一种豇豆花叶病毒属和蚕豆病毒属病毒通用RT-PCR检测用简并引物、检测方法及其应用

具体实施方式

下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

1、引物设计和合成

根据豇豆花叶病毒属和蚕豆病毒属中RaMV、SqMV、RCMV、CPMV、CPSMV、BPMV、BBWV1病毒的RNA1基因组序列设计引物，引物序列为：

SEQ ID No.1：5′- TGYGAYTAYDVHWSWTTYGATGG -3′；

SEQ ID No.2：5′- AKYARRTTRTCATCHCCATA -3′。

2、总RNA的提取

1）取0.1 g病叶，加入1 ml的TRIzol试剂（美国Invitrogen公司），移入灭菌的1.5 m L离心管中，室温下保持5 min；

2）加0.2 mL氯仿，剧烈振荡15 s，然后在室温下保持2-15 min后，4℃，12000 g离心15 min；

3）将上层水相转移到新的1.5 m L离心管中，加0.5 m L异丙醇，颠倒混匀，室温下保持15 min；

4）4 ℃，12000 g离心10 min，RNA就会在管的侧壁和底部形成沉淀；

5）倒掉上清液，加入75%的乙醇洗涤沉淀，然后4 ℃，7500 g离心5 min（如沉淀悬浮起来，则用12000 g离心），弃去乙醇；

6）沉淀于室温下充分干燥后，溶于40 μL 无核酸酶的水中，-20℃保存备用。

3、RT-PCR扩增方法的建立

以步骤2中备用的总RNA为模板，进行RT-PCR反应。20 μL反应体系进行反转录反应，即在0.2 mL的反应管中加入8.75 μL无核酸酶的水，4 μL 总RNA，1 μL 的oligo ( d T)₁₅引物（10 μmol/L）（宝生物工程（大连）有限公司），1 μL dNTP混合物（具体为dATP、dGTP、dTTP和dCTP四种混合物）（10 mmol/L）（宝生物工程（大连）有限公司），混匀后于65 ℃ 保持5 min，迅速转移到冰上骤冷5min；然后向反应管中加入，4 μL 5×反转录缓冲液（美国普洛麦格公司），1 μL RNA酶抑制剂（40 U/μL）（宝生物工程（大连）有限公司），0.25 μL AMV反转录酶（200 U/μL）（美国普洛麦格公司），42℃反应50 min；72 ℃ 15 min灭活反转录酶后获得反转录产物cDNA。

PCR反应体系为25 μL，即在0.2 mL的PCR反应管中加入13.25 μL 无核酸酶的水，3 μL cDNA，2 μL 正向引物SEQ ID No.1（10 μmol/L）、2 μL 反向引物SEQ ID No.2（10 μmol/L），10×PCR缓冲液2.5 μL（宝生物工程（大连）有限公司），2μL dNTP（2.5 mmol/L）（宝生物工程（大连）有限公司），0.25 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL）（宝生物工程（大连）有限公司）。反应条件为：95℃预变性3 min；94℃变性50 s、42℃退火50 s、72℃延伸50 s，5个循环；接着94℃变性50 s、52℃退火50 s、72℃延伸50 s，30个循环；最后72℃延伸7 min。在PCR仪上完成。

PCR反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据是否扩增到326~343 bp的DNA片段判定样品中是否含有豇豆花叶病毒属和蚕豆病毒属病毒。本实施例检测方法能够快速准确地判断样品是否有豇豆花叶病毒属和蚕豆病毒属病毒，根据序列进行种类鉴定，为进出口安全提供了保证。豇豆花叶病毒属和蚕豆病毒属病毒RT-PCR检测用简并引物进一步可做成豇豆花叶病毒属和蚕豆病毒属病毒通用RT-PCR检测试剂盒。

实施例2

豇豆花叶病毒属和蚕豆病毒属通用 RT-PCR方法的通用性检测

取豇豆花叶病毒（CPMV）、豇豆重花叶病毒（CPSMV）、菜豆荚斑驳病毒（BPMV）、萝卜花叶病毒（RaMV）、红三叶草斑驳病毒（RCMV）、南瓜花叶病毒（SqMV）、蚕豆萎蔫病毒1号（BBWV1）等7种病毒9个分离物的病叶及健康蚕豆叶片，按实施例1方法分别提取总RNA，再进行RT-PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测结果。结果病症叶片中均检出约350 bp的DNA片段。检测结果如图1所示。表明建立的通用RT-PCR方法可用于这两个病毒属中不同病毒种类的检测，具有良好的通用性，可用于豇豆花叶病毒属和蚕豆病毒属病毒的通用检测。

实施例3

豇豆花叶病毒属和蚕豆病毒属通用 RT-PCR方法的的特异性检测取同属于豇豆花叶病毒亚科的线虫传多面体病毒属病毒（分别为ArMV、TRSV、ToRSV、TBRV、PRMV、CLRV、RpRSV）病叶，按实施例1方法分别提取总RNA、进行RT-PCR扩增，进行特异性检测。检测结果如图2所示。表明建立的通用RT-PCR方法并不会与同一个病毒属的病毒产生交叉反应，具有良好的特异性，符合检测的要求。

序   列   表

<110>  厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120>  豇豆花叶病毒属和蚕豆病毒属病毒通用RT-PCR检测用简并引物

<130>  

<160>  2     

<170>  PatentIn version ？

<210>  1

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  1

TGYGAYTAYD VHWSWTTYGA TGG                                                     23

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  2

AKYARRTTRT CATCHCCATA                                                20