公开/公告号CN102161981A
专利类型发明专利
公开/公告日2011-08-24
原文格式PDF
申请/专利权人 中国人民解放军总医院第一附属医院;
申请/专利号CN201010127972.9
申请日2010-02-23
分类号C12N5/0775(20100101);C12N5/071(20100101);
代理机构
代理人
地址 100048 北京市海淀区阜成路51号
入库时间 2023-12-18 03:08:57
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2017-04-05
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12N5/0775 授权公告日:20130102 终止日期:20160223 申请日:20100223
专利权的终止
2013-01-02
授权
授权
2011-11-02
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N5/0775 申请日:20100223
实质审查的生效
2011-08-24
公开
公开
技术领域
本发明涉及人汗腺再生研究领域。具体说来，本发明涉及一种重组蛋白联合诱导骨髓间充质干细胞转分化获得汗腺细胞的非转基因方法。
背景技术
皮肤被覆于身体表面，是人体最大的器官。排汗功能是其众多功能之一，可排出机体25％的热量以保持体温的相对恒定。轻度烧伤时汗腺细胞可以其深部未受创的部分为模板而完全修复，但全层大面积烧伤患者因汗腺被毁或被瘢痕组织堵隔而丧失了分泌汗液的功能，这不仅给患者的生理与心理带来严重障碍，而且对其后期的生活与工作质量将产生严重影响。因此，研究皮肤损伤后汗腺组织的修复与再生，不仅是创(烧、战)伤治疗本身的需要，而且也是重塑人体生理与心理的需要，值得人们关注。
近年来，随着干细胞生物学与再生医学研究的深入，利用成体干细胞及其可塑性为皮肤附属器的再生带来了新的希望。就采用成体干细胞再生皮肤汗腺的策略而言，有以下几个方面可以考虑：一是利用自身皮肤表皮干细胞直接诱导分化为汗腺细胞来再生汗腺。但问题的关键是在大面积严重创伤烧伤时由于皮肤的损毁，自体表皮干细胞的来源缺乏，因而从诱导残存的表皮干细胞来直接再生汗腺的技术和方法将来在临床应用会受到很大的限制。二是脂肪干细胞在一定条件下经诱导也具有分化为表皮细胞，进而再经诱导分化形成汗腺细胞的潜能。但由于这一条技术路线难度比较大，影响因素众多，加之在大面积严重创伤烧伤时脂肪组织和皮肤组织一样会受到严重的破坏，因而利用脂肪干细胞来重建汗腺也是一条艰难的途径。为此，利用BM-MSCs来再生汗腺便成为一条重要的选择。这条路线的主要优点包括：一是BM-MSCs本身具有低免疫源性和多向分化潜能；二是BM-MSCs存在于骨髓基质，在大面积创伤、烧伤时受到外界的直接破坏作用比较小；三是储存量比较大，在严重创伤和烧伤条件下能够发生动员，容易获取。基于以上原因，深入开展BM-MSCs的分化调控研究对皮肤汗腺再生策略具有重要的理论意义和应用价值。
我们和他人大量的前期研究已经初步证明BM-MSCs直接参与了皮肤损伤修复与再生的全过程，其中包括：皮肤组织损伤后，造血干细胞和间充质干细胞从骨髓动员到循环细胞池，并迁移到损伤部位。在早期炎症阶段，这些细胞调节上皮细胞和真皮间充质细胞的增殖和迁移，促进炎症细胞趋化，参与创伤修复过程；炎症消退后，骨髓来源的细胞可以分化为表皮细胞、皮脂腺细胞、毛囊上皮细胞、树突状细胞以及内皮祖细胞等，并且可整合到愈合的皮肤，分化为CD45+的抗原呈递纤维母细胞亚群；上皮化完成后，造血干细胞和BM-MSCs都能长期重构愈合的真皮，产生I和III型胶原。在此基础上，我们实验室又进一步开展了BM-MSCs向汗腺细胞诱导分化的研究，并在以下几方面获得了突破：1)通过BM-MSCs与热休克汗腺直接共培养技术，已成功将BM-MSCs诱导成为汗腺细胞或汗腺细胞样细胞，即经直接共培养诱导来的汗腺细胞具有正常汗腺细胞的形态、表型和功能特性；2)初步阐明在BM-MSCs转分化为汗腺细胞的过程中涉及的信号通路主要有EDA/EDAR、NF-κB和ERK的激活；3)将上述诱导来的汗腺细胞样细胞移植于裸鼠创面后，能显著促进受损汗腺的修复与再生，即创面愈合后能正常发汗，组织形态学观察证实创伤处有汗腺组织的再生；4)进一步的人体种植试验表明，在切除瘢痕的创面种植经诱导后具有汗腺细胞表型的自体BM-MSCs，不仅可以使这些移植的细胞存活，而且这些细胞还能转变为汗腺组织并发挥排汗功能。形态学观察显示创部真皮浅层有大量CEA阳性细胞，结构类似正常汗腺组织。同时功能学检测也表明再生的汗腺组织所分泌的汗液具有与正常汗液类似的pH值、渗透压和化学组分。上述初步的实验结果证明：1)非转基因的方法是一种重要的获得组织特异性干细胞的途径；2)通过建立适当的BM-MSCs体外诱导方法，可以成功实现干细胞的跨胚层转化；3)从临床应用角度来讲，非转基因方法获得的组织特异性干细胞应该比转基因方法获得的干细胞更安全、更实用。
目前，通过转基因方法诱导干细胞或成体细胞转分化或去分化形成某些组织特异性细胞已经取得了可喜的结果，但是由于转基因涉及的技术复杂、操作有一定难度、成功率较低以及外源性基因导入可能带来的安全性风险等问题尚没有解决，因此，从临床应用的角度来说，建立新一代的非转基因或限制性(尽量少转基因或不转基因)转基因的诱导方法，将具有多向分化潜能的BM-MSCs转变为临床所需的组织特异性干细胞可能更具有重要和直接的临床应用价值和相对小的风险代价。
发明内容
因此，本发明提供了一种重组蛋白联合诱导BM-MSCs转分化为汗腺细胞的非转基因方法，包括以下步骤：
a)分离并培养BM-MSCs，用免疫细胞化学法鉴定其表面标志性蛋白CD44；
b)分离并培养汗腺细胞，用免疫细胞化学法鉴定其表面标志性蛋白CEA、CK7、CK8知CK19；
c)使用重组蛋白EDA-A1和EGF配制的条件培养基诱导BM-MSCs向汗腺细胞的转分化；
优选地，诱导时BM-MSCs的密度为0.1-1×106/ml，更优选0.3×106/ml。
优选地，诱导时EDA-A1蛋白的浓度0.05-3.00μg/ml，更优选0.25μg/ml。
优选地，诱导时EGF蛋白的浓度0.10-1.00μg/ml，更优选0.5μg/ml
优选地，上述重组蛋白的诱导时间为5-12天，更优选7-9天。
附图说明
图1描述了免疫细胞化学法检测BM-MSCs和汗腺细胞表面标志性蛋白CD44、CEA、CK7、CK8和CK19的表达。其中(A-E)为汗腺细胞(A：CD44；B：CEA；C：CK7；D：CK8；E：CK19)；(F-J)为BM-MSCs(F：CD44；G：CEA；H：CK7；I：CK8；J：CK19)；Bar＝100μm。
图2描述了BM-MSCs转分化诱导后细胞形态的改变。其中(A)为：BM-MSCs诱导前的形态；(B)为：MSCs诱导后8天的形态；Bar＝100μm。
图3描述了免疫荧光法检测BM-MSCs转分化诱导8天后细胞表型的改变。其中(A-D)为诱导前(A：CEA；B：CK7；C：CK8；D：CK19)；(E-H)为诱导后(E：CEA；F：CK7；G：CK8；H：CK19)；Bar＝100μm。
图4描述了BM-MSCs转分化诱导后对裸鼠脚掌受损伤汗腺再生的促进作用。其中(A和B)为移植前BrdU检测(A：诱导前；B：诱导后)；(C-H)为移植后细胞功能检测(C：诱导前发汗实验阴性；D：诱导后发汗实验阳性；E：诱导前HE染色汗腺组织形态简单；F：诱导后HE染色有发达的汗腺组织形态；G：诱导前BrdU阳性细胞散在存在；H：诱导后BrdU阳性细胞集中在汗腺组织内)；Bar＝100μm。
具体实施方式
以下本发明以具体实施例的方式具体阐述发明。本领域技术人员可以理解的是，以下的实施例是为了阐述发明，而非限定发明的范围。
实施例
实施例1 BM-MSCs和汗腺细胞的分离培养及鉴定
1.BM-MSCs的分离培养：无菌条件下取正常志愿者的髂骨骨髓约2ml，采用直接贴壁法，以含10％胎牛血清、青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)的DMEM为培养液，在37℃、5％CO2孵育箱内培养，24h后更换培养基，弃掉未贴壁细胞，以后每2～3d换液1次。待细胞达80％融合时，用0.125％的胰蛋白酶消化，给予传代培养和组化检测。
2.汗腺细胞的分离培养：取约0.13cm×2.10cm的全层正常皮肤，置于含有青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)的人平衡盐溶液中反复漂洗，去除皮下脂肪，在60mm培养皿中将皮肤剪成1mm3左右的小块，加入含有II型胶原酶(2mg/ml)、胎牛血清(5％)、青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)的DMEM液3ml，置37℃、5％CO2、95％O2、饱和湿度孵箱中过夜。次日在清洁的、紫外线消毒的50×倒置相差显微镜下挑取汗腺组织，置37℃、5％CO2、95％O2、饱和湿度条件下培养。汗腺培养液以DMEM作为基础培养液，补加胎牛血清(5％)、重组人表皮生长因子(10ng/ml)、三碘甲状腺原氨酸(2ng/ml)、半琥珀酰氢化可的松(0.14μg/ml)、胰岛素2转铁蛋白2亚硒酸钠(1ml/100ml)(以上试剂均购于Gibco)及青霉素(100U/ml)、链霉素(100μg/ml)。待人汗腺细胞贴壁后，补加约2ml汗腺培养液继续培养，以后每2～3d换液一次。
3.免疫细胞化学检测结果：取细胞爬片，用预冷的甲醛丙酮混合液(体积比1∶1))固定30min，按二步法免疫组化检测试剂盒说明进行CD44、CEA、CK7、CK8和CK19检测。检测结果表明汗腺细胞内不表达CD44(图1A)，而CEA(图1B)、CK7(图1C)、CK8(图1D)和CK19(图1E)表达阳性；BM-MSCs内CD44呈强阳性表达(图1F)，不表达CEA(图1G)、CK7(图1H)、CK8(图1I)和CK19(图1J)。说明上述标志可用于鉴定汗腺细胞和BM-MSCs。
实施例2汗腺发育相关基因重组蛋白诱导BM-MSCs向汗腺细胞的转分化
将BM-MSCs于诱导前一天以3×105/ml的密度接种于60mm2的培养皿中，次日进行转分化诱导。对照组使用新鲜的汗腺细胞培养基，实验组使用诱导培养基(含EDA-A10.25μg/ml和EGF0.5μg/ml)诱导时间为7-9天。所有实验均重复至少3次。
1.BM-MSCs转分化诱导后细胞形态的改变：BM-MSCs诱导前体积较大，呈纤维状分散性分布(图2A)；诱导8天后细胞体积变小，呈多边形且比较扁平，部分细胞可相互连接成片，如“铺路石”样生长，形态类似汗腺上皮细胞(图2B)。
2.BM-MSCs转分化诱导后细胞表型的改变：BM-MSCs经重组蛋白条件培养基诱导8天后，按前述的细胞固定方法及文献报道的免疫荧光法行CEA、CK7、CK8和CK19检测。结果显示：诱导前没有检测到CEA(图3A)、CK7(图3B)、CK8(图3C)和CK19(图3D)染色阳性的细胞，而经条件培养基诱导后约有40-60％的细胞呈CEA(图3E)、CK7(图3F)、CK8(图3G)和CK19(图3H)染色阳性。
实施例3BM-MSCs转分化诱导后裸鼠脚掌移植实验
1.BrdU的标记和标记物的检测：在诱导和未诱导的BM-MSCs细胞培养上清中，加入终浓度为5μmol/L的BrdU，置37℃、5％CO2、95％空气、饱和湿度条件下培养3d。按前述的细胞固定及免疫细胞化学法行BrdU检测。检测结果表明约有95％的细胞为BrdU染色阳性(图3A和B)。
2.裸鼠脚掌烫伤模型的制备：常规消毒裸鼠(中国医学科学院动物所)脚掌后，抓持裸鼠脚掌与小型烫伤仪金属探头紧密接触5s，迅速浸入冷水带走多余热量，观察致伤局部发白变性判定为致伤成功。
3.标记细胞裸鼠脚掌局部注射移植：将经过诱导和未诱导的BM-MSCs细胞(1×106)悬浮于150μl培养液中并以局部注射的方式(烫伤部位皮内、皮下多点注射)对烫伤裸鼠脚掌部位进行试验性治疗，采用同体对照。2周后在裸鼠伤部行碘-淀粉发汗试验(将碘酒均匀涂抹于小鼠脚掌面，充分干燥5min，用脱脂棉球将淀粉扑于脚掌。肌内注射盐酸肾上腺素0.2ml(10μg/ml)，使其发汗。观察脚掌部淀粉颜色变化，局部出现蓝黑色为发汗试验阳性)检测汗腺功能，之后处死裸鼠，取脚掌部固定后行组织学观察。
4.移植细胞促进裸鼠损伤汗腺修复的效果：发汗实验及组织学观察结果表明：未经诱导的BM-MSCs细胞移植后发汗实验阴性(图4C)，脚掌内有极不发达且结构简单的腺体组织存在(图4E)，BrdU阳性细胞呈散在分布(图4G)；而经诱导的BM-MSCs细胞移植后发汗实验阳性(图4D)，脚掌内有大片汗腺腺体组织，可见发达而盘曲的分泌部(图4F)，且BrdU阳性细胞集中分布在新生汗腺组织内(图4H)。
以上结果说明：经过建立适当的体外汗腺诱导培养体系，中胚层来源的BM-MSCs可以通过跨胚层转分化途径转变为汗腺样细胞，并且从形态、表型和功能等方面确证这些转分化来源的细胞为汗腺细胞。
机译： 诱导骨髓间充质干细胞向神经系统细胞分化的方法
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