抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药剂和抗耐万古霉素肠球菌药剂

具体实施方式

第一实施方式

现在说明根据本发明的第一实施方式的抗MRSA药剂。

本实施方式的抗MRSA药剂含有作为活性成分的Oobagi提取物，该提取物用包括至少一种有机溶剂的提取溶剂从Oobagi提取而得。Oobagi也称为Macaranga tanarius(血桐)，是一种属于大戟科血桐属的雌雄异株的阔叶常绿树。血桐生长在例如东南亚，诸如冲绳(日本南部)、台湾、中国南部、马来半岛、菲律宾、马来西亚、印度尼西亚和泰国，以及澳大利亚北部。血桐相比其它树木明显生长迅速并且能在退化土地上生长。

血桐的所有器官和每种器官的组成部分都可以用作原材料，以便接受提取溶剂的萃取。提取用原材料可以是血桐的一种器官或其组成部分，或者可以是血桐的两种或多种器官或它们的组成部分的混合物。为了增强所得血桐提取物抗MRSA的活性，优选使用包括血桐的果实、种子、花、根、杆、茎尖、叶片、渗出物(诸如蜡)的原材料进行提取。由于所述茎尖包括茎的生长点和叶芽并且比叶片更软，因此，容易得到有效的提取程序。而且，中杆、根、叶占据完整血桐的比率比其它器官高。因此，使用血桐的叶片作为提取的原材料从获得原材料的容易度观点来说在工业上是有利的。

对提取用原材料进行提取操作时，原材料的状态是刚收获；或收获后被破碎、粉碎或研碎；或收获并干燥后被粉碎、破碎或研碎；或收获后被粉碎、破碎或研碎，然后干燥。为了有效地实施提取，优选地破碎提取用原材料。可以使用例如截断器、切碎机或轧碎机来进行提取用原材料的破碎。可以使用例如磨粉机、轧碎机或研磨机粉碎提取用原材料。可以使用例如叶片混砂机或研钵来研碎提取用原材料。

用于从提取用原材料中提取血桐提取物的提取溶剂可以是水和有机溶剂的溶剂混合物，或者可以是有机溶剂诸如低级醇、二甲基亚砜、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、己烷、甘油或丙二醇。可以使用的低级醇的例子包括甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇和丁醇。作为有机溶剂，可以仅使用一类溶剂，或者，可以使用多类溶剂的混合物。当使用水和有机溶剂的溶剂混合物作为提取溶剂时，该溶剂混合物中的有机溶剂的含量优选地是50体积％或更大、更优地80体积％或更大。当溶剂混合物中的有机溶剂的含量是50体积％或更大时，可以特别有效地提取血桐中含有的活性成分。所述有机溶剂优选地是低级醇、更优地是乙醇。

在该提取溶剂中，可以溶解有机盐、无机盐、缓冲液、乳化剂和糊精。

所述萃取通过将提取用原材料浸没在以上提取溶剂中达预定的时间来进行。在所述萃取中，根据需要，例如可以采取搅拌或加热或同时采用这两种手段，以便提高提取效率。而且，为了最大程度减少将不需要的杂质提取到提取溶剂中，在用提取溶剂提取之前，通过事先用水或热水提取并除去提取水来制备提取用原材料。包含在血桐中并且可能具有抗MRSA活性的成分是宁菲。所述宁菲是水不可溶的。通过使血桐与例如热水一起煮沸，有效地将除了宁菲以外的杂质转移到提取水中并由此除去这些杂质。

从提取用原材料中提取出的血桐提取物进行固液分离以便分离并除去提取用原材料的残渣。所述固液分离通过已知的方法诸如过滤或离心来进行。根据需要，可以浓缩固液分离后液体形式的血桐提取物。

根据需要，可以通过除去包含在液体形式的血桐提取物中的提取溶剂来获得固体形式的血桐提取物。从液体形式的血桐提取物中除去提取溶剂可以通过例如减压加热或低压冻干法来进行。

用包含至少一种有机溶剂的提取溶剂从血桐中提取出的血桐提取物含有选自以下的至少一种物质：宁菲-A(也称为5，7，3’，4’-四羟基-6-香叶基黄烷酮)、宁菲-B(也称为5，7，3’，4’-四羟基-2’-香叶基黄烷酮)和宁菲-C(也成为5，7，3’，4’-四羟基-6-(3”’，3”’-二甲烯丙基)-2’-香叶基黄烷酮)。血桐提取物的主要成分是选自宁菲-A、宁菲-B和宁菲-C(即宁菲类物质)的至少一种物质，并且，所述宁菲被认为具有抗MRSA活性。

血桐提取物还含有蜂胶A(propolin A)(也称为5，7，3’，4’-四羟基-2’-(7”-羟基-3”，7”-二甲基-2”-辛烯基)-黄烷酮)。而且，血桐提取物含有作为微量成分的例如5，7，3’，4’-四羟基-5’-香叶基黄烷酮(也成为异宁菲-B)、5，7，3’，4’-四羟基-5’-(7”-羟基-3”，7”-二甲基-2”-辛烯基)-黄烷酮、5，7，3’，4’-四羟基-6-(7”-羟基-3”，7”-二甲基-2”-辛烯基)-黄烷酮、5，7，4’-三羟基-3’-(7”-羟基-3”，7”-二甲基-2”-辛烯基)-黄烷酮和5，7，4’-三羟基-3’-香叶基黄烷酮。

在各种从血桐的组成部分中提取出的提取溶液中，从花、种子和果实(含有蜡)中提取出的提取溶液特别地含有高浓度的宁菲-A、B和C和异宁菲-B。

所述抗MRSA药剂可以含有除了血桐提取物以外的成分，只要不使所述抗MRSA活性受损。除了血桐提取物以外，可以包含在抗MRSA药剂中的成分的例子包括赋形剂、基料、乳化剂、稳定剂和调味剂。

所述抗MRSA药剂可以是液体形式的或固体形式的。所述抗MRSA药剂的剂型没有具体限制，可以是例如散剂、粉剂、颗粒、片剂、胶囊、丸剂或液体。

抗MRSA药剂可以用作例如药品、准药品和清洁剂。已知MRSA是造成医源性感染的致病菌，MRSA感染经常发生在具体地抵抗力下降的病人和老年人身上。因此，抗MRSA药剂优选地施用于例如医疗产品、医疗装置、医院的内部物资、医院的洁净室的进气口和排气口、和用于为老年人设置的便利设施的室内材料。在以上情况中，抗MRSA药剂可以被加入例如成型材料或涂料中。

抗MRSA药剂的使用希望以这样的方式进行，即可能成为MRSA感染源的位置处的宁菲-A、宁菲-B、宁菲-C的总浓度(即宁菲类的浓度)优选地是25ppm或更大。当所有宁菲的浓度是25ppm或更大时，能特别好地发挥对MRSA生长的抑制作用。

第一实施方式具有以下优点。

本实施方式的抗MRSA是含有作为活性成分的血桐提取物的新型抗MRSA药剂，可以用于预防由MRSA的生长导致的MRSA感染。

此外，由于血桐相比其它树木明显生长迅速并且能在退化土地上生长，所以培育不费太大精力。而且，由于所述血桐提取物源自植物，所以，它是非常安全的。因此，本实施方式的抗MRSA药剂在稳定供应原材料、生产率和安全性方面也是优良的。

第二实施方式

我们将聚焦与上述第一实施方式的抗MRSA药剂的不同之处来说明本发明的第二实施方式的抗VRE药剂。

与抗MRSA药剂类似，第二实施方式的抗VRE药剂含有作为活性成分的Oobagi提取物，该提取物用包括至少一种有机溶剂的提取溶剂从Oobagi提取而得。

所述抗VRE药剂可以含有除了血桐提取物以外的组分，只要不使所述抗VRE活性受损。除了血桐提取物以外，可以包含在抗VRE药剂中的成分的例子包括赋形剂、基料、乳化剂、稳定剂和调味剂。

所述抗VRE药剂可以是液体形式的或固体形式的。所述抗VRE药剂的剂型没有具体限制，可以是例如散剂、粉剂、颗粒、片剂、胶囊、丸剂或液体。

抗VRE药剂可以用作例如药品、准药品和清洁剂。像MRSA一样，已知VRE是造成医源性感染的致病菌，VRE感染经常发生在具体地抵抗力下降的病人和老年人身上。因此，抗VRE药剂优选地施用于例如医疗产品、医疗装置、医院的内部物资、医院的洁净室的进气口和排气口、和用于为老年人设置的便利设施的室内材料。在以上情况中，抗VRE药剂可以被加入例如成型材料或涂料中。

抗VRE药剂的使用希望以这样的方式进行，即可能成为VRE感染源的位置处的宁菲-A、宁菲-B、宁菲-C的总浓度(即宁菲类物质的浓度)优选地是8ppm或更大。当所有宁菲的浓度是8ppm或更大时，能特别好地发挥对VRE生长的抑制作用。

第二实施方式具有以下优点。

本实施方式的抗VRE是含有作为活性成分的血桐提取物的新型抗VRE药剂，可以用于预防由VRE的生长导致的VRE感染。

此外，由于血桐相比其它树木明显生长迅速并且能在退化土地上生长，所以培育不费太大精力。而且，由于所述血桐提取物源自植物，所以，它是非常安全的。因此，本实施方式的抗VRE药剂在稳定供应原材料、生产率和安全性方面也是优良的。

对上述实施方式可以作如下修改。

代替所述血桐提取物或除了该物质以外，以上实施方式的抗MRSA药剂和抗VRE药剂可以含有作为活性成分的选自宁菲-A、宁菲-B和宁菲-C的至少一种物质，所述各宁菲非来源于血桐提取物。非源自血桐提取物的宁菲-A、宁菲-B和宁菲-C可以通过例如化学合成来获得。

接下来，将参考实施例进一步具体地说明本发明。

实施例1

<血桐提取物的制备1>

融解冲绳收获的冰冻的血桐原叶，用剪刀将这些叶子切割成小片。将三十克切碎的原叶浸没在100mL由90份(以体积计)乙醇和10份(以体积计)水组成的溶剂混合物中，并且在室温下保持2周，随后过滤以便得到作为血桐提取溶液的滤液。将该血桐提取溶液冻干以制备血桐提取物，所述血桐提取物是包含在血桐提取溶液中的固体内容物的粉末。当根据图1中显示的色谱图计算时，该粉末形式的血桐提取物中的宁菲-A、宁菲-B和宁菲-C的总浓度(即宁菲类的浓度)是50质量％，所述色谱图通过在以下HPLC条件下分析血桐提取物而获得。

HPLC条件

系统：PDA-HPLC系统(岛津公司(Shimadzu Corp.))，LC10ADvp系列，UV：SPD-10Avp，PDA：SPD-M10Avp，

柱子：Luna C18(2×250mm)(岛津气液色谱(Shimadzu GLC))，

溶剂：A：水(5％乙酸)，B：乙腈(5％乙酸)

溶解条件：

0-20分钟

(梯度溶解：A∶B＝80∶20→A∶B＝30∶70)

20-50分钟

(梯度溶解：A∶B＝30∶70→A∶B＝0∶100)

50-60分钟(A∶B＝0∶100)

60-75分钟(A∶B＝80∶20)

流速：0.2mL/min

PDA检测：190-370nm UV

UV检测：UV 287nm

进样量：20μL

温度：40℃

<血桐提取物对MRSA的抗微生物活性测试>

使用铂环将MRSA细菌菌株-耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ATCC 33591菌株-接种到葡萄球菌属第110号琼脂平板培养基(由日本生物供应中心(Nippon Bio-Supply Center)生产)，随后在37℃培养48小时。

使用铂环采集通过培养增殖的所述MRSA菌株的一个菌落并将其溶解在1mL生理盐水中，用灭菌的PBS和米勒-辛顿液体培养基(Mueller-Hinton liquid medium)(由日本生物供应中心生产)稀释以制备用于接种的菌液，其细菌数是1×10⁴、1×10⁶和1×10⁸cfu/mL。

将上述“血桐提取物的制备1”中获得的血桐提取物用米勒-辛顿肉汤培养基(由Difco Laboratories公司生产)稀释以便制备血桐提取物的最终浓度分别为0.005质量％、0.01质量％、0.05质量％和0.2质量％的样品培养基。而且，使用米勒-辛顿肉汤培养基制备血桐提取物的最终浓度为0质量％的对照培养基。

向1mL的各培养基和对照培养基中接种10μL用于接种的菌液并使样品在37℃接受静置培养达20小时。随后，从各培养基中采集0.1mL培养品并将其涂抹于葡萄球菌属第110号琼脂平板培养基(由日本生物供应中心生产)。随后，在37℃培养各平板培养基上的菌株，时间48小时。测定培养后各平板培养基上是否出现菌落的结果显示在表1中。在表1的题为“敏感度”的一列中，“+”表示发现菌落，“-”表示未发现菌落。

表1

如表1中所示，发现当血桐提取物的浓度是0.005质量％或更高时，该值换算为宁菲的浓度为0.0025质量％(25ppm)或更高时，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的生长完全被抑制。

<血桐提取物对VRE的抗微生物活性测试>

将VRE细菌菌株-尿肠球菌NCTC12204菌株-接种于米勒-辛顿肉汤培养基(由Difco Laboratories公司生产)并在37℃培养18-20小时。随后，制备细菌数为1×10⁶cfu/mL的用于接种的菌液。

用乙醇稀释上述“血桐提取物的制备1”中获得的血桐提取物，以便制备一连串二倍稀释的样品液体。即，制备血桐提取物的浓度分别为10.0质量％(10.00×10⁴ppm)、5.0质量％(5.00×10⁴ppm)、2.50质量％(2.50×10⁴ppm)、1.25质量％(1.25×10⁴ppm)、0.625质量％(0.625×10⁴ppm)、0.313质量％(0.313×10⁴ppm)和0.0156质量％(0.0156×10⁴ppm)的样品液体。

向99质量％米勒-辛顿琼脂培养基(由Difco Laboratories公司生产)中加入1质量％各样品液体并彻底混合，所述米勒-辛顿培养基已经在50-60℃下保持温热。然后，将该混合物分散到皮氏培养皿中并使其固化。由此，制备血桐提取物浓度分布为1，000ppm、500ppm、250ppm、125ppm、62.5ppm、31.3ppm和15.6ppm的用于敏感性测试的平板培养基。

使用由树脂制成的接种环将用于接种的菌液在用于敏感性测试的各平板培养基上划成条纹。随后，在37℃培养各平板培养基上的菌株，时间为18-20小时。

培养后观察平板培养基的结果是，在血桐提取物的浓度为15.6ppm或更大的平板培养基中，VRE的生长被抑制。换句话说，血桐提取物抑制VRE的最小抑制浓度(MIC)是15.6ppm。如上所述，由于实施例1的血桐提取物含有50质量％宁菲，所以，从以上的结果推测，宁菲抑制VRE的最小抑制浓度是7.8ppm。

实施例2

<血桐提取物的制备2>

将30g切碎的血桐原叶浸没在95℃的水中达30分钟。过滤除去水，将剩下的叶子浸没在100％乙醇中3天，随后过滤以便获得作为血桐提取溶液的滤液。将该血桐提取溶液冻干以制备血桐提取物，所述血桐提取物是包含在血桐提取溶液中的固体内容物的粉末。当根据图2中显示的色谱图计算时，该粉末形式的血桐提取物中的宁菲-A、宁菲-B和宁菲-C的总浓度(即所有宁菲的浓度)是40质量％，所述色谱图通过在上述HPLC条件下分析血桐提取物而获得。

<血桐提取物对MRSA和VRE的抗微生物活性的测试>

如实施例1中实施抗微生物试验。关于实施例2中制备的血桐提取物，得到与实施例1中制备的血桐提取物类似的结果，这显示，实施例1和实施例2中制备的血桐提取物的抗微生物活性相类似。