法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2012-10-24
授权
授权
2011-04-27
实质审查的生效 IPC(主分类):C12Q1/68 申请日:20100715
实质审查的生效
2011-01-12
公开
公开
技术领域
本发明涉及一种分子生物学中鉴定海参品种的方法，特别是涉及一种快速鉴定四种海参品种的多重PCR方法。
背景技术
海参为棘皮动物门(Echinodermata)海参纲(Holothrioider)动物的总称，全世界有海参约900多种，我国有约140多种。全世界约有40种海参可供食用。近年来，随着国内外运用现代科学技术对海参的生理与生化，海参生物活性物质的分离、鉴定及其生物医学作用等研究的不断深入，人们发现海参含有许多具有重要生物学活性和药理活性的物质，这也使得海参产品得到越来越多的关注。近几年国内市场上出现了各种各样的海参产品，巨大的商业利益催生了一些造假、掺假等不法行为，譬如伪造产地、以次充好等等。因此，急需建立一种快速有效的方法对海参产品进行鉴别和质量控制。
借助于物种的形态学特征、生理性状及生态地理分布状况是研究生物分类的主要手段，传统的海参鉴别主要依据海参的外部形态和解剖特征。由于市场上销售的海参产品均经过一系列加工处理，外部形态变化较大，利用外部形态特征很难准确识别海参种类。骨片是位于海参真皮表层的海参内骨骼，具有种间差异，是进行海参分类及鉴别的重要特征。廖玉麟等曾对我国的134种海参进行过形态学的分类，并对其骨片进行了详细的描述。可以以此作为海参分类鉴定的依据。但是，利用骨片进行鉴定需要对每只海参的骨片类型及其比例进行辨认和统计，鉴定过程工作量非常大，耗时也比较长，人为因素比较明显，不能作为一种快速准确的海参种类鉴定的方法。
线粒体DNA(mitochondrial DNA；mtDNA)用作分子标记的理论基础，有分子结构简单、严格的母系遗传、无重组、与核基因组无共同序列、进化速率快、多拷贝及分子钟理论等优点。因此用线粒体DNA技术进行种属鉴定的方法具有特异性好、可检测经加工后无法用形态学方法鉴定的样品等优点。已有报导采用聚合酶链式反应(PCR)对多种海参的线粒体细胞色素氧化酶亚基I(CO I)序列进行扩增。经过克隆、测序及序列在线比对，用于海参种类的鉴定。但是，这种PCR测序法成本比较高、所需时间也较长(5-7天)。海参的品种纷繁复杂，如果采用单纯的测序方法对大量的海参加工产品进行种类鉴定费时费力，成本也很高。
发明内容
本发明目的在于提供一种快速鉴定四种海参品种的多重PCR方法，它能克服现有技术的上述缺点，实现海参品种的快速鉴定。
一种快速鉴定四种海参品种的多重PCR方法，其特征在于先将干海参泡发；再对泡发的干海参进行DNA模板提取；然后对CO I基因的特异性片段进行多重PCR扩增；最后对多重PCR扩增产物进行电泳检测，得到202bp、301bp、261bp和358bp的目的条带，对应的海参分别是仿刺参、梅花参、加州拟刺参和冰岛参。
本发明的优点：1、多重PCR鉴定海参品种，克服了传统的形态学方法鉴定海参时存在的工作量大，耗时长等缺点。采用本发明方法，只需一次PCR反应和一次琼脂糖凝胶电泳，即能分辨出四种海参，具有节省时间、降低成本、提高效率等优点；2、具有较高的特异性和较好的灵敏度；3、具有较好的重现性。
附图说明
图1为多重PCR鉴定四种海参的特异性实验结果：M-DNA Marker(50bp)；1-冰岛参；2-梅花参；3-加州拟刺参；4-日本刺参；5-暗色刺参；6-玉足海参；7-辐肛参；8-墨西哥刺参；9-蛇目白尼参；10-水。
图2为多重PCR灵敏度测定：M-DNA Marker(50bp)；1-4为冰岛参模板DNA依次稀释10、100、1000和10000倍；5-8为梅花参模板DNA依次稀释10、100、1000和10000倍；9-12为加州拟刺参模板DNA依次稀释10、100、1000和10000倍；13-16为仿刺参模板DNA依次稀释10、100、1000和10000倍；17为水。检测结果证明多重PCR的灵敏度为ng级。
图3为多重PCR重复性实验：图A为冰岛参实验结果；图B为梅花参实验结果；图C为加州拟刺参实验结果；图D为仿刺参实验结果。1-10为10个不同的海参个体；Y为阴性对照；M：DNAMarker(50bp)。
具体实施方式
本发明快速鉴定四种海参品种的多重PCR方法，其特征在于先将干海参泡发；再对泡发的干海参进行DNA模板提取；然后对CO I基因的特异性片段进行多重PCR扩增；最后对多重PCR扩增产物进行电泳检测，得到202bp、301bp、261bp和358bp的目的条带，对应的海参分别是仿刺参、梅花参、加州拟刺参和冰岛参。
本发明所述的多重PCR扩增反应总体系为50μL，包括：水6.5μL；10×PCR Buffer 5μL；25mM MgCl2 2μL；10mM dNTP 1μL；AjapEF(10μmol/L)0.5μL；AjapER(10μmol/L)0.5μL；TnasEF(10μmol/L)0.5μL；TnasER(10μmol/L)0.5μL；PcalEF(10μmol/L)0.5μL；PcalER(10μmol/L)0.5μL；CfroEF(10μmol/L)0.5μL；CfroER(10μmol/L)0.5μL；模板DNA 1μL；Tap DNA聚合酶0.5μL；使用的特异性引物分别为：仿刺参(Apostichopus japonicus)引物为：AjapEF：5′-CTCCCTCCTTCATTCTTCTTCTTG-3’；AjapER：5′-TATCCC[T/C]GGAGTCCGCATTTTA-3’；梅花参(Thelenota ananas)引物为：TnasEF：5′-GGAACAGGATGACCATCTACCA-3’；TnasER：5′-CAGGGTCGAAGAAGGTTGTTTTT-3’；加州拟刺参(Parastichopuscalifornicus)引物为：PcalEF：5′-TGAACAATCTACCCTCCCCTCTCG-3’；PcalER：5′-GTCCTTAATAACATTGTTATTGCACCG-3’；冰岛参(Cucumaria frondosa)引物为：CfroEF：5′-AGTAGAAAAAGGGGCAGGAACC-3’；CfroER：5′-GCAGAATAGGTGTTGGAAGAGTATAGA-3’。
实施例
干海参品种的鉴定
(1)海参样品的预处理：干海参用自来水冲洗干净，55℃蒸馏水中泡发过夜；
(2)DNA模板的提取：①称取100mg海参肌肉柱，冲洗干净，用无菌纸吸干，切碎或置液氮研碎。然后加入400μL裂解液(50mM Tris-HCl pH 7.5；1.5％CTAB；1M NaCl；15mM EDTA)和12μL 20mg/mL蛋白酶K，置于55℃中5-8小时直至样品溶解。②将过夜的肌肉柱加入600μL氯仿，混合3min，静置7min，12000g离心2min。③取上清，加入500μL氯仿，颠倒混合2min，12000g离心2min。④取上清，加入500μL沉淀液(1％CTAB；50mMTris-HCl PH 7.5；10mM EDTA)混匀，静置2min。12000g离心10-20min，弃上清，留沉淀。⑤加入200μL 1.2M NaCl，轻轻混匀至DNA完全溶解，再加入6μL RNase，置于37℃下30-60min。⑥加入1mL冰乙醇和100μL 3M NaAc，冰上放置10min，中间混匀一次，15000g离心10min，所得沉淀即为DNA。⑦弃除上清，再加入1mL 70％冰乙醇清洗，12000g离心5min。⑧将DNA沉淀于无菌空气中晾干，加入20μL无菌水溶解沉淀，置于4℃备用。
(3)多重PCR扩增CO I基因的特异性片段，鉴定海参品种，具体步骤如下：反应体系：总体系50μL，包括：水6.5μL；10×PCR Buffer 5μL；25mM MgCl2 2μL；10mM dNTP 1μL；AjapEF(10μmol/L)0.5μL；AjapER(10μmol/L)0.5μL；TnasEF(10μmol/L)0.5μL；TnasER(10μmol/L)0.5μL；PcalEF(10μmol/L)0.5μL；PcalER(10μmol/L)0.5μL；CfroEF(10μmol/L)0.5μL；CfroER(10μmol/L)0.5μL；模板DNA 1μL；Tap DNA聚合酶0.5μL；特异性引物分别为：仿刺参(Apostichopus japonicus)引物为：AjapEF：5′-CTCCCTCCTTCATTCTTCTTCTTG-3’；AjapER：5′-TATCCC[T/C]GGAGTCCGCATTTTA-3’；梅花参(Thele-nota ananas)引物为：TnasEF：5′-GGAACAGGATGACCATCTACCA-3’；TnasER：5′-CAGGGTCGAAGAAGGTTGTTTTT-3’；加州拟刺参(Parastichopus californicus)引物为：PcalEF：5′-TGAACAATCTACCCTCCCCTCTCG-3’；PcalER：5′-GTCCTTAATAACATTGTTATTGCACCG-3’；冰岛参(Cucumaria frondosa)引物为：CfroEF：5′-AGTAGAAAAAGGGGCAGGAACC-3’；CfroER：5′-GCAGAATAGGTGTTGGAAGAGTATAGA-3’。PCR反应循环参数如下：94℃预变性5min；后经过25个循环，每个循环包括：94℃50sec，60℃1min，72℃45sec；最后72℃延伸10min；4℃保存。
(4)电泳检测鉴定：对多重PCR反应产物进行电泳检测。以1×TBE缓冲液配制2％(w/v)琼脂糖凝胶溶液，加热溶解，冷却至50-60℃，倒入胶槽中，待胶凝固后，移去梳子，将胶放入含1×TBE缓冲液的电泳槽中；再将5μL PCR产物与1μL加样缓冲液混匀，依次加入加样孔内；控制电压保持在100V电泳，当溴酚蓝条带泳动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳；取出琼脂糖凝胶，置于1μg/mL的溴化乙锭中浸泡10-15min，取出置于紫外凝胶成像系统中观察分析结果。电泳图中含有202bp、301bp、261bp和358bp的目的条带，对应的海参分别是仿刺参、梅花参、加州拟刺参和冰岛参。
本发明所涉及的海参购自于市场，经中国科学院海洋研究所廖玉麟教授采用形态学方法鉴定，确定其种类：仿刺参(Apostichopus japonicus)、梅花参(Thelenota ananas)、加州拟刺参(Parastichopus californicus)和冰岛参(Cucumaria frondosa)。
本发明所用主要试剂：TapDNA聚合酶、dNTP、50bp DNA Ladder(大连宝生物有限公司)，引物(上海生工生物工程技术服务有限公司)，琼脂糖(BBI)。
本发明所用主要仪器：Mastercycler personal PCR仪(Eppendorf AG，Germany)、天能数码凝胶成像仪(Tanon科技上海有限公司)、紫外反射投射仪(上海精科实业有限公司)、DYY-6B型稳压稳流电泳仪(北京市六一仪器厂)。
本发明根据四种海参线粒体CO I基因的特异性，设计合成了四对特异性引物，引物信息见表1。
表1特异性引物信息
多重PCR鉴定四种海参的特异性实验
对9种经形态学鉴定的海参个体进行PCR扩增，验证四对引物的特异性。PCR反应总体积为50μL，包含25mM MgCl2 2μL，10mM dNTP 1μL，8条引物各0.5μL(每条引物终浓度0.1μM)，Taq DNA聚合酶(宝生物工程有限公司)0.5μL，10×PCR Buffer 5μL以及模板DNA 1μL，水36.5μL。在PCR扩增仪上经94℃预变性5min后经过25个循环，每个循环包括：94℃50sec，60℃1min，72℃45sec，最后72℃延伸10min。PCR产物在2％的琼脂糖凝胶中电泳后，置于1μg/mL的溴化乙锭中浸泡10-15min，紫外光下观察并照相记录。实验结果如图1，结果表明，设计的4对特异性引物(AjapEF和AjapER，TnasEF和TnasER，CfroEF和CfroE，PcalEF和PcalER)能对目的海参扩增出相应长度的基因片段，而对其他海参无非特异性扩增，说明4对种特异性引物的特异性较好。
多重PCR鉴定四种海参的灵敏度实验
分别以4种海参提取的模板DNA为原液，梯度稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍后做为模板，进行多重PCR，反应体系如实施例2。实验结果如图2，结果表明，提取的DNA模板稀释100倍后多重PCR仍有清晰的条带，检测结果证明多重PCR的灵敏度为ng级。
多重PCR鉴定四种海参的重复性实验
每种海参随机选取10个个体，提取DNA作为模板，分别采用多重PCR扩增，反应体系如实施例2，验证多重PCR反应的重复性。实验结果如图3，结果表明：10个海参个体的扩增结果没明显区别，证明该发明的方法重复性较好。
机译： 快速鉴定巨细胞病毒的多重PCR方法
机译： 快速鉴定巨细胞病毒的多重PCR方法
机译： 水稻品种鉴别的多重实时PCR方法
