法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2017-02-01
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):G01N27/48 授权公告日:20130717 终止日期:20151209 申请日:20101209
专利权的终止
2013-07-17
授权
授权
2011-07-13
实质审查的生效 IPC(主分类):G01N27/48 申请日:20101209
实质审查的生效
2011-05-25
公开
公开
技术领域
本发明涉及微纳传感器、电化学生物传感器技术领域，具体地说是一种基于硅纳米线的生物传感器制备方法及该传感器在DNA检测中的应用。
背景技术
随着人类基因组计划的实施，为基因疾病的诊治提供了科学依据，使得基因检测在分子生物学和生物医学的研究中尤为重要。近年来，生物科技迅猛发展，许多生物新技术应运而生，为开发高灵敏、高特异性的基因检测方法注入了新的活力，其中利用DNA双链的碱基互补配对原则发展起来的各种DNA生物传感技术，受到了众多研究者的高度重视。
DNA生物传感器，以DNA分子作为敏感元件，与荧光技术、石英晶体微天平技术、表面等离子体共振技术、电化学技术等检测技术相结合，可以制成多种用于DNA快速测定的传感器。尽管各类DNA传感器已经取得了长足的发展，得到世人的瞩目，但仍然存在着许多难以解决的问题,例如技术成本和检测设备昂贵、制作复杂、检测灵敏度较低、重复性差、分析范围较狭窄等问题。而这些问题主要表现在样品的制备、探针合成与固定、分子的标记、数据的读取与分析等几个方面。信号的获取与分析上，当前多数方法使用荧光法进行检测和分析，重复性较好，但检测灵敏度仍然不高。因此，探索成本更低廉、制作更简单、检测更便捷灵敏的检测分析方法是广大科研人员的当务之急。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于硅纳米线的生物传感器制备方法及该传感器在检测DNA中的应用，以解决和改善现有技术的不足，为未来DNA电化学生物传感器的制作提供一种新的、适用于大规模生产、且成本低廉的可行方案。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现。
一种基于硅纳米线的生物传感器制备方法，包括以下具体步骤：
a）硅纳米线的制备
用H2SO4:H2O2=1:1溶液清洗硅片，再用去离子水将其冲洗干净；配制70毫摩尔/升的AgNO3溶液，超声振动15～20分钟，再配制浓度为20%的HF 溶液；两种溶液按体积比1:1混合，将洗净的硅片投入到上述混合溶液中进行反应，反应时间为50～60分钟；然后用HNO3溶液和去离子水将该硅片清洗干净，烘干后得到刻有硅纳米线的硅片；
b）金纳米粒子的制备
配制0.001摩尔/升的氯金酸溶液；同时，配制38.8毫摩尔/升的柠檬酸钠溶液；然后将配制好的氯金酸溶液加热至沸腾，再将柠檬酸钠溶液加至其中，氯金酸溶液与柠檬酸钠溶液体积比为10:1，使混合溶液静置反应10～15分钟，冷却后溶液的颜色由黄色变成深红棕色，即反应结束，得到粒径8～10纳米的金纳米粒子水溶液；
c）用金纳米粒子修饰硅纳米线
将步骤a制备的硅片分别用乙醇和去离子水冲洗干净；然后投入到加有硅烷偶联剂3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)的乙醇溶液中, 硅烷偶联剂与乙醇的体积比为1:1000，将加有APTMS的乙醇溶液加热至沸腾，时间40～45分钟；取出硅片，先用乙醇冲洗掉多余的APTMS，再用去离子水洗掉乙醇；再将该硅片放入金纳米粒子溶液中浸泡12小时；取出，用去离子水冲洗，放入100℃的干燥箱中烘干；最后用导电银浆和环氧树脂将导线连接于硅片上，制得基于硅纳米线的生物传感器。
所述生物传感器在DNA检测中的应用，是将单链探针DNA序列嫁接到该传感器上；然后将该传感器放入未知序列的DNA靶溶液中，通过电化学工作站，用循环伏安法进行扫描检测。
DNA电化学生物传感器是一门新兴的涉及生物、化学、电化学、医学及电子学等领域的交叉学科。本发明所制备的生物传感器是基于金纳米粒子修饰的硅纳米线，硅纳米线具有较高的比表面积，加上金纳米粒子优异的导电性能及生物兼容性，这两者的完美结合，能够提供一种全新的DNA检测技术，具有简单、可靠、价廉、灵敏和选择性好等优点，将在临床基因诊断、抗癌药物的筛选等方面具有广阔的应用前景。
附图说明
图1 为本发明流程图；
图2 为本发明硅纳米线剖面图；
图3 为本发明金纳米粒子修饰的硅纳米线表面EDS图；
图4 为本发明传感器探测电极在缓冲液中的循环伏安图；
图5 为本发明传感器探测电极在待测靶溶液中的循环伏安图；
图6 为本发明传感器探测电极在电压为-1.1V处时，靶溶液浓度与还原电流关系图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例进一步阐述本发明的技术特点。
实施例
通过对一个0.5×0.5平方厘米的硅片设计、制作并测试的描述来进一步阐述本发明。
A、所述生物传感器的制备
1）硅纳米线的制备
硅纳米线由化学刻蚀法制得；首先用H2SO4:H2O2=1:1溶液清洗硅片，清洗时间为10分钟，再用去离子水将其冲洗干净；配制70毫摩尔/升的AgNO3溶液20毫升，超声振动20分钟，再配制浓度为20%的HF 溶液20毫升；将洗净的硅片投入到上述AgNO3和HF的混合溶液中进行反应，反应时间为60分钟；最后分别用HNO3溶液和去离子水将该刻有硅纳米线的硅片清洗干净，烘干待用；所制得的硅纳米线如图2所示。
2）金纳米粒子的制备
金纳米粒子由柠檬酸钠还原氯金酸法制备；首先，配制300毫升的0.001摩尔/升的氯金酸溶液；同时，配制30毫升的38.8毫摩尔/升的柠檬酸钠溶液；然后将已配制好的氯金酸溶液加热至沸腾，再将柠檬酸钠溶液加至其中，使混合溶液静置反应10分钟，冷却后可以看到溶液的颜色由黄色变成深红棕色，即反应结束，得到粒径约为10纳米的金纳米粒子。
3）用金纳米粒子修饰硅纳米线
用硅烷偶联剂APTMS，通过化学键，将金纳米粒子自组装到硅纳米线上。首先，将制备完毕的硅纳米线分别用乙醇和去离子水冲洗干净；然后投入到加有APTMS的乙醇溶液中加热至沸腾，共45分钟；取出样品，先用乙醇冲洗掉多余的APTMS，再用去离子水洗掉乙醇；再将该样品放入金纳米粒子溶液中浸泡12小时；取出，用去离子水冲洗，放入100℃的干燥箱中烘干待用；最后用导电银浆和环氧树脂将导线连接于样品上，传感器制备完毕。图3为金纳米粒子修饰的硅纳米线EDS图，由图可知，含金量为7.4%，即金纳米粒子被成功嫁接于硅纳米线上。
B、所述传感器在DNA检测中的应用，具体步骤如下：
1）单链探针DNA的嫁接
选取了以下DNA片段作为例：
探针DNA序列：5’-TTTTTTTTTTTCTCGGAATTCGTTGGTGGG-3’
匹配的目标DNA序列：5’-TTTTTTTTTTCCCACCAACGAATTCCGAGA-3’
非匹配的目标DNA序列：5’- TTTTTTTTTTAGGAATGTGCTTCTCACGTA-3’
首先将浓度为2微摩尔/升的单链探针DNA（Capture DNA）嫁接到已制得的生物传感器上-即由金纳米粒子修饰的硅纳米线电极上，嫁接时间为3小时；利用带巯基的DNA探针分子与金纳米颗粒之间形成Au-S键，可使DNA分子自组装至电极表面。嫁接结束，用去离子水冲洗掉多余的单链探针DNA溶液，再用N2将电极吹干。
2）杂交反应
将固定有单链探针DNA的传感器置于待测靶溶液中，靶溶液是一端经金纳米粒子修饰的目标DNA序列，修饰目的是为了增强检测信号。单股探针DNA与靶序列进行识别反应．如果匹配，则杂交形成双链DNA。这一反应过程，将由电化学工作站实时且完整地记录下来。通过循环伏安法的测试数据，能够分析得知目标DNA序列是否与探针DNA序列匹配，如果匹配，则可以通过已知探针DNA碱基序列，推得未知的目标DNA上的碱基序列。
3）测试
通过电化学工作站LK3200A (天津，中国)，用循环伏安法（CV法）对未知序列的DNA靶溶液进行扫描，对本发明所制备的DNA生物传感器探测结果进行分析测试。
ⅰ、缓冲液测试
为了判断缓冲液是否会对本发明中的传感器进行干扰，第一步先进行传感器在缓冲液中的CV测试。由图4可知，CV曲线虽然呈现一对氧化还原峰，但峰值很小，峰很宽，可逆性差，可以判断背底缓冲液对该传感器的探测干扰不大，可以继续测试。
ⅱ、DNA探测
将传感器置于1纳摩尔/升的匹配的靶溶液（tDNA）中，进行循环伏安法测试。由图5(a)曲线可知，CV曲线呈现一对氧化还原峰，峰较尖锐，且峰值很大，在-1.1V的还原电位处，电流可达700微安。而传感器置于1纳摩尔/升的非匹配的靶溶液（tDNA）中，测得的CV曲线（如图5(b)曲线），没有明显的氧化还原峰，即未发生杂交反应。由此对比可得，该传感器能够成功地区分匹配和非匹配tDNA。
根据不同浓度下（10纳摩尔/升至1皮摩尔/升）的探测结果，总结得到如图6所示的在-1.1V的还原电位处的电流值曲线。（a）曲线为匹配 tDNA测量结果，该曲线基本成线性，拟合曲线为Y=2534+212X，Y为电流值，X为tDNA浓度值的对数。而（b）曲线为非匹配tDNA测试结果，该曲线基本在0附近。由此可得，本发明中所制作的DNA生物传感器可成功应用于DNA检测。
本发明具有以下用途和优点：
用途：所制备的生物传感器，可在临床医学检验、遗传工程、药物作用机理、新药筛选、环境监测和食品工程等领域得到广泛地研究与应用。
优点：①通过简单的微加工工艺能够进行大批量生产，成本低且与大规模集成电路工艺相兼容。
②制得的生物传感器，巧妙地利用了硅纳米线、金纳米粒子和DNA相互之间的特异性和生物相容性，想法新颖，易于实现，具有广泛的适用性。
③制备方法简便、重现性好、灵敏度高，易于实现微型化并且能够实现实时监测。
机译： 本发明提供了一种具有抗蠕虫病作用的药物制剂的制备方法及其在制剂中的应用。一种抗动物性线虫病的方法，以及一种适于实际应用的化合物的制备方法。
机译： 本发明提供了一种具有抗蠕虫病作用的药物制剂的制备方法及其在制剂中的应用。一种抗动物性线虫病的方法，以及一种适于实际应用的化合物的制备方法。
机译： 基于铈氧化物，铈，铈中至少一种稀土金属和硅的组成，制备方法及在催化中的应用
