一种芒属植物奇岗体胚组培快速繁殖方法

技术领域

  本发明涉及奇岗（Miscanthus giganteus）基于胚性愈伤的组培快繁技术领域，更具体涉及一种芒属植物奇岗体胚组培快速繁殖方法，它适用于以奇岗幼穗为外植体通过愈伤诱导途径获得幼苗，以及增殖、生根、驯化与移栽。

背景技术

 奇岗（Miscanthus×giganteus）是一个天然杂交种三倍体(3n=57)，可能是由荻(2n=78)和芒(2n=38)杂交而产生的。这个种在形态上更类似于荻，主要特征是小穗第1外稃无芒，秆直立。只是它的根状茎丛集性较强，为荻和芒之间的过渡类型。根据文献报道，奇岗原产地可能为日本，但迄今尚未发现其自然群落，在中国也未发现其自然分布。目前，在国内外许多研究机构都种有奇岗。它对生长条件的要求很低，为C₄植物，光合效率高，植株高大。秆的高度较为均一，类似于荻；秆的密度较大，类似于芒。所以在一定的生长条件下，奇岗往往可以获得更高的生物产量。依据现有的资料，在中欧地区奇岗的干物质产量可达20 t／hm²以上，在南欧地区可达30 t／hm²以上。这种植物为旱生植物，再生能力很强，栽培容易，每年可以只收不种，生产成本低。它的纤维含量达68％～70％，纤维品质好，强度大，灰分含量仅为3％，可以制造优质纸浆、板材等等。另外在工业污染废地和其它边际土地的改造过程中，也发挥着重要的作用。

 由于奇岗是三倍体植物，不能依靠种子繁殖，这在一定程度上限制了该种的新品种培育，所以利用无性繁殖即组培快繁技术得到植株以及在此基础上进行诱变育种、利用转基因技术进行遗传改良显得尤为重要。国内关于芒属植物的组培快繁技术，在20世纪90年代就有相关报道，他们分别采用了幼叶、下胚轴、幼根、幼穗作为外植体进行芒属植物的快繁技术，但其岀愈率和分化率都各不相同，以幼穗的繁殖效率最高，但其文章中并未明确指出得到的愈伤为胚性愈伤。奇岗的组培快繁体系在国外也有相关报道，但主要是利用诱导丛生芽进行快繁，其繁殖效率都不如本发明高，本发明得到了更加高效快速的体胚快繁体系，为快速繁殖奇岗种苗提供了技术支持，同时为诱变育种、转基因育种提供了基本的组培体系，促进了奇岗的遗传改良。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种芒属植物奇岗体胚组培快速繁殖方法，方法易行，操作简便，短时间内提高了奇岗的快繁效率和繁殖系数。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

本发明建立了基于胚性愈伤的奇岗组培快繁体系，增值率高（4-5倍），增值稳定，根系健壮，移栽成活率高，是适于商业扩繁奇岗的成熟技术。

一种芒属植物奇岗体胚组培快速繁殖方法，其步骤是：

A、幼穗选取：选取处于颍花原基形成期的幼穗，中轴也比较软，还没形成基本的分支。 

B、 初代诱导：将其剪成2-3厘米小段，先用75%（体积比）酒精消毒（30-35秒），然后用0.1%（质量比）氯化汞浸泡（3-5分钟），再用无菌水冲洗（3-5次），将其接种在幼穗的初代诱导培养基上。经过（30-35天）的初代诱导，获得胚性愈伤。培养条件为24-28℃，每天光照（14-16）小时（人工光源，下同），光强为2000LX。诱导初代培养基为以下培养基任选其一A：MS培养基附加6-苄基腺嘌呤6-BA1-2mg/L，2,4二氯苯氧乙酸2，4-D1-5mg/L，蔗糖30g/L, PhytagelR 3g/L或B：MS培养基附加6-苄基腺嘌呤6-BA1-2mg/L,2,4二氯苯氧乙酸2，4-D1 -4 mg/L，6水氯化镁MgCl₂·6H₂O800mg/L,蔗糖30g/L， PhytagelR 3g/L。采用这两种培养基中的任何一种培养基都能诱导出状态良好的胚性愈伤组织，生长9-11天在幼穗基部开始岀愈，愈伤状态良好，为白色或淡黄色松散愈伤。 

C、       生苗继代培养：所获得的胚性愈伤在继代培养基上继代生苗，（25-30天）继代一次，增殖系数为5-6倍。培养条件为24-28℃，每天光照（14-16）小时，光强为2000LX。生苗培养基配方为以下配方选其一：A：MS培养基附加6-苄基腺嘌呤6-BA1-5mg/L，2,4二氯苯氧乙酸2，4-D0.1-0.3mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7g/L或B：MS培养基附加6-苄基腺嘌呤6-BA1-2mg/L，2,4二氯苯氧乙酸2，4-D0.1-0.3mg/L， 6水氯化镁MgCl₂·6H₂O800mg/L，蔗糖30g/L， PhytagelR 3g/L。将胚性愈伤转到其中任何一种生苗培养基之后2-4天，愈伤开始转绿，6-8天开始分化出芽，9-11天即可形成小幼苗。

D、生根诱导：所生幼苗在生根诱导培养基上诱导生根，培养（25-30天），生根率达70%以上。培养条件为24-28℃，每天光照（14-16）小时，光强为2000LX。生根诱导培养基为以下配方选其一：A：1/2 MS培养基附加6-苄基腺嘌呤6-BA2-3mg/L，2,4二氯苯氧乙酸2，4-D0.1-0.5mg/L，蔗糖30g/L，PhytagelR 3g/L或B：MS培养基附加6-苄基腺嘌呤6-BA2-3mg/L，2,4二氯苯氧乙酸2，4-D0.1-0.3mg/L，蔗糖30g/L， PhytagelR3g/L。将长到10-15厘米的幼苗转到任意一种生根培养基上，大概4-6天幼苗就会分化出大量白色或黄色的根，且根系发达。

E、 驯化移栽：在温室内，将生长健壮的、株高在10-15厘米的组培苗移栽到装有由蛭石和泥土的花盆中，其蛭石和泥土的体积比为2：3，进行驯化。每天定期给幼苗喷施驯化培养液和清水，大约15－20天后，视幼苗长势，即可移栽到苗圃中。温室条件为15℃-25℃，照明使用卤光，光照（14-16）小时，光照强度为2000LX。移栽到苗圃后，幼苗长势良好，生长健壮，根系发达，存活率较高，完成了无菌苗的驯化移栽。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

第一，   本发明消毒方法简单，且效率高，初代污染率几乎为零。

第二，   本发明得到的愈伤繁殖率高，约为10倍。

第三，   本发明一次得到了组培快繁和转基因组培体系，为后续转基因工作打下基础。

附图说明

图1为一种奇岗体胚愈伤示意图。

此图为奇岗以幼穗为外植体诱导出的愈伤，从图中可以看到，愈伤组织呈淡黄色或白色，结构松散。

图2为一种奇岗幼苗示意图。

此图为愈伤转入分化培养基上幼苗的生长图，图中可见幼苗长势较好，生命力强，并有根长出。

图3为一种奇岗驯化移栽示意图。

此图为幼苗移栽到加有营养液的蛭石中。

具体实施方式

实施例1： 

一种芒属植物奇岗体胚组培快速繁殖方法，其步骤是：

1、  幼穗选取：选取处于颍花原基形成期的幼穗，中轴也比较软，还没形成基本的分支。 

2、初代诱导：将其剪成3厘米小段，先用75%酒精消毒30秒，然后用0.1%氯化汞浸泡3分钟，再用无菌水冲洗三次，将其接种在幼穗的初代诱导培养基上。经过30天的初代诱导，获得胚性愈伤。培养条件为25℃，每天光照16个小时，光强为2000LX。诱导初代培养基为：A：MS培养基附加6-苄基腺嘌呤6-BA1-2mg/L，2,4二氯苯氧乙酸2，4-D1-5mg/L，蔗糖30g/L, PhytagelR 3g/L。生长9天在幼穗基部开始岀愈，愈伤状态良好，为白色或淡黄色松散愈伤。

3、生苗继代培养：所获得的胚性愈伤在继代培养基上继代生苗，30天继代一次，增殖系数为5-6。培养条件为 25℃，每天光照16个小时，光强为2000LX。生苗培养基配方为：A：MS培养基附加6-苄基腺嘌呤6-BA1-5mg/L，2,4二氯苯氧乙酸2，4-D0.1-0.3mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7g/L。将胚性愈伤转到其中任何一种生苗培养基之后3天，愈伤开始转绿，7天开始分化出芽，10天即可形成小幼苗。

4、  生根诱导：所生幼苗在在生根诱导培养基上诱导生根，培养25天，生根率达70%以上。培养条件为25℃，每天光照16个小时，光强为2000LX。生根诱导培养基为：A：1/2 MS培养基附加6-苄基腺嘌呤6-BA2-3mg/L，2,4二氯苯氧乙酸2，4-D0.1-0.5mg/L，蔗糖30g/L，PhytagelR 3g/L。将长到15厘米的幼苗转到生根培养基上，大概5天左右幼苗就会分化出大量白色或黄色的根，且根系发达。

驯化移栽：在温室内，将生长健壮的、株高在5-6厘米的组培苗移栽到由蛭石组成的驯化苗圃中驯化。每天定期给幼苗喷施驯化培养液和清水，大约15天后，视幼苗长势，即可移栽到苗圃中。温室条件20℃，照明使用卤光，光照16小时，光照强度为2000LX。