87(t，4H，J＝5.0Hz，2CH₂)，7.32(d，1H，J＝7.8Hz，芳香性)，7.51(dd，1H，J＝1.6Hz，芳香性)，7.71(dd，2H，J＝1.6，6.4Hz，芳香性)，8.76(dd，2H，J＝1.6，6.4Hz，芳香性)，9.58(d，1H，J＝1.6Hz，芳香性)，10.5(s，1H，NH)。

[参考例15]编号GIF-0341的合成

[参考例15-1]

在室温下向1，4-二氯-2-硝基苯(1，4-dichloro-2-nitrobenzene)(390mg，2.03mmol，商品名)的N，N-二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide(DMF))(1mL)溶液中加入哌啶(piperidine)(600μL，6.66mmol，商品名)，将混合物搅拌18.5小时。向其中加入水后，用乙酸乙酯萃取混合物(×3)。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(30g，己烷/乙酸乙酯＝10/1)纯化，得到1-(4-氯-2-硝基苯基)哌啶(1-(4-chloro-2-nitrophenyl)piperidine)(471mg，96.4％)的橙色油状物质。

TLC R_f 0.18(己烷)。

[参考例15-2]

在0℃下向参考例15-1得到的1-(4-氯-2-硝基苯基)哌啶(1-(4-chloro-2-nitrophenyl)piperidine(471mg，1.95mmol)的甲醇(10mL)溶液中依次添加浓盐酸(2.00mL，24.0mmol)和无水二氯化锡(1.84g，9.70mmol)。将混合物恢复至室温，搅拌16小时。向其中添加饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(30g，己烷/乙酸乙酯＝9/1)纯化，得到5-氯-2-(1-哌啶基)苯胺(5-chloro-2-(1-piperidinyl)aniline)(388mg，94.3％)的无色油状物质。

TLC R_f 0.26(己烷/乙酸乙酯＝18/1)。

[参考例15-3]

在室温下向参考例15-2得到的5-氯-2-(1-哌啶基)苯胺(5-chloro-2-(1-piperidinyl)aniline)(378mg，1.79mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)

(10mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloridehydrochloride)(350mg，1.96mmol，商品名)、三乙基胺(triethylamine)(740μL，5.30mmol)和催化剂量的4-(二甲基氨基)吡啶(4-(dimethylamino)pyridine)，搅拌19小时。向其中加水，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水溶液洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(200g，己烷/乙酸乙酯＝1/1)纯化，得到N-[5-氯-2-(1-哌啶基)苯基]异烟酰胺(N-[5-chloro-2-(1-piperidinyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF-0341)(180mg，31.8％)的无色固体。

TLC和¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)的结果如下。

熔点141-143℃；TLC R_f 0.32(己烷/乙酸乙酯＝1/1)；¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ1.61-1.62(m，2H，CH₂)，1.76(tt，4H，J＝5.0，5.0Hz，2CH₂)，2.82(t，4H，J＝5.0Hz，2CH₂)，7.09(dd，1H，J＝2.6，8.8Hz，芳香性)，7.14(d，1H，J＝8.8Hz，芳香性)，7.75(dd，2H，J＝1.6，4.4Hz，芳香性)，8.60(d，1H，J＝2.6Hz，芳香性)，8.85(dd，2H，J＝1.6，4.4Hz，芳香性)，9.66(s，1H，NH)。

[参考例16]编号GIF-0342的合成

[参考例16-1]

在室温下向4-氯-3-硝基甲苯(4-chloro-3-nitrotoluene)(358mg，2.08mmol，商品名)的N，N-二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide(DMF))(1mL)溶液中加入哌啶(piperidine)(660μL，6.66mmol，商品名)，将混合物在100℃下搅拌17小时。恢复至室温后，向其中加入水，用乙酸乙酯萃取混合物(×3)。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(50g，己烷/乙酸乙酯＝50/1)纯化，得到1-(4-甲基-2-硝基苯基)哌啶(1-(4-methyl-2-nitrophenyl)piperidine(212mg，46.2％)的无色油状物质。

TLC R_f 0.54(己烷/乙酸乙酯-10/1)。

[参考例16-2]

在0℃下向参考例16-1得到的1-(4-甲基-2-硝基苯基)哌啶(1-(4-methyl-2-nitrophenyl)piperidine)(212mg，0.880mmol)的甲醇(5mL)溶液中依次添加浓盐酸(0.70mL，8.4mmol)和无水二氯化锡(834mg，4.39mmol)。将混合物恢复至室温，搅拌16小时。向其中添加饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(20g，己烷/乙酸乙酯＝12/1)纯化，得到5-甲基-2-(1-哌啶基)苯胺(5-methyl-2-(1-piperidinyl)aniline)(164mg，95.0％)的淡黄色油状物质。

TLC R_f 0.36(己烷/乙酸乙酯＝10/1)。

[参考例16-3]

在室温下向参考例16-2得到的5-甲基-2-(1-哌啶基)苯胺(5-methyl-2-(1-piperidinyl)aniline)(155mg，0.815mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(5mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloride hydrochloride)(172mg，0.966mmol，商品名)、三乙基胺(triethylamine)(340μL，2.44mmol)和催化剂量的4-(二甲基氨基)吡啶(4-(dimethylamino)pyridine)，将混合物搅拌19小时。向其中加水，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水溶液洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(10g，己烷/乙酸乙酯＝1/1)纯化，得到N-[5-甲基-2-(1-哌啶基)苯基]异烟酰胺(N-[5-methyl-2-(1-piperidinyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF-0342)(69.5mg，28.8％)的无色固体。

TLC和¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)的结果如下。

熔点142-144℃；TLC R_f 0.35(己烷/乙酸乙酯＝1/1)；¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ1.62-1.70(m，2H，CH₂)，1.75(tt，4H，J＝4.9，4.9Hz，2CH₂)，2.37(s，3H，CH₃)，2.82(t，4H，J＝4.9Hz，2CH₂)，6.94(dd，1H，J＝1.6，8.1Hz，芳香性)，7.12(d，1H，J＝8.1Hz，芳香性)，7.76(dd，2H，J＝1.3，4.5Hz，芳香性)，8.38(d，1H，J＝1.6Hz，芳香性)，8.84(dd，2H，J＝1.3，4.5Hz，芳香性)，9.75(s，1H，NH)。

[参考例17]编号GIF-0348的合成

[参考例17-1]

在室温下向1，4-二氟-2-硝基苯(1，4-difluoro-2-nitrobenzene)(225mg，1.41mmol，商品名)的N，N-二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide(DMF))(0.5mL)溶液中加入哌啶(piperidine)(320μL，3.23mmol，商品名)，将混合物搅拌2小时。向其中加入水，用乙酸乙酯萃取混合物(×3)。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(20g，己烷/乙酸乙酯＝12/1)纯化，得到1-(4-氟-2-硝基苯基)哌啶(1-(4-fluoro-2-nitrophenyl)piperidine)(298mg，94.2％)的橙色油状物质。

TLC R_f 0.46(己烷/乙酸乙酯＝12/1)。

[参考例17-2]

在0℃下向参考例17-1得到的1-(4-氟-2-硝基苯基)哌啶(1-(4-fluoro-2-nitrophenyl)piperidine)(289mg，1.28mmol)的甲醇(5mL)溶液中依次添加浓盐酸(1.20mL，14.4mmol)和无水二氯化锡(1.22g，6.43mmol)。将混合物恢复至室温，搅拌21小时。向其中添加饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(25g，己烷/乙酸乙酯＝12/1)纯化，得到5-氟-2-(1-哌啶基)苯胺(5-fluoro-2-(1-piperidinyl)aniline)(250mg，quant.)的无色油状物质。

TLC R_f 0.34(己烷/乙酸乙酯＝16/1)。

[参考例17-3]

在0℃下向参考例17-2得到的5-氟-2-(1-哌啶基)苯胺(5-fluoro-2-(1-piperidinyl)aniline)(248mg，1.27mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(10mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloride hydrochloride)(454mg，2.55mmol，商品名)、三乙基胺(triethylamine)(385μL，3.83mmol)。将混合物恢复至室温，搅拌17小时。向其中加水，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水溶液洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(15g，己烷/乙酸乙酯＝1.5/1)纯化，得到N-[5-氟-2-(1-哌啶基)苯基]异烟酰胺(N-[5-fluoro-2-(1-piperidinyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF-0348)(257mg，67.6％)的无色固体。

TLC和¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)的结果如下。

熔点115-116℃；TLC R_f 0.40(己烷/乙酸乙酯＝1/1)；¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ1.62-1.69(m，2H，CH₂)，1.76(bs，4H，2CH₂)，2.82(bs，4H，2CH₂)，6.81(ddd，1H，J＝2.8，8.8，10.8Hz，芳香性)，7.18(dd，1H，J＝5.6，8.8Hz，芳香性)，7.75(dd，2H，J＝2.0，4.4Hz，芳香性)，8.34(dd，1H，J＝2.8，10.8Hz，芳香性)，9.16(dd，2H，J＝2.0，4.4Hz，芳香性)，9.83(s，1H，NH)。

[参考例18]编号GIF-0349的合成

[参考例18-1]

在室温下向2-氟-1-硝基苯(2-fluoro-1-nitrobenzene)(219mg，1.55mmol，商品名)的N，N-二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide(DMF))(0.5mL)溶液中加入哌啶(piperidine)(338μL，3.41mmol，商品名)，将混合物搅拌2小时。向其中加入水，用乙酸乙酯萃取混合物(×3)。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(20g，己烷/乙酸乙酯＝20/1)纯化，得到1-(2-硝基苯基)哌啶(1-(2-nitrophenyl)piperidine)(315mg，98.8％)的无色油状物质。

TLC R_f 0.53(己烷/乙酸乙酯＝16/1)。

[参考例18-2]

在0℃下向参考例18-1得到的1-(2-硝基苯基)哌啶(1-(2-nitrophenyl)piperidine)(315mg，1.52mmol)的甲醇(10mL)溶液中依次添加浓盐酸(1.50mL，18.0mmol)和无水二氯化锡(1.45g，7.64mmol)。将混合物恢复至室温，搅拌17小时。向其中添加饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(20g，己烷/乙酸乙酯＝15/1)纯化，得到2-(1-哌啶基)苯胺(2-(1-piperidinyl)aniline)(238mg，88.8％)的淡黄色油状物质。

TLC R_f 0.19(己烷/乙酸乙酯＝18/1)。

[参考例18-3]

在0℃下向参考例18-2得到的2-(1-哌啶基)苯胺(2-(1-piperidinyl)aniline)(203mg，1.15mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(5mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloride hydrochloride)(616mg，3.46mmol，商品名)、三乙基胺(triethylamine)(800μL，5.73mmol)。将混合物恢复至室温，搅拌2小时。向其中加水，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水溶液洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(20g，己烷/乙酸乙酯＝1/1)纯化，得到N-[2-(1-哌啶基)苯基]异烟酰胺(N-[2-(1-piperidinyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF-0349)(259mg，80.0％)的无色固体。

熔点、TLC和¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)的结果如下。

熔点111-113℃；TLC R_f 0.35(己烷/乙酸乙酯＝1/1)；¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ1.62-1.67(m，2H，CH₂)，1.76(tt，4H，J＝4.8，4.8Hz，2CH₂)，2.85(t，4H，J＝4.8Hz，2CH₂)，7.13(td，1H，J＝1.6，7.8Hz，芳香性)，7.21(td，1H，J＝1.6，7.8Hz，芳香性)，7.24(dd，1H，J＝1.6，7.8Hz，芳香性)，7.77(dd，2H，J＝1.9，4.4Hz，芳香性)，8.53(dd，1H，J＝1.6，7.8Hz，芳香性)，8.84(dd，2H，J＝1.9，4.4Hz，芳香性)，9.71(s，1H，NH)。

[参考例19]编号GIF-0619的合成

[参考例19-1]

在0℃下向1-氟-2-硝基-4-(三氟甲基)苯(1-fluoro-2-nitro-4-(trmuoromethyl)benzene)(498mg，2.38mmol，商品名)的N，N-二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide(DMF))(2mL)溶液中依次加入二氢吲哚(indoline)(402μL，3.59mmol，商品名)和N，N-二异丙基乙胺(N，N-diisopropylethylamine)(619μL，3.59mmol)。将混合物恢复至室温，搅拌1小时，然后加热至70℃，搅拌5.5小时。将混合物恢复至室温，向其中加入水，然后用乙酸乙酯萃取混合物(×3)。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(30g，己烷/乙酸乙酯＝20/1)纯化，得到1-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]二氢吲哚(1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]indoline(730mg，99.4％)的深红色油状物质。

TLC R_f 0.48(己烷/乙酸乙酯＝6/1)。

[参考例19-2]

在0℃下向参考例19-1得到的1-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]二氢吲哚(1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]indoline)(730mg，2.37mmol)的甲醇(7mL)溶液中依次添加浓盐酸(1.28mL，15.4mmol)和无水二氯化锡(1.57g，8.30mmol)。将混合物恢复至室温，搅拌8小时。向其中添加饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(50g，己烷/乙酸乙酯＝10/1)纯化，得到1-[2-氨基-4-(三氟甲基)苯基]二氢吲哚(1-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]indoline)(619mg，93.9％)的橙红色油状物质。

TLC R_f 0.27(己烷/乙酸乙酯＝6/1)。

[参考例19-3]

在0℃下向参考例19-2得到的1-[2-氨基-4-(三氟甲基)苯基]二氢吲哚(1-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]indoline)(518mg，1.86mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(5mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloride hydrochloride)(669mg，3.76mmol，商品名)、三乙基胺(triethylamine)(773μL，5.58mmol)。将混合物恢复至室温，搅拌2.5小时。向其中加水，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水溶液洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(50g，己烷/乙酸乙酯＝1/1)纯化，得到N-[2-(1-二氢吲哚基)-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-[2-(1-indolinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF-0619)(643mg，90.1％)的无色固体。

TLC R_f 0.32(己烷/乙酸乙酯＝1/1)。

[参考例20]编号GIF-0620的合成

[参考例20-1]

在0℃下向1-氟-2-硝基-4-(三氟甲基)苯(1-fluoro-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene)(508mg，2.43mmol，商品名)的N，N-二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide(DMF))(2mL)溶液中依次加入二氢异吲哚(isoindoline)(679μL，5.98mmol，商品名)。将混合物恢复至室温，搅拌2小时。向其中加入水，然后用乙酸乙酯萃取混合物(×3)。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(30g，己烷/乙酸乙酯＝15/1)纯化，得到2-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]二氢异吲哚(2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]isoindoline(749mg，quant.)的黄色固体。

TLC R_f 0.42(己烷/乙酸乙酯＝10/1)。

[参考例20-2]

在0℃下向参考例20-1得到的2-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]二氢异吲哚(2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]isoindoline)(641mg，2.08mmol)的甲醇(7mL)溶液中依次添加浓盐酸(1.13mL，13.5mmol)和无水二氯化锡(1.38g，7.28mmol)。恢复至室温，将混合物搅拌8.5小时。向其中添加饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(30g，己烷/乙酸乙酯＝15/1)纯化，得到2-[2-氨基-4-(三氟甲基)苯基]二氢异吲哚(2-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]isoindoline)(225mg，38.9％)的橙红色油状物质。

TLC R_f 0.38(己烷/乙酸乙酯＝10/1)。

[参考例20-3]

在0℃下向参考例20-2得到的2-[2-氨基-4-(三氟甲基)苯基]二氢异吲哚(2-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]isoindoline)(193mg，0.694mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(6mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloride hydrochloride)(250mg，1.40mmol，商品名)和三乙基胺(triethylamine)(287μL，2.07mmol)。恢复至室温，将混合物搅拌3小时。向其中加水，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水溶液洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(5g，己烷/乙酸乙酯＝1/1)纯化，得到N-[2-(2-二氢异吲哚基)-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-[2-(2-isoindolinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF-0620)(266mg，quant.)的无色固体。

TLC R_f 0.31(己烷/乙酸乙酯＝1/1)。

[参考例21]编号GIF-0621的合成

[参考例21-1]

在0℃下向1-氟-2-硝基-4-(三氟甲基)苯(1-fluoro-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene)(506g，2.42mmol，商品名)的N，N-二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide(DMF))(4mL)溶液中依次加入1，2，3，4-四氢异喹啉(1，2，3，4-tetrahydroisoquinoline)(909μL，7.26mmol，商品名)。将混合物恢复至室温，搅拌3.5小时。向其中加入水，然后用乙酸乙酯萃取混合物(×3)。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(30g，己烷/乙酸乙酯＝10/1)纯化，得到1，2，3，4-四氢-2-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]异喹啉(1，2，3，4-tetrahydro-2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]isoquinoline(779mg，99.9％)的橙色固体。

TLC R_f 0.54(己烷/乙酸乙酯＝10/1)。

[参考例21-2]

在0℃下向参考例21-1得到的1，2，3，4-四氢-2-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]异喹啉(1，2，3，4-tetrahydro-2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]isoquinoline(658mg，2.04mmol)的甲醇(8mL)溶液中依次添加浓盐酸(1.11mL，13.3mmol)和无水二氯化锡(1.35g，7.12mmol)。恢复至室温，将混合物搅拌18小时。向其中添加饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(30g，己烷/乙酸乙酯＝20/1)纯化，得到2-[2-氨基-4-(三氟甲基)苯基]-1，2，3，4-四氢异喹啉(2-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]-1，2，3，4-tetrahydroisoquinoline)(426mg，71.4％)的橙红色油状物质。

TLC R_f 0.36(己烷/乙酸乙酯＝10/1)。

[参考例21-3]

在0℃下向参考例21-2得到的2-[2-氨基-4-(三氟甲基)苯基]-1，2，3，4-四氢异喹啉(2-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]-1，2，3，4-tetrahydroisoquinoline)(315mg，1.08mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(5mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloride hydrochloride)(390mg，2.19mmol，商品名)和三乙基胺(triethylamine)(449μL，3.24mmol)。恢复至室温，将混合物搅拌0.5小时。向其中加水，用二氯甲烷(×3)萃取混合物。用饱和食盐水溶液洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(20g，己烷/乙酸乙酯＝2/1)纯化，得到N-[2-(1，2，3，4-四氢异喹啉-2-基)-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-[2-(1，2，3，4-tetrahydroisoquinolin-2-yl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF-0621)(418mg，97.6％)的无色固体。

TLC R_f 0.52(己烷/乙酸乙酯＝1/1)。

[参考例22]编号GIF-0608的合成

在0℃下向3-(三氟甲基)苯胺(3-(trifluoromethyl)aniline，商品名)(208mg，1.29mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(5mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloride hydrochloride)(670mg，3.76mmol，商品名)和三乙基胺(triethylamine)(864μL，6.20mmol)。恢复至室温，将混合物搅拌23小时。向其中加水，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水溶液洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过重结晶纯化，得到N-[3-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF-0608)(166mg，48.3％)的无色固体。

TLC R_f 0.26(己烷/乙酸乙酯＝1/2)。

[参考例23]编号GIF-0612的合成

在0℃下向2-溴-5-(三氟甲基)苯胺(2-bromo-5-trifluoromethyl)aniline，商品名)(480mg，2.00mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(5mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloride hydrochloride)(427mg，2.39mmol，商品名)和三乙基胺(triethylamine)(410μL，2.94mmol)。恢复至室温，将混合物搅拌24小时。向其中加水，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水溶液洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过重结晶纯化，得到N-[2-溴-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-[2-bromo-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF-0612)(308mg，44.8％)的无色固体。

TLC R_f 0.46(己烷/乙酸乙酯＝1/1)。

[参考例24]SRPIN-1的毒性试验

用哺乳动物进行SRPIN-1的染色体变异筛选试验。用中国仓鼠CHL细胞(大日本制药株式会社)，以染色体变异诱发性为指标检索SRPIN-1的变异原性。试验研究了利用短时间处理(处理时间：6小时，恢复时间：18小时)的代谢活性法时(+S9mix)和不存在代谢活性化系统时的连续处理法(24小时处理)。将CHL细胞在添加了10％的10％胎牛血清(ICN Flow)的MEM Earle的液体培养基(GIBCO BRL)中，在5％CO₂、37℃的条件下培养。给Sprague-Dawley(雄，日本CharlesRiver Laboratories，7周龄)以每天一次的比例连续4天腹腔内投与苯巴比妥(第1次30mg/kg，第2-4次60mg/kg)，再于投与第3天腹腔内施用5，6-苯并黄酮80mg/kg，将从这样的肝脏制备的S9fraction(Oriental酵母工业；A.T.Natarajan等人，Mutation Res.，37，pp 83-90(1976))用于利用代谢活性法的分析。分析所用的S9 mix的组成为1mL中有4μmol HEPES缓冲液(pH 7.4)、5μmol MgCl₂、33μmol KCl、5μmol G6P、4μmol NADP和0.3mL S9 fraction。

在短时间处理法中，将CHL细胞(约4×10³cells/mL)在5mL的培养液中在60mm的玻璃器皿中培养3天后，从玻璃器皿中取出1.33mL培养液，加入0.83mL S9 mix，立即加入各用量的被检液0.5mL(终浓度5、1.58、0.5mg/mL；溶解于0.5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)水溶液中)。培养6小时后，用PBS洗涤，更换新的培养液5mL，再培养18小时。另外用0.5％CMC-Na水溶液(0.5mL)作为阴性对照，用二甲基亚硝胺(DMN；终浓度500μg/mL)作为阳性对照，进行同样的操作。在连续处理法中，将含CHL细胞(约4×10³cells/mL)的5mL培养液在60mm的玻璃器皿中培养3天后，从玻璃器皿中取出0.5mL培养液，加入各用量的被检液0.5mL(终浓度5、1.58、0.5mg/mL)；培养24小时(约1.5细胞周期)。另外用0.5％CMC-Na水溶液(0.5mL)作为阴性对照，用丝裂霉素C(MMC；终浓度0.05μg/mL)作为阳性对照，进行同样的操作。

培养结束2小时前加入10μg/mL的秋水仙酰胺0.1mL，用0.25％胰蛋白酶处理并回收细胞，用0.075M的氯化钾溶液进行低张处理后，用甲醇∶乙酸(3∶1)混合液固定，干燥后，进行吉姆萨染色。每个用量观察50个扩散良好的分裂中期图像，计算染色体结构变异和个数变异的种类和出现的数量。将结构变异分为染色分体切断(ctb)、染色分体交换(cte)、染色体切断(csb)、染色体交换(cse)、其他(5个以上的变异、断片、细粉化等)，按照变异种类记录出现数量。将即使具有1个这些异常的细胞也作为变异细胞。变异细胞出现率小于5％为阴性，大于等于5％、且小于10％为疑阳性、10％或以上为阳性。当被检物质处理组的染色体变异细胞出现率为10％或以上时，判定被检物质为诱发染色体变异的物质。对于阳性对照组的染色体结构变异细胞的出现率，DMN 500μg/Ml处理组为26个(52.0％)，MMC0.05μg/Ml处理组为24个(48.0％)，阴性对照未见变异，因此判断本试验实施适当。

试验结果如下：SRPIN-1的处理组的染色体结构变异细胞在短时间处理法、连续处理法中，在任何一种处理条件下染色体结构异常和数量异常细胞的增加都为阴性。以上结果说明该化合物对哺乳类培养细胞没有染色体变异诱发性。

[参考例25]SRPIN-1的体内给药

进行了大鼠的SRPIN-1单次经口给药毒性试验。对饲养期间体重增加顺利的一般状态下未见异常的Slc:SD大鼠(5周龄、日本SLC)经口施用125、250、500、1000、2000mg/kg的SRPIN-1，每组雌雄各2只(给药量10mL/kg)。从给药前一天的傍晚到给药后约4小时使动物绝食。给药后2天观察的结果为，雌雄均未见死亡，在一般状态也未见变化。接着将SRPIN-12000mg/kg与上述同样经口施用Slc:SD大鼠(5周龄)雌雄各5只，给药后观察14天，记录肉眼观察到的毒性症状的种类、程度、发现时间、恢复时间和死亡时间。结果，雌雄均未见死亡，一般状态也未见异常。

[实施例1A]HIV感染细胞的SR蛋白质的磷酸化

用9微升基因导入试剂Genejuice(70967-4；从Novagen购入)将3微克HIVpNL4-3基因组(Adachi，A.等人，1986，J.Virol.59：284-289)导入来源于人胎儿肾脏的Flp-In-293细胞(R750-07：从Invitrogen购入)。4天后，向细胞中加入1μLSDS-PAGE上样缓冲液，使其溶解，在95℃下热变性3分钟后，迅速置于冰上，将其作为蛋白质样品。

将该蛋白质用于蛋白印迹分析。将样品通过4-20％的梯度凝胶在40mA、45分钟的条件下通过用Laemmli缓冲液的SDS-PAGE分离。用Broad Range Pre-stained Marker参照物(02525-35；Nacalai)作为参照物检测分子量。接着对PROTRAN硝基纤维素薄膜(BA85；由Schleicher & Schuell BioScience购入)用TransBlot SD细胞(170-3940；由Bio-rad购入)在160mA，60min的条件下进行半干印迹。印迹结束后将膜用TBS振荡洗涤5分钟，接着用BlockingOne(03953-95；由Nacalai购入)封闭1小时，在室温下进行。再将膜用TBS洗涤，与用TBS稀释的识别磷酸化SR蛋白质的小鼠单克隆抗体104抗体(Mab104；由ATCC购入杂交瘤)、小鼠抗SC35抗体(S4045；由BDTransduction购入)、小鼠单克隆抗SF2抗体(AK103：Dr.Adrian Krainer提供；Hanamura，A.et al.，1998，RNA4：430-444；Kojima，T.等人，2001，J.Biol.Chem.276：32247-56)在4℃下培养过夜。

将膜在室温下用TBS振荡洗涤10分钟，进行3次。然后，将第二抗体的HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体(NA9310；由Amersham购入)用TBS稀释，与膜在室温下培养1小时。将膜在室温下用TBS振荡洗涤10分钟，进行3次。然后，通过利用ECL Detection Reagents(RPN2105；由Amersham购入)的化学发光法用LAS1000CCD相机(LAS1000；富士flim)拍摄。结果如图1A所示。

结果发现，伴随着HIVpNL4-3的感染，未见Mab104抗体、SC35抗体、SF2抗体的蛋白印迹分析的信号，不仅SR蛋白质脱磷酸化，SC35、SF2这些内在性SR蛋白质也分解了。

[实施例1B]SR蛋白质的分解

用Genejuice将1微克融合了HA标记的SRp75、SRp55、SRp40基因的质粒(HA-SRp75、HA-SRp55、HA-SRp40；由Dr.Woan-YuhTARN提供)导入来源于人胎儿肾脏的Flp-In-293细胞，36小时后，加入泛素蛋白酶体抑制剂MG132(474790；由CALBIOCHEM购入)至终浓度(10μM)。10小时后，进一步用SDS-PAGE上样缓冲液将细胞溶解，进行热变性，作为蛋白质样品。将其同样地进行SDS-PAGE，用羊抗HA抗体(H1803；由Santa Cruz购入)作为第一抗体，驴抗兔IgG抗体(NA 9340；由Amersham购入)作为第二抗体进行蛋白印记分析。结果如图1B所示。

结果，添加了MG132的细胞与对照相比得到更强的信号，因此可知通过MG132抑制了SRp75、SRp55、SRp40的蛋白质分解。另外，对于其他蛋白质也可得到同样的结果(数据未列)，可知通过MG132，SR蛋白质由泛素蛋白酶体进行分解。

[实施例2A]SRPK2稳定表达细胞中的SR蛋白质的磷酸化

用Flp-In-293细胞建立多株在Flp-In部位导入1个拷贝小鼠SRPK2基因的SRPK2稳定表达细胞。分析中以亲株Flp-In293作为mock，将所建立的多株的SRPK2稳定表达细胞中的SRPK2-2用于实验。将pNL4-3导入这2种细胞，4天后通过蛋白印记分析研究HIV感染的内在性SR蛋白质的动态。

与图1A同样，进行蛋白印记分析时，将HIVpNL4-3基因组导入SRPK2-2细胞时，用Mab104抗体在SRp35、SRp40、SRp55、SRp75的位置观察到信号，由此可知Mab104识别的SR结构域处于磷酸化状态。

进一步，根据使用SC35抗体、SF2抗体的蛋白印记分析，确认导入HIVpNL4-3基因的SRPK2-2细胞见到SC35、SF2的信号。示于图2A。

由这些结果可知，通常伴随着HIV感染，SR蛋白质会分解，但在SRPK2稳定表达细胞中SR蛋白质维持了磷酸化状态，结果稳定了SR蛋白质。由此可知，SRPK2稳定表达细胞中SR蛋白质处于磷酸化状态，不会通过泛素蛋白酶体分解。

[实施例2B]SRPK2稳定表达细胞中SR蛋白质的存在

向在Flp-In部位导入1个拷贝SRPK 2基因、稳定表达SRPK2基因的Flp-In-293细胞(SRPK2-2细胞)和亲株Flp-In-293(mock)中，用Genejuice导入1μg HIVpNL4-3基因组和1μg融合了HA标记的SRp75、SRp55和SRp40基因的质粒(HA-SRp75、HA-SRp55、HA-SRp40；由Dr.Woah-Yuh TARN提供)，36小时后回收样品，进行蛋白印记分析。结果如图2B所示。结果，随着HIV的感染，在Flp-In-293细胞中，不仅SC35、SF2，SRp75、SRp55、SRp40的抗HA抗体信号也消失或减弱。另外在SRPK2-2细胞中，同样地信号与对照相比减弱了，但与SC35、SF2同样，观察到SRp75、SRp55、SRp40的信号。

这些结果表明，随着HIV的感染，促进了SR蛋白质的分解，但在SRPK2-2细胞中，由于SR蛋白质被磷酸化，SR蛋白质稳定。

[实施例2C]测定HIV的产生量

在实施例2A(图2A)的实验时，回收培养上清测定HIV的产生量。回收导入基因后的培养上清，用lumipulse ELISA系统(Fujirebio)测定培养上清所含的HIV外膜蛋白质p24的量。结果如图2C所示。

结果，与mock的培养上清相比，在SRPK2-2细胞中产生了2.3倍量的HIV。

由上可知，相应于HIV感染，SR蛋白质脱磷酸化，使SR蛋白质恒定地处于磷酸化状态时，应急于感染的SR蛋白质的控制机构不发挥作用，结果HIV产生亢进。

这说明相应于HIV感染的SR蛋白质脱磷酸化发挥着宿主防御机构的功能。

[实施例3A]参与体内HIV产生的SR蛋白质的研究

HIV在其基因表达过程中用宿主的因子进行转录、加工、翻译。特别是，HIV的Tat、Rev具有断裂的外显子，推测对于其基因表达mRNA的剪接是必须的。

如实施例1-2(图1-2)所示，伴随着HIV感染，宿主的防御机构作用，SR蛋白质分解，但对体内参与HIV剪接反应、或参与此的蛋白质还不了解。实际上在细胞内存在多种SR蛋白质，将表达这些SR蛋白质的质粒(0.5μg)与HIVpNL4-3基因组一起导入，研究了其效果。结果如图3A所示。

将表达Mock、SC35、SF2、SRp40、SRp55、SRp75的质粒分别导入Flp-In293细胞内，36小时后回收培养上清，用lumipulse ELISA系统测定HIVp24的量。

结果，与Mock相比，SRp40、SRp75中HIVp24的量增加，确认了SRp40、SRp75中HIV产生亢进的效果。

[实施例3B]用hnRNPA1研究对体内HIV产生的效果

如图3B所示，与HIVpNL4-3基因组(0.5μg)和一定量(500ng)的SRp40、SRp75表达质粒，阶段性地增加hnRNPA1表达质粒的量，向Flp-In293细胞进行基因导入。36小时后回收培养上清，用lumipulse ELISA系统测定HIVp24的量。

得到的结果是用lumipulse ELISA系统测定的HIVp24量依赖于hnRNPA1的量减少。即，hnRNPA1相对于SRp40和SRp75竞争性地发挥作用，抑制HIV的产生。

这表明在细胞内HIV的基因表达通过剪接反应控制表达。实际上，由于SRp40、SRp75、hnRNPA1共存于细胞内，伴随HIV感染的SR蛋白质的分解优先于细胞内的hnRNPA1，由此抑制HIV基因表达作为防御机构。

[实施例4A]用于抑制细胞内SR蛋白质磷酸化的SRPK的抑制剂的探索

以磷酸化酶共同具有的ATP结合部位为目标，探索了竞争性结合的抑制剂。筛选结果，选中的化合物为分子量为349.35的Maybridge公司已经在销售的化合物之一(CAS Registry No.218156-96-8)。但是，关于磷酸化酶的抑制至今没有任何报道。我们将其命名为SRPIN-1(SRPK抑制剂-1)。

[实施例4B]使用SRPIN-1的SRPK1的磷酸化活性抑制的研究合成相当于SF2的RS结构域的RS肽(NH2-RSPSYGRSRSRSRSRSRSRSRSNSRSRSY-OH)(序列号5)。将其用10mM Tris-HCl(pH7.5)溶解，使成为1mg/ml。用1μg在大肠菌中表达纯化的重组SRPK1蛋白质，在反应缓冲液(250μMMgCl₂、0.25mM ATP、1mCi[γ-³²P]ATP、SRPIN-1终浓度0.1、0.3、1.0、3.0、10.0μM)中在30℃的水浴中培养10分钟。该磷酸化酶活性测定的SRPK1和RS肽的量和反应时间的条件是预先研究反应的直线性，选择了直线性成立的条件。

SRPK1和RS肽的反应进行10分钟后，将反应液滴至P81磷酸纤维素薄膜(P81；Whatman)，用5％磷酸溶液洗涤。洗涤后，通过液体闪烁计数器测定P81薄膜的³²P的放射活性。结果如图4B所示。

结果，SRPIN-1相对于SRPK1的IC50为约400nM。另外通过同样的方法研究了CLK1、CLK2、CLK3、CLK4、SRPK2、PRP4、PKA、PKC，由于即使终浓度为10μM  也未见抑制效果，因此可以说SRPIN-1是SRPK1的特异性酶抑制剂。

[实施例4C]对使用SRPIN-1的体内SR蛋白质磷酸化的抑制、以及伴随其的SR蛋白质分解诱导的研究

向Flp-In293细胞中导入HA-SRp75质粒(1.0μg)，36小时后分别添加MG132(终浓度10μM)、SRPIN-1(10、20、50μM)培养15小时。然后，用SDS-PAGE上样缓冲液溶解细胞，作为蛋白质样品。将该样品进行SDS-PAGE，用抗HA抗体进行蛋白印迹分析。作为蛋白质量的对照，使用抗β-肌动蛋白抗体进行蛋白印迹分析。结果示于图4C。

结果，HA抗体信号SRPIN-1浓度依赖性地减弱。这表明内源性的SRPK1活性SRPIN-1依赖性地被抑制，结果分解了SRp75蛋白质。

这说明SRPIN-1对SRPK1的抑制可在体内抑制SR蛋白质的磷酸化，结果使SR蛋白质不稳定，促进了蛋白质分解。

[实施例4D]SRPIN-1的添加对HIV感染的抑制的研究

向MT-4细胞中添加用293T细胞制备的HIV病毒颗粒，进行感染实验。首先，在向MT-4细胞添加病毒制备液的同时，添加SRPIN-1(终浓度0.5、10、20μM)。在2小时、37℃、5％CO₂的培养条件下培养后，离心细胞，更换新的培养液。然后，48小时后回收培养上清，用lumipulse ELISA系统测定HIVp24的量。结果示于图4D。

结果，用lumipulse ELISA系统测定HIVp24的量依赖于SRPIN-1的浓度而减少。这说明SRPIN-1可浓度依赖性地抑制HIV的产生。

[实施例5]使用SRPIN-1类似物的SRPK1/2的磷酸化活性的抑制

与实施例4B一样，确认使用SRPIN-1类似物的SRPK1和SRPK2的磷酸化活性的抑制活性。用1μg在大肠菌中表达纯化的重组SRPK1蛋白质和SRPK2蛋白质，在反应缓冲液(400μMHEPE(pH7.5)100μM MgCl₂、200μM ATP、1mCi[γ-³²P]ATP、RS肽(序列号5)1mg/ml、SRPIN-1类似物各10μM(DMSO中)在30℃的水浴中培养20分钟。

SRPK1或SRPK2和RS肽的反应进行20分钟后，将反应液滴至P81磷酸纤维素薄膜(P81；Whatman)，用5％磷酸溶液洗涤(10分钟，3次)。洗涤后，通过液体闪烁计数器测定P81薄膜³²P的放射活性。结果如图5A所示，各SRPIN-1类似物显示了对SRPK1和/或SRPK2的磷酸化活性抑制效果。特别是化合物编号340(SRPIN-1)～348、612、613、615、618、619、621、624、625对SRPK1或SRPK2具有强的抑制效果。

接着，确认了各SRPIN-1类似物对HIV复制的抑制效果。向MT-4细胞(JCRB No.JCRB0135)中添加用293T细胞制备的HIV病毒颗粒，进行感染实验。首先，在向MT-4细胞添加病毒制备液的同时，添加SRPIN-1类似物(终浓度5、10、20μM)。在2小时、37℃、5％CO₂的培养条件下培养后，离心细胞，更换新的培养液。然后，48小时后回收培养上清，用lumipulse ELISA系统测定HIVp24的量。结果图5B所示各SRPIN-1类似物具有抑制HIV复制的活性。特别是化合物编号340、341、342、343、345、347、348、608、613、615、616、618、619、620、622、623、624、625、626对HIV增殖具有强的抑制效果。另外，如图5C所示，在使用其他细胞(Jurkat)的实验中同样也确认了抑制HIV增殖的效果。

[实施例6]对辛德比斯病毒的增殖抑制效果

向Vero细胞(JCRB0111)中加入5μL辛德比斯病毒(4.7×10⁷PFU/ml)，将培养24小时的培养上清制备为病毒储液。将其添加至BHK21 Cl3细胞(JCRB9020)中，稀释为10²～10⁷PFU，同时添加SRPIN-1(终浓度5、10、20或40μM)。在室温下感染1小时后，加入含有1％甲基纤维素(SIGMA M0512-100G)的培养基，在48小时、37℃、5％CO₂的培养条件下静静地培养，在位相差显微镜下观察细胞形态，同时数出因感染辛德比斯病毒而导致细胞死亡的空斑数(空斑试验)，计算PFU/ml。

图6A示出了病毒感染20小时后的细胞位相差显微图像。在未施用SRPIN-1的细胞(图中的“+SIN、对照”)明显看到因辛德比斯病毒增殖而导致的细胞损伤，但是通过施用SRPIN-1(40μM)抑制了细胞损伤(图中的“+SIN、40μM(#340)”)。空斑试验的结果也表明5μM以上的SRPIN-1显著且浓度依赖性地抑制辛德比斯病毒的增殖(图6B)。

[实施例7]对巨细胞病毒的增殖抑制效果

向HFL1细胞(IFO50074)添加巨细胞病毒(1×10⁴PFU/ml)，同时添加SRPIN-1或其类似物(化合物编号340和349；终浓度20或40μM)。结果，感染7天后，在位相差显微镜下观察巨细胞病毒感染的HFL1细胞时发现，如图7所示，在没有添加SRPIN-1的对照组的HFL1细胞(图中的1和2)观察到巨细胞病毒感染特有的形态变化和细胞死亡，与此相对，添加了SRPIN-1(20μM)的HFL1细胞(图中的3)虽然感染了巨细胞病毒，但未见异常的形态变化或细胞死亡。在添加了高浓度(40μM)的SRPIN-1的HFL1细胞中，观察到认为是由该化合物引起的一部分细胞形态变化。另外，通过向HFL1细胞中添加SRPIN-1的类似物化合物(化合物编号349)20μM或40μM也可抑制巨细胞病毒感染引起的异常形态变化或细胞死亡(图中的5和6)。结果证明，在本试验条件下，SRPIN-1及其类似物可抑制巨细胞病毒感染引起的异常形态变化或细胞死亡。

[实施例8]对SARS病毒的增殖抑制效果

使Vero细胞(JCRB0111)感染SARS病毒(FFM-1)(Yamamoto，N.et.al.，Biochem Biophys Res Commun.318，719-72592004))，同时添加SRPIN-1或其类似物(终浓度5、10、20、40μM)。在室温感染2小时后，加入含有1％甲基纤维素(SIGMA M0512-100G)的D-MEM，在48小时、37℃、5％CO₂的培养条件下培养。数出SARS病毒而导致细胞死亡的空斑数(空斑试验)，计算PFU/ml。结果，如图8A所示，40μM的SRPIN-1及其类似物(化合物编号349)显著抑制了SARS病毒的增殖。但是，就效果而言，SRPIN-1与类似化合物(化合物编号349)相比，病毒增殖抑制效果更显著。另外，如图8B所示，SRPIN-1在1μM到40μM的浓度范围浓度依赖性地抑制SARS病毒的增殖。

产业实用性

根据本发明，明确了SRPIN-1(SR蛋白质磷酸化抑制剂1，SRprotein phosphorylation inhibitor 1)及其类似物具有抑制磷酸化酶SRPK的活性。发现SR蛋白质因被SRPK磷酸化而在细胞中稳定存在，但如通过这些SRPK抑制剂抑制SRPK的酶活性，则SR蛋白质的磷酸化被抑制，并经泛素蛋白酶体途径分解。因此尝试了添加SRPK抑制剂来抑制SRPK，在HIV感染实验中发现SRPK抑制剂具有抑制病毒复制的抗病毒作用。

进一步，本发明还有以下效果，即，提供通过控制SR蛋白质的活性以同一机理对广的范围的病毒有效的抗病毒剂。

序列表

<110>HAGIWARA，Masatoshi

<120>SR蛋白质的磷酸化控制方法以及以SR蛋白质活性控制剂为有效成分的抗病毒剂

<130>HAG-A0401P-CN

<140>

<141>

<150>JP 2003-435085

<151>2003-12-26

<160>5

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1965

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1965)

<223>

<400>1

atg gag cgg aaa gtg ctt gcg ctc cag gcc cga aag aaa agg acc aag       48

Met Glu Arg Lys Val Leu Ala Leu Gln Ala Arg Lys Lys Arg Thr Lys

1               5                   10                  15

gcc aag aag gac aaa gcc caa agg aaa tct gaa act cag cac cga ggc       96

Ala Lys Lys Asp Lys Ala Gln Arg Lys Ser Glu Thr Gln His Arg Gly

            20                  25                  30

tct gct ccc cac tct gag agt gat cta cca gag cag gaa gag gag att      144

Ser Ala Pro His Ser Glu Ser Asp Leu Pro Glu Gln Glu Glu Glu Ile

        35                  40                  45

ctg gga tct gat gat gat gag caa gaa gat cct aat gat tat tgt aaa      192

Leu Gly Ser Asp Asp Asp Glu Gln Glu Asp Pro Asn Asp Tyr Cys Lys

    50                  55                  60

gga ggt tat cat ctt gtg aaa att gga gat cta ttc aat ggg aga tac      240

Gly Gly Tyr His Leu Val Lys Ile Gly Asp Leu Phe Asn Gly Arg Tyr

65                  70                  75                  80

cat gtg atc cga aag tta ggc tgg gga cac ttt tca aca gta tgg tta      288

His Val Ile Arg Lys Leu Gly Trp Gly His Phe Ser Thr Val Trp Leu

                85                  90                  95

tca tgg gat att cag ggg aag aaa ttt gtg gca atg aaa gta gtt aaa      336

Ser Trp Asp Ile Gln Gly Lys Lys Phe Val Ala Met Lys Val Val Lys

            100                 105                 110

agt gct gaa cat tac act gaa aca gca cta gat gaa atc cgg ttg ctg      384

Ser Ala Glu His Tyr Thr Glu Thr Ala Leu Asp Glu Ile Arg Leu Leu

        115                 120                 125

aag tca gtt cgc aat tca gac cct aat gat cca aat aga gaa atg gtt      432

Lys Ser Val Arg Asn Ser Asp Pro Asn Asp Pro Asn Arg Glu Met Val

    130                 135                 140

gtt caa cta cta gat gac ttt aaa ata tca gga gtt aat gga aca cat      480

Val Gln Leu Leu Asp Asp Phe Lys Ile Ser Gly Val Asn Gly Thr His

145                 150                 155                 160

atc tgc atg gta ttt gaa gtt ttg ggg cat cat ctg ctc aag tgg atc      528

Ile Cys Met Val Phe Glu Val Leu Gly His His Leu Leu Lys Trp Ile

                165                 170                 175

atc aaa tcc aat tat cag ggg ctt cca ctg cct tgt gtc aaa aaa att      576

Ile Lys Ser Asn Tyr Gln Gly Leu Pro Leu Pro Cys Val Lys Lys Ile

            180                 185                 190

att cag caa gtg tta cag ggt ctt gat tat tta cat acc aag tgc cgt      624

Ile Gln Gln Val Leu Gln Gly Leu Asp Tyr Leu His Thr Lys Cys Arg

        195                 200                 205

atc atc cac act gac att aaa cca gag aac atc tta ttg tca gtg aat      672

Ile Ile His Thr Asp Ile Lys Pro Glu Asn Ile Leu Leu Ser Val Asn

    210                 215                 220

gag cag tac att cgg agg ctg gct gca gaa gca aca gaa tgg cag cga      720

Glu Gln Tyr Ile Arg Arg Leu Ala Ala Glu Ala Thr Glu Trp Gln Arg

225                 230                 235                 240

tct gga gct cct ccg cct tcc gga tct gca gtc agt act gct ccc cag      768

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ala Val Ser Thr Ala Pro Gln

                245                 250                 255

cct aaa cca gct gac aaa atg tca aag aat aag aag aag aaa ttg aag      816

Pro Lys Pro Ala Asp Lys Met Ser Lys Asn Lys Lys Lys Lys Leu Lys

            260                 265                 270

aag aag cag aag cgc cag gca gaa tta cta gag aag cga atg cag gaa      864

Lys Lys Gln Lys Arg Gln Ala Glu Leu Leu Glu Lys Arg Met Gln Glu

        275                 280                 285

att gag gaa atg gag aaa gag tcg ggc cct ggg caa aaa aga cca aac      912

Ile Glu Glu Met Glu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Gln Lys Arg Pro Asn

    290                 295                 300

aag caa gaa gaa tca gag agt cct gtt gaa aga ccc ttg aaa gag aac      960

Lys Gln Glu Glu Ser Glu Ser Pro Val Glu Arg Pro Leu Lys Glu Asn

305                 310                 315                 320

cca cct aat aaa atg acc caa gaa aaa ctt gaa gag tca agt acc att     1008

Pro Pro Asn Lys Met Thr Gln Glu Lys Leu Glu Glu Ser Ser Thr Ile

                325                 330                 335

ggc cag gat caa acg ctt atg gaa cgt gat aca gag ggt ggt gca gca     1056

Gly Gln Asp Gln Thr Leu Met Glu Arg Asp Thr Glu Gly Gly Ala Ala

            340                 345                 350

gaa att aat tgc aat gga gtg att gaa gtc att aat tat act cag aac     1104

Glu Ile Asn Cys Asn Gly Val Ile Glu Val Ile Asn Tyr Thr Gln Asn

        355                 360                 365

agt aat aat gaa aca ttg aga cat aaa gag gat cta cat aat gct aat     1152

Ser Asn Asn Glu Thr Leu Arg His Lys Glu Asp Leu His Asn Ala Asn

    370                 375                 380

gac tgt gat gtc caa aat ttg aat cag gaa tct agt ttc cta agc tcc     1200

Asp Cys Asp Val Gln Asn Leu Asn Gln Glu Ser Ser Phe Leu Ser Ser

385                 390                 395                 400

caa aat gga gac agc agc aca tct caa gaa aca gac tct tgt aca cct     1248

Gln Asn Gly Asp Ser Ser Thr Ser Gln Glu Thr Asp Ser Cys Thr Pro

                405                 410                 415

ata aca tct gag gtg tca gac acc atg gtg tgc cag tct tcc tca act     1296

Ile Thr Ser Glu Val Ser Asp Thr Met Val Cys Gln Ser Ser Ser Thr

            420                 425                 430

gta ggt cag tca ttc agt gaa caa cac att agc caa ctt caa gaa agc     1344

Val Gly Gln Ser Phe Ser Glu Gln His Ile Ser Gln Leu Gln Glu Ser

        435                 440                 445

att cgg gca gag ata ccc tgt gaa gat gaa caa gag caa gaa cat aac     1392

Ile Arg Ala Glu Ile Pro Cys Glu Asp Glu Gln Glu Gln Glu His Asn

    450                 455                 460

gga cca ctg gac aac aaa gga aaa tcc acg gct gga aat ttt ctt gtt     1440

Gly Pro Leu Asp Asn Lys Gly Lys Ser Thr Ala Gly Asn Phe Leu Val

465                 470                 475                 480

aat ccc ctt gag cca aaa aat gca gaa aag ctc aag gtg aag att gct     1488

Asn Pro Leu Glu Pro Lys Asn Ala Glu Lys Leu Lys Val Lys Ile Ala

                485                 490                 495

gac ctt gga aat gct tgt tgg gtg cac aaa cat ttc act gaa gat att     1536

Asp Leu Gly Asn Ala Cys Trp Val His Lys His Phe Thr Glu Asp Ile

            500                 505                 510

caa aca agg caa tat cgt tcc ttg gaa gtt cta atc gga tct ggc tat     1584

Gln Thr Arg Gln Tyr Arg Ser Leu Glu Val Leu Ile Gly Ser Gly Tyr

        515                 520                 525

aat acc cct gct gac att tgg agc acg gca tgc atg gcc ttt gaa ctg     1632

Asn Thr Pro Ala Asp Ile Trp Ser Thr Ala Cys Met Ala Phe Glu Leu

    530                 535                 540

gcc aca ggt gac tat ttg ttt gaa cct cat tca ggg gaa gag tac act     1680

Ala Thr Gly Asp Tyr Leu Phe Glu Pro His Ser Gly Glu Glu Tyr Thr

545                 550                 555                 560

cga gat gaa gat cac att gca ttg atc ata gaa ctt ctg ggg aag gtg     1728

Arg Asp Glu Asp His Ile Ala Leu Ile Ile Glu Leu Leu Gly Lys Val

                565                 570                 575

cct cgc aag ctc att gtg gca gga aaa tat tcc aag gaa ttt ttc acc     1776

Pro Arg Lys Leu Ile Val Ala Gly Lys Tyr Ser Lys Glu Phe Phe Thr

            580                 585                 590

aaa aaa ggt gac ctg aaa cat atc acg aag ctg aaa cct tgg ggc ctt     1824

Lys Lys Gly Asp Leu Lys His Ile Thr Lys Leu Lys Pro Trp Gly Leu

        595                 600                 605

ttt gag gtt cta gtg gag aag tat gag tgg tcg cag gaa gag gca gct     1872

Phe Glu Val Leu Val Glu Lys Tyr Glu Trp Ser Gln Glu Glu Ala Ala

    610                 615                 620

ggc ttc aca gat ttc tta ctg ccc atg ttg gag ctg atc cct gag aag     1920

Gly Phe Thr Asp Phe Leu Leu Pro Met Leu Glu Leu Ile Pro Glu Lys

625                 630                 635                 640

aga gcc act gcc gcc gag tgt ctc cgg cac cct tgg ctt aac tcc         1965

Arg Ala Thr Ala Ala Glu Cys Leu Arg His Pro Trp Leu Asn Ser

                645                 650                 655

<210>2

<211>655

<212>PRT

<213>人

<400>2

Met Glu Arg Lys Val Leu Ala Leu Gln Ala Arg Lys Lys Arg Thr Lys

1               5                   10                  15

Ala Lys Lys Asp Lys Ala Gln Arg Lys Ser Glu Thr Gln His Arg Gly

            20                  25                  30

Ser Ala Pro His Ser Glu Ser Asp Leu Pro Glu Gln Glu Glu Glu Ile

        35                  40                  45

Leu Gly Ser Asp Asp Asp Glu Gln Glu Asp Pro Asn Asp Tyr Cys Lys

    50                  55                  60

Gly Gly Tyr His Leu Val Lys Ile Gly Asp Leu Phe Asn Gly Arg Tyr

65                  70                  75                  80

His Val Ile Arg Lys Leu Gly Trp Gly His Phe Ser Thr Val Trp Leu

                85                  90                  95

Ser Trp Asp Ile Gln Gly Lys Lys Phe Val Ala Met Lys Val Val Lys

            100                 105                 110

Ser Ala Glu His Tyr Thr Glu Thr Ala Leu Asp Glu Ile Arg Leu Leu

        115                 120                 125

Lys Ser Val Arg Asn Ser Asp Pro Asn Asp Pro Asn Arg Glu Met Val

    130                 135                 140

Val Gln Leu Leu Asp Asp Phe Lys Ile Ser Gly Val Asn Gly Thr His

145                 150                 155                 160

Ile Cys Met Val Phe Glu Val Leu Gly His His Leu Leu Lys Trp Ile

                165                 170                 175

Ile Lys Ser Asn Tyr Gln Gly Leu Pro Leu Pro Cys Val Lys Lys Ile

            180                 185                 190

Ile Gln Gln Val Leu Gln Gly Leu Asp Tyr Leu His Thr Lys Cys Arg

        195                 200                 205

Ile Ile His Thr Asp Ile Lys Pro Glu Asn Ile Leu Leu Ser Val Asn

    210                 215                 220

Glu Gln Tyr Ile Arg Arg Leu Ala Ala Glu Ala Thr Glu Trp Gln Arg

225                 230                 235                 240

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ala Val Ser Thr Ala Pro Gln

                245                 250                 255

Pro Lys Pro Ala Asp Lys Met Ser Lys Asn Lys Lys Lys Lys Leu Lys

            260                 265                 270

Lys Lys Gln Lys Arg Gln Ala Glu Leu Leu Glu Lys Arg Met Gln Glu

        275                 280                 285

Ile Glu Glu Met Glu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Gln Lys Arg Pro Asn

    290                 295                 300

Lys Gln Glu Glu Ser Glu Ser Pro Val Glu Arg Pro Leu Lys Glu Asn

305                 310                 315                 320

Pro Pro Asn Lys Met Thr Gln Glu Lys Leu Glu Glu Ser Ser Thr Ile

                325                 330                 335

Gly Gln Asp Gln Thr Leu Met Glu Arg Asp Thr Glu Gly Gly Ala Ala

            340                 345                 350

Glu Ile Asn Cys Asn Gly Val Ile Glu Val Ile Asn Tyr Thr Gln Asn

        355                 360                 365

Ser Asn Asn Glu Thr Leu Arg His Lys Glu Asp Leu His Asn Ala Asn

370                 375                 380

Asp Cys Asp Val Gln Asn Leu Asn Gln Glu Ser Ser Phe Leu Ser Ser

385                 390                 395                 400

Gln Asn Gly Asp Ser Ser Thr Ser Gln Glu Thr Asp Ser Cys Thr Pro

                405                 410                 415

Ile Thr Ser Glu Val Ser Asp Thr Met Val Cys Gln Ser Ser Ser Thr

            420                 425                 430

Val Gly Gln Ser Phe Ser Glu Gln His Ile Ser Gln Leu Gln Glu Ser

        435                 440                 445

Ile Arg Ala Glu Ile Pro Cys Glu Asp Glu Gln Glu Gln Glu His Asn

    450                 455                 460

Gly Pro Leu Asp Asn Lys Gly Lys Ser Thr Ala Gly Asn Phe Leu Val

465                 470                 475                 480

Asn Pro Leu Glu Pro Lys Asn Ala Glu Lys Leu Lys Val Lys Ile Ala

                485                 490                 495

Asp Leu Gly Asn Ala Cys Trp Val His Lys His Phe Thr Glu Asp Ile

            500                 505                 510

Gln Thr Arg Gln Tyr Arg Ser Leu Glu Val Leu Ile Gly Ser Gly Tyr

        515                 520                 525

Asn Thr Pro Ala Asp Ile Trp Ser Thr Ala Cys Met Ala Phe Glu Leu

    530                 535                 540

Ala Thr Gly Asp Tyr Leu Phe Glu Pro His Ser Gly Glu Glu Tyr Thr

545                 550                 555                 560

Arg Asp Glu Asp His Ile Ala Leu Ile Ile Glu Leu Leu Gly Lys Val

                565                 570                 575

Pro Arg Lys Leu Ile Val Ala Gly Lys Tyr Ser Lys Glu Phe Phe Thr

            580                 585                 590

Lys Lys Gly Asp Leu Lys His Ile Thr Lys Leu Lys Pro Trp Gly Leu

        595                 600                 605

Phe Glu Val Leu Val Glu Lys Tyr Glu Trp Ser Gln Glu Glu Ala Ala

    6l0                 615                 620

Gly Phe Thr Asp Phe Leu Leu Pro Met Leu Glu Leu Ile Pro Glu Lys

625                 630                 635                 640

Arg Ala Thr Ala Ala Glu Cys Leu Arg His Pro Trp Leu Asn Ser

                645                 650                 655

<210>3

<211>2058

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(2058)

<223>

<400>3

atg tca gtt aac tct gag aag tcg tcc tct tca gaa agg ccg gag cct       48

Met Ser Val Asn Ser Glu Lys Ser Ser Ser Ser Glu Arg Pro Glu Pro

1               5                   10                  15

caa cag aaa gct cct tta gtt cct cct cct cca ccg cca cca cca cca       96

Gln Gln Lys Ala Pro Leu Val Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro

            20                  25                  30

cca ccg cca cct ttg cca gac ccc aca ccc ccg gag cca gag gag gag      144

Pro Pro Pro Pro Leu Pro Asp Pro Thr Pro Pro Glu Pro Glu Glu Glu

        35                  40                  45

atc ctg gga tca gat gat gag gag caa gag gac cct gcg gac tac tgc      192

Ile Leu Gly Ser Asp Asp Glu Glu Gln Glu Asp Pro Ala Asp Tyr Cys

    50                  55                  60

aaa ggt gga tat cat cca gtg aaa att gga gac ctc ttc aat ggc cgg      240

Lys Gly Gly Tyr His Pro Val Lys Ile Gly Asp Leu Phe Asn Gly Arg

65                  70                  75                  80

tat cat gtt att aga aag ctt gga tgg ggg cac ttc tct act gtc tgg      288

Tyr His Val Ile Arg Lys Leu Gly Trp Gly His Phe Ser Thr Val Trp

                85                  90                  95

ctg tgc tgg gat atg cag ggg aaa aga ttt gtt gca atg aaa gtt gta      336

Leu Cys Trp Asp Met Gln Gly Lys Arg Phe Val Ala Met Lys Val Val

            100                 105                 110

aaa agt gcc cag cat tat acg gag aca gcc ttg gat gaa ata aaa ttg      384

Lys Ser Ala Gln His Tyr Thr Glu Thr Ala Leu Asp Glu Ile Lys Leu

        115                 120                 125

ctc aaa tgt gtt cga gaa agt gat ccc agt gac cca aac aaa gac atg      432

Leu Lys Cys Val Arg Glu Ser Asp Pro Ser Asp Pro Asn Lys Asp Met

    130                 135                 140

gtg gtc cag ctc att gac gac ttc aag att tca ggc atg aat ggg ata      480

Val Val Gln Leu Ile Asp Asp Phe Lys Ile Ser Gly Met Asn Gly Ile

145                 150                 155                 160

cat gtc tgc atg gtc ttc gaa gta ctt ggc cac cat ctc ctc aag tgg      528

His Val Cys Met Val Phe Glu Val Leu Gly His His Leu Leu Lys Trp

                165                 170                 175

atc atc aaa tcc aac tat caa ggc ctc cca gta cgt tgt gtg aag agt      576

Ile Ile Lys Ser Asn Tyr Gln Gly Leu Pro Val Arg Cys Val Lys Ser

            180                 185                 190

atc att cga cag gtc ctt caa ggg tta gat tac tta cac agt aag tgc      624

Ile Ile Arg Gln Val Leu Gln Gly Leu Asp Tyr Leu His Ser Lys Cys

        195                 200                 205

aag atc att cat act gac ata aag ccg gaa aat atc ttg atg tgt gtg      672

Lys Ile Ile His Thr Asp Ile Lys Pro Glu Asn Ile Leu Met Cys Val

    2l0                 215                 220

gat gat gca tat gtg aga aga atg gca gct gag cct gag tgg cag aaa      720

Asp Asp Ala Tyr Val Arg Arg Met Ala Ala Glu Pro Glu Trp Gln Lys

225                 230                 235                 240

gca ggt gct cct cct cct tca ggg tct gca gtg agt acg gct cca cag      768

Ala Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ala Val Ser Thr Ala Pro Gln

                245                 250                 255

cag aaa cct ata gga aaa ata tct aaa aac aaa aag aaa aaa ctg aaa      816

Gln Lys Pro Ile Gly Lys Ile Ser Lys Asn Lys Lys Lys Lys Leu Lys

            260                 265                 270

aag aaa cag aag agg cag gct gag tta ttg gag aag cgc ctg cag gag      864

Lys Lys Gln Lys Arg Gln Ala Glu Leu Leu Glu Lys Arg Leu Gln Glu

        275                 280                 285

ata gaa gaa ttg gag cga gaa gct gaa agg aaa ata ata gaa gaa aac      912

Ile Glu Glu Leu Glu Arg Glu Ala Glu Arg Lys Ile Ile Glu Glu Asn

    290                 295                 300

atc acc tca gct gca cct tcc aat gac cag gat ggc gaa tac tgc cca      960

Ile Thr Ser Ala Ala Pro Ser Asn Asp Gln Asp Gly Glu Tyr Cys Pro

305                 310                 315                 320

gag gtg aaa cta aaa aca aca gga tta gag gag gcg gct gag gca gag     1008

Glu Val Lys Leu Lys Thr Thr Gly Leu Glu Glu Ala Ala Glu Ala Glu

                325                 330                 335

act gca aag gac aat ggt gaa gct gag gac cag gaa gag aaa gaa gat     1056

Thr Ala Lys Asp Asn Gly Glu Ala Glu Asp Gln Glu Glu Lys Glu Asp

            340                 345                 350

gct gag aaa gaa aac att gaa aaa gat gaa gat gat gta gat cag gaa     1104

Ala Glu Lys Glu Asn Ile Glu Lys Asp Glu Asp Asp Val Asp Gln Glu

        355                 360                 365

ctt gcg aac ata gac cct acg tgg ata gaa tca cct aaa acc aat ggc     1152

Leu Ala Asn Ile Asp Pro Thr Trp Ile Glu Ser Pro Lys Thr Asn Gly

    370                 375                 380

cat att gag aat ggc cca ttc tca ctg gag cag caa ctg gac gat gaa     1200

His Ile Glu Asn Gly Pro Phe Ser Leu Glu Gln Gln Leu Asp Asp Glu

385                 390                 395                 400

gat gat gat gaa gaa gac tgc cca aat cct gag gaa tat aat ctt gat     1248

Asp Asp Asp Glu Glu Asp Cys Pro Asn Pro Glu Glu Tyr Asn Leu Asp

                405                 410                 415

gag cca aat gca gaa agt gat tac aca tat agc agc tcc tat gaa caa     1296

Glu Pro Asn Ala Glu Ser Asp Tyr Thr Tyr Ser Ser Ser Tyr Glu Gln

            420                 425                 430

ttc aat ggt gaa ttg cca aat gga cga cat aaa att ccc gag tca cag     1344

Phe Asn Gly Glu Leu Pro Asn Gly Arg His Lys Ile Pro Glu Ser Gln

        435                 440                 445

ttc cca gag ttt tcc acc tcg ttg ttc tct gga tcc tta gaa cct gtg     1392

Phe Pro Glu Phe Ser Thr Ser Leu Phe Ser Gly Ser Leu Glu Pro Val

    450                 455                 460

gcc tgc ggc tct gtg ctt tct gag gga tca cca ctt act gag caa gag     1440

Ala Cys Gly Ser Val Leu Ser Glu Gly Ser Pro Leu Thr Glu Gln Glu

465                 470                 475                 480

gag agc agt cca tcc cat gac aga agc aga acg gtt tca gcc tcc agt     1488

Glu Ser Ser Pro Ser His Asp Arg Ser Arg Thr Val Ser Ala Ser Ser

                485                 490                 495

act ggg gat ttg cca aaa gca aaa acc cgg gca gct gac ttg ttg gtg     1536

Thr Gly Asp Leu Pro Lys Ala Lys Thr Arg Ala Ala Asp Leu Leu Val

            500                 505                 510

aat ccc ctg gat ccg cgg aat cga gat aaa att aga gta aaa att gct     1584

Asn Pro Leu Asp Pro Arg Asn Arg Asp Lys Ile Arg Val Lys Ile Ala

        515                 520                 525

gac ctg gga aat gct tgt tgg gtg cat aaa cac ttc acg gaa gac atc     1632

Asp Leu Gly Asn Ala Cys Trp Val His Lys His Phe Thr Glu Asp Ile

    530                 535                 540

cag acg cgt cag tac cgc tcc ata gag gtt tta ata gga gcg ggg tac     1680

Gln Thr Arg Gln Tyr Arg Ser Ile Glu Val Leu Ile Gly Ala Gly Tyr

545                 550                 555                 560

agc acc cct gcg gac atc tgg agc acg gcg tgt atg gca ttt gag ctg     1728

Ser Thr Pro Ala Asp Ile Trp Ser Thr Ala Cys Met Ala Phe Glu Leu

                565                 570                 575

gca acg gga gat tat ttg ttt gaa cca cat tct ggg gaa gac tat tcc     1776

Ala Thr Gly Asp Tyr Leu Phe Glu Pro His Ser Gly Glu Asp Tyr Ser

            580                 585                 590

aga gac gaa gac cac ata gcc cac atc ata gag ctg cta ggc agt att     1824

Arg Asp Glu Asp His Ile Ala His Ile Ile Glu Leu Leu Gly Ser Ile

        595                 600                 605

cca agg cac ttt gct cta tct gga aaa tat tct cgg gaa ttc ttc aat     1872

Pro Arg His Phe Ala Leu Ser Gly Lys Tyr Ser Arg Glu Phe Phe Asn

    610                 615                 620

cgc aga gga gaa ctg cga cac atc acc aag ctg aag ccc tgg agc ctc     1920

Arg Arg Gly Glu Leu Arg His Ile Thr Lys Leu Lys Pro Trp Ser Leu

625                 630                 635                 640

ttt gat gta ctt gtg gaa aag tat ggc tgg ccc cat gaa gat gct gca     1968

Phe Asp Val Leu Val Glu Lys Tyr Gly Trp Pro His Glu Asp Ala Ala

                645                 650                 655

cag ttt aca gat ttc ctg atc ccg atg tta gaa atg gtt cca gaa aaa     2016

Gln Phe Thr Asp Phe Leu Ile Pro Met Leu Glu Met Val Pro Glu Lys

            660                 665                 670

cga gcc tca gct ggc gaa tgt cgg cat cct tgg ttg aat tct             2058

Arg Ala Ser Ala Gly Glu Cys Arg His Pro Trp Leu Asn Ser

        675                 680                 685

<210>4

<211>686

<212>PRT

<213>人

<400>4

Met Ser Val Asn Ser Glu Lys Ser Ser Ser Ser Glu Arg Pro Glu Pro

1               5                   10                  15

Gln Gln Lys Ala Pro Leu Val Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro

            20                  25                  30

Pro Pro Pro Pro Leu Pro Asp Pro Thr Pro Pro Glu Pro Glu Glu Glu

        35                  40                  45

Ile Leu Gly Ser Asp Asp Glu Glu Gln Glu Asp Pro Ala Asp Tyr Cys

    50                  55                  60

Lys Gly Gly Tyr His Pro Val Lys Ile Gly Asp Leu Phe Asn Gly Arg

65                  70                  75                  80

Tyr His Val Ile Arg Lys Leu Gly Trp Gly His Phe Ser Thr Val Trp

                85                  90                  95

Leu Cys Trp Asp Met Gln Gly Lys Arg Phe Val Ala Met Lys Val Val

            100                 105                 110

Lys Ser Ala Gln His Tyr Thr Glu Thr Ala Leu Asp Glu Ile Lys Leu

        115                 120                 125

Leu Lys Cys Val Arg Glu Ser Asp Pro Ser Asp Pro Asn Lys Asp Met

    130                 135                 140

Val Val Gln Leu Ile Asp Asp Phe Lys Ile Ser Gly Met Asn Gly Ile

145                 150                 155                 160

His Val Cys Met Val Phe Glu Val Leu Gly His His Leu Leu Lys Trp

                165                 170                 175

Ile Ile Lys Ser Asn Tyr Gln Gly Leu Pro Val Arg Cys Val Lys Ser

           180                 185                 190

Ile Ile Arg Gln Val Leu Gln Gly Leu Asp Tyr Leu His Ser Lys Cys

        195                 200                 205

Lys Ile Ile His Thr Asp Ile Lys Pro Glu Asn Ile Leu Met Cys Val

    2l0                 215                 220

Asp Asp Ala Tyr Val Arg Arg Met Ala Ala Glu Pro Glu Trp Gln Lys

225                 230                 235                 240

Ala Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ala Val Ser Thr Ala Pro Gln

                245                 250                 255

Gln Lys Pro Ile Gly Lys Ile Ser Lys Asn Lys Lys Lys Lys Leu Lys

            260                 265                 270

Lys Lys Gln Lys Arg Gln Ala Glu Leu Leu Glu Lys Arg Leu Gln Glu

         275                 280                 285

Ile Glu Glu Leu Glu Arg Glu Ala Glu Arg Lys Ile Ile Glu Glu Asn

    290                 295                 300

Ile Thr Ser Ala Ala Pro Ser Asn Asp Gln Asp Gly Glu Tyr Cys Pro

305                 310                 315                 320

Glu Val Lys Leu Lys Thr Thr Gly Leu Glu Glu Ala Ala Glu Ala Glu

                325                 330                 335

Thr Ala Lys Asp Asn Gly Glu Ala Glu Asp Gln Glu Glu Lys Glu Asp

            340                 345                 350

Ala Glu Lys Glu Asn Ile Glu Lys Asp Glu Asp Asp Val Asp Gln Glu

        355                 360                 365

Leu Ala Asn Ile Asp Pro Thr Trp Ile Glu Ser Pro Lys Thr Asn Gly

    370                 375                 380

His Ile Glu Asn Gly Pro Phe Ser Leu Glu Gln Gln Leu Asp Asp Glu

385                 390                 395                 400

Asp Asp Asp Glu Glu Asp Cys Pro Asn Pro Glu Glu Tyr Asn Leu Asp

                405                 410                 415

Glu Pro Asn Ala Glu Ser Asp Tyr Thr Tyr Ser Ser Ser Tyr Glu Gln

            420                 425                 430

Phe Asn Gly Glu Leu Pro Asn Gly Arg His Lys Ile Pro Glu Ser Gln

        435                 440                 445

Phe Pro Glu Phe Ser Thr Ser Leu Phe Ser Gly Ser Leu Glu Pro Val

    450                 455                 460

Ala Cys Gly Ser Val Leu Ser Glu Gly Ser Pro Leu Thr Glu Gln Glu

465                 470                 475                 480

Glu Ser Ser Pro Ser His Asp Arg Ser Arg Thr Val Ser Ala Ser Ser

                485                 490                 495

Thr Gly Asp Leu Pro Lys Ala Lys Thr Arg Ala Ala Asp Leu Leu Val

            500                 505                 510

Asn Pro Leu Asp Pro Arg Asn Arg Asp Lys Ile Arg Val Lys Ile Ala

        515                 520                 525

Asp Leu Gly Asn Ala Cys Trp Val His Lys His Phe Thr Glu Asp Ile

    530                 535                 540

Gln Thr Arg Gln Tyr Arg Ser Ile Glu Val Leu Ile Gly Ala Gly Tyr

545                 550                 555                 560

Ser Thr Pro Ala Asp Ile Trp Ser Thr Ala Cys Met Ala Phe Glu Leu

                565                 570                 575

Ala Thr Gly Asp Tyr Leu Phe Glu Pro His Ser Gly Glu Asp Tyr Ser

            580                 585                 590

Arg Asp Glu Asp His Ile Ala His Ile Ile Glu Leu Leu Gly Ser Ile

        595                 600                 605

Pro Arg His Phe Ala Leu Ser Gly Lys Tyr Ser Arg Glu Phe Phe Asn

    610                 615                 620

Arg Arg Gly Glu Leu Arg His Ile Thr Lys Leu Lys Pro Trp Ser Leu

625                 630                 635                 640

Phe Asp Val Leu Val Glu Lys Tyr Gly Trp Pro His Glu Asp Ala Ala

                645                 650                 655

Gln Phe Thr Asp Phe Leu Ile Pro Met Leu Glu Met Val Pro Glu Lys

            660                 665                 670

Arg Ala Ser Ala Gly Glu Cys Arg His Pro Trp Leu Asn Ser

        675                 680                 685

<210>5

<211>29

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>SRPK的底物肽

<400>5

Arg Ser Pro Ser Tyr Gly Arg Ser Arg Ser Arg Ser Arg Ser Arg Ser

1               5                   10                  15

Arg Ser Arg Ser Arg Ser Asn Ser Arg Ser Arg Ser Tyr

            20                  25