检测结核病治疗效果的试剂盒

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、结核病特异性免疫分子标识用于结核病治疗效果监测

发明人发现一种新的可用于结核病治疗效果监测的免疫分子标识，用于指导结核病(特别是耐药结核病)的临床治疗。CD27在细胞免疫中发挥了非常重要的作用。在前期研究中，通过对结核病人和正常对照者的对比研究，发现结核抗原特异性CD4T细胞CD27表达减低与结核病治疗失败相关，有希望作为结核病治疗效果监测的免疫分子标识。

根据上述发现，我们设计了结核病治疗效果监测的方法，它包括获得外周血单个核白细胞，标记结核抗原特异性CD4T细胞，检测CD27在结核抗原特异性CD4T细胞上的表达等步骤。

我们制备了结核病治疗效果监测的试剂盒，方便实施上述的方法，该试剂盒为检测CD27在结核抗原特异性CD4T细胞上表达的试剂，即主要包括如下试剂：

1)荧光标记的抗人CD4抗体；

2)荧光标记的抗人CD154抗体；

3)荧光标记的抗人CD27抗体；

4)结核分枝杆菌抗原。

其中，结核分枝杆菌抗原为BCG(Bacillus Galmette Guérin)(卡介苗)。

利用上述结核病治疗效果监测的试剂盒检测了45例肺结核病人治疗效果，其中初治结核病人31例，治疗失败结核病人14例；同时设置正常对照33人。45例肺结核病人通过痰菌涂片抗酸染色或细菌培养、X线胸片、临床表现、对抗痨药物治疗的反应确诊。所有结核病人均采用标准的抗痨方案治疗。14例结核病人在按照标准的抗痨方案治疗后痰菌持续阳性或仍然有结核病变，确诊为治疗失败的结核病人。具体结核病治疗效果监测方法如下所述：

1)从结核病人及对照者抽取2ml外周血，肝素抗凝；

2)用Ficoll-Paque(GE Healthcare，USA)梯度离心法获得外周血单个核白细胞；

3)单个核白细胞悬浮于含10％(体积比)胎牛血清的RPMI 1640培养基(Invitrogen，USA)中，2×10⁶细胞/ml；

4)加入2.5×10⁴CFU/ml BCG刺激单个核白细胞，在37℃CO₂孵箱中培养16-20小时；在刺激的同时加入5μl荧光标记的抗人CD154抗体(Beckman Coulter，USA)，以及共刺激抗人CD28抗体和抗人CD49抗体(最终浓度均为1mg/ml)(BDBiosciences，USA)。该步骤的原理是标记结核抗原特异性T细胞。CD154在静止期CD4阳性T细胞表达很低，在抗原激活后表达显著上调，根据这一原理可以用于检测抗原特异性的T细胞。由于本检测方法采用了短时间抗原刺激T细胞，在刺激的同时加入抗CD28和CD49d共刺激抗体可以显著提高抗原特异性T细胞的阳性率。上述方法也可以改为用结核抗原负载的抗原提呈细胞直接刺激T细胞。

5)将步骤4得到的单个核白细胞用含3％(体积比)胎牛血清的无菌PBS(PBS-FBS)洗一次；

6)在每4×10⁵细胞中分别加入10μl荧光标记的抗人CD4抗体(BD Biosciences，USA)和10μl荧光标记的抗人CD27抗体(BD Biosciences，USA)，在冰上染色30分钟；

7)流式细胞术检测：以CD4、CD154双阳区设门，检测CD27在结核抗原特异性CD4T细胞上的表达，确定阳性与阴性的比例，记录结果。

与初治结核病人相比，治疗失败结核病人抗原特异性CD4T细胞CD27表达显著降低(P值分别为0.005)。Logistics回归显示，抗原特异性CD4T细胞CD27表达减低与治疗失败结核病相关(P值分别为0.005，OR值为25.375)。

该结果表明，结核抗原特异性CD4T细胞CD27表达降低与治疗失败相关，通过分析抗原特异性CD4T细胞CD27表达就可以确定结核病人的治疗效果，达到对结核病治疗效果监测的目的。在结核病人治疗时，按照上述方法检测其结核抗原特异性CD4T细胞中CD27阴性比例，超过60％时即可判断其治疗失败，在50-60％之间提示可能会出现治疗失败。出现治疗失败时需要调整治疗方案。

上述方法也表明，利用上述试剂盒进行结核病疗效鉴定，与现有的抗酸染色或结核菌培养相比，该检测具有快速简单的优点，只需要从病人采2ml血，2天就可以获得结核病治疗结果，敏感性高。该检测对结核病(特别是耐药结核病)的临床治疗具有指导作用。该方法在国内外尚未见报道。