法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2017-03-08
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12N1/14 授权公告日:20121003 终止日期:20160119 申请日:20110119
专利权的终止
2012-10-03
授权
授权
2011-11-23
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N1/14 申请日:20110119
实质审查的生效
2011-09-28
公开
公开
技术领域
本发明涉及药用真菌液体发酵领域，特别是涉及茯苓液体发酵。
背景技术
茯苓Poria cocos为一种多年生腐生真菌，属于真菌门，担子菌纲，无隔担子菌亚纲，多孔菌目，多孔菌科，多孔菌属。茯苓始载于《神农本草经》，被列为上品。我国早在春秋末期就有应用茯苓的记载，而人工栽培茯苓的历史也已有1500多年。中医学认为茯苓“利水而不伤正，补而不助邪”，能利水渗湿、健脾安神；近代医学研究表明，茯苓的药理作用主要表现在利尿、镇静、抗肿瘤、增强免疫等方面。茯苓以干燥菌核入药，不同部位经加工分别成为白茯苓、赤茯苓、茯神、茯神木及茯苓皮等药材。茯苓药性平和，效用广泛，被誉为“除湿之圣药”、“仙药之上品”，为多种方剂配伍的要药及中成药的重要原料，在常用中药方剂中，茯苓的配伍率达到70％。
目前对茯苓液体发酵已有较多研究。用液体发酵培养及提取分离等新技术取代传统的固体发酵来生产茯苓，可连续地、大规模地进行工业化生产，缩短生产时间，节省大量的木材。李羿等的“茯苓液体发酵条件的研究”(成都中医药大学学报，2005年第28卷第2期)中报道了一种茯苓液体发酵的方法，其发酵菌株为四川农科所茯苓菌种，最适发酵培养基为：葡萄糖30g，酵母浸膏3.9g，蛋白胨5.1g，K2HPO4 1g，MgSO4.7H2O 0.5g，水1L；茯苓液体发酵的最适pH值5.5，液体菌种的菌龄为2d，液体菌种接种量6％，摇瓶培养时间7d，菌丝体产量最高为11.88g/L。
李羿等的“茯苓的摇瓶补料发酵和发酵罐补料液体发酵”(药物生物技术，2007年第14卷第1期)中报道了一种茯苓液体发酵的方法，其发酵菌株为四川农科所提供的茯苓菌种：通过分批补料加入碳源的方式可以提高茯苓液体发酵的水平，菌丝体产量最高为11.95g/L。
综上所述，现有的茯苓液体发酵方法的发酵水平仍然不高，不能满足市场对茯苓的需求。
中药中含有丰富的纤维素、淀粉、蛋白质、脂类等物质，而药用真菌具有分解纤维素、淀粉、蛋白质、脂类等物质的强大酶系，因此，药用真菌可利用中药基质进行深层发酵。同时，中药中的某些成分(生物碱、皂苷、黄酮等)可促进或抑制药用真菌的生长及代谢产物的生产。
杨海龙等的“中药对药用真菌深层发酵的影响”(食品与发酵工业，2009年35卷1期)中报道了中药对灵芝、灰树花、黑木耳、冬虫夏草和鸡腿蘑深层发酵水平的影响，不同中药对不同真菌的发酵有不同作用，有的中药具有促进作用，有的中药具有抑制作用，有的中药兼具有促进作用和抑制作用。
目前还没有文献报道在培养基中加入中药来提高茯苓液体发酵水平的方法。
发明内容
为了进一步提高茯苓发酵水平，本发明提供了一种新的茯苓菌株和一种新的茯苓液体发酵的方法。
首先，本发明提供了一种茯苓菌株，菌株名称为Poria cocos(Schw.)wolf.P6，它由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M2010361。该茯苓菌株于2010年12月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M 2010361。
本发明又提供了一种茯苓液体发酵方法，它包括如下步骤：
a、制备发酵种子：取保藏号为CCTCC NO：M 2010361的茯苓菌株接种于种子培养基培养，得茯苓种子；
b、发酵：将步骤a得到的种子接种于茯苓液体发酵培养基中进行发酵，得发酵液，即为茯苓发酵产物。
步骤a的种子培养基由下述原料制备而成：葡萄糖20g/L、酵母浸膏4g/L、蛋白胨5g/L、K2HPO4 1g/L、MgSO4.7H2O 0.5g/L和蒸馏水；步骤a的培养温度为25℃，pH为5.5；
步骤b所述的茯苓液体发酵培养基是由下述原料制备而成：葡萄糖20g/L、酵母浸膏3.5g/L、蛋白胨4.5g/L、K2HPO4 1g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、蒸馏水和粒径小于250μm的中药材固体粉末2.5g/L～20g/L，所述的中药材为薏苡仁、黄芪、金银花、甘草、淡竹叶、桑叶、丹参、灵芝或者枸杞子。上述薏苡仁固体粉末的量优选为2.5g/L～10g/L，进一步优选为7.5g/L；上述甘草的固体粉末的量优选为2.5g/L～10g/L，进一步优选为5g/L；上述淡竹叶的固体粉末的量优选为2.5g/L～15g/L，进一步优选为7.5g/L；上述桑叶的固体粉末的量优选为2.5g/L～10g/L，进一步优选为5g/L；上述灵芝的固体粉末的量优选为2.5g/L～15g/L，进一步优选为7.5g/L；上述枸杞子的固体粉末的量优选为2.5g/L～10g/L，进一步优选为5g/L。
步骤b的发酵方法为液体补料发酵，具体步骤如下：
①将茯苓种子接种到茯苓初始培养基内发酵，所述的初始培养基由下述原料制备而成：葡萄糖100g，酵母浸膏8.75g，蛋白胨11.25g，K2HPO4 5g，MgSO4.7H2O 2.5g，初始pH值5.5，蒸馏水4.05L，发酵温度为26℃，pH值为5.5，溶氧水平为60％～90％；
②在茯苓液体发酵第48h、60h、72h和84h时，分别将100mL补料培养基或者200mL补料培养基补入发酵罐中，所述的补料培养基由下述原料制备而成：葡萄糖100g，酵母浸膏8.75g，蛋白胨11.25g，蒸馏水600mL；
③发酵至发酵时间为117～129h，收取发酵液，即得发酵产物。
步骤②在48h、60h、72h和84h时加入的补料培养基依次为100mL、200mL、200mL和100mL。
本发明还提供了一种根据上述方法制备的茯苓发酵产物。
本发明提供的茯苓菌株具有较好的生产性能和稳定性，本发明提供的茯苓液体发酵方法，可以提高茯苓液体发酵的水平，使茯苓的菌丝体干重、胞外多糖含量显著提高，满足市场对茯苓的需求，为茯苓相关保健食品和药品的开发打下基础。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
1实验材料
1.1菌种茯苓菌株，购买于四川省农科所，保藏号为P0，与李羿等的“茯苓液体发酵条件的研究”(成都中医药大学学报，2005年第28卷第2期)中使用的茯苓菌株相同。
1.2仪器和试剂超净工作台(苏净集团安泰公司)；全温振荡器(哈尔滨东联电子技术开发有限公司)；NBS Bioflo III型发酵罐；离心机Beckman J2-HS；电子天平Sartorius BP121S。
酵母浸膏、蛋白胨为Oxoid产品，葡萄糖、蔗糖、K2HPO4、MgSO4·7H2O、NaNO3、KCl和FeSO4均采用国产分析纯。
1.3中药材薏苡仁(Coicis Semen)、黄芪(Astragali Radix)、金银花(Lonicerae Flos)、甘草(Glycyrrhizae Radix)、淡竹叶(Lophatheri Folum)、桑叶(Mori Folum)、丹参(Salviae Miltirrrhizae Radix et Rhizoma)、灵芝(Ganoderma)和枸杞子(Lycii Rructus)均购置于杏林大药房，粉碎过60目筛，60℃烘干至恒重后装入有塞瓶中，贴上标签，放入干燥器内备用。
实施例1茯苓优良菌株的选育
1、培养基
完全培养基(TYEG培养基)：胰蛋白胨10g，酵母浸膏5g，K2HPO4 3g，葡萄糖1g，琼脂15g，蒸馏水1L，pH 7.0。1.05kg/cm2，121.3℃灭菌20min。
液体发酵种子培养基：葡萄糖20g，酵母浸膏4g，蛋白胨5g，K2HPO41g，MgSO4.7H2O 0.5g，初始pH 5.5，蒸馏水1L。1.05kg/cm2，121.3℃灭菌20min。
液体发酵培养基：葡萄糖20g，酵母浸膏3.5g，蛋白胨4.5g，K2HPO4 1g，MgSO4.7H2O 0.5g，初始pH 5.5，蒸馏水1L。1.05kg/cm2，121.3℃灭菌20min。
2、诱变育种
1)紫外诱变
a，孢子悬液的制取取保藏号为P0的茯苓典型菌株，置于无菌生理盐水中，制备成孢子悬液，倒入盛有玻璃珠的小三角瓶中，充分摇动10min，使孢子均匀分散，用灭菌脱脂棉过滤，即为孢子悬浮液。取上述孢子悬浮液计数，调整孢子悬浮液浓度为106个孢子/mL；
b，紫外线照射将紫外灯开关打开遇热20min。取直径6cm无菌平皿5套，分别加入上述孢子悬液3mL，并将无菌搅拌棒放于平皿中。将盛有菌悬液的平皿置磁力搅拌器上，在距离为30cm，功率为15W的紫外灯下分别照射77s；
c，稀释在红灯下，将上述处理菌悬液以10倍稀释法稀释成10-2，10-3，10-4四个不同的稀释度；
d，在红灯下，取10-1、10-2、10-3三个稀释度的0.1mL孢子悬液涂在含2mg/mL茯苓胞外多糖的浓度梯度完全培养基平板上，用无菌玻璃刮棒涂匀；
e，将上述涂匀的平板用黑布包好，置28℃恒温培养箱倒置培养，得到茯苓单菌落；
2)优良菌株的筛选
a，将步骤1)得到茯苓单菌落用无菌牙签挑到含4mg/mL茯苓胞外多糖的完全培养基平板上，挑选出生长较好的菌落用无菌牙签接种到含8mg/mL茯苓胞外多糖的完全培养基平板上，挑选出生长较好的菌落用无菌牙签接种到含16mg/mL茯苓胞外多糖的完全培养基上，从中挑选出生长较好的菌株；
将保藏号为P0的典型菌株与上述筛选出的菌株分别接种到盛有50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，在25℃，150r/min摇瓶振荡培养5d作为液体菌种备用；分别吸取已制备的种子液3.5mL，接种于盛有50mL液体摇瓶发酵培养基的250mL三角瓶中(按7％的比例接种)，在培养温度26℃，培养基初始pH值5.5，摇瓶转速150r/min的培养条件下培养7d。取发酵液50mL，经6000r/min离心15min，收集沉积的菌丝球，60℃烘干至恒重，用电子天平精确称重。
经过摇瓶培养，保藏号为P0的典型菌株的菌丝体干重为11.08g/L，筛选得到的菌株中，有一株茯苓菌株发酵得到的菌丝体干重为11.92g/L，比出发菌株提高了7.58％。因此，以该菌株为优良菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2010361。
3)、稳定性检测
挑取步骤2)筛选得到的保藏号为CCTCC NO：M 2010361的优良菌株，接种到盛有50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中。在25℃，150r/min摇瓶振荡培养5d作为液体菌种备用，称为第一代种子液。
用无菌移液器吸取250μL第一代种子液，接种到盛有50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中(按0.5％的比例接种)。在培养温度25℃，150r/min摇瓶振荡培养2d得到第二代优良菌株的种子液。再将第二代种子接种到液体种子培养基中，在培养温度25℃，150r/min摇瓶振荡培养2d得到第三代优良菌株种子液。依此类推，可得到第十代优良菌株种子液。
分别吸取已制备的优良菌株第一代至第十代的种子液3.5mL，接种于盛有50mL液体发酵培养基的250mL三角瓶中(按7％的比例接种)。在培养温度26℃，培养基初始pH值5.5，摇瓶转速150r/min的培养条件下，摇瓶振荡培养7d。取发酵液50mL，经6000r/min离心15min，收集沉积的菌丝球，60℃烘干至恒重，用电子天平精确称重。
结果如表1所示：
表1茯苓优良菌株的稳定性
从表1可知，保藏号为CCTCC NO：M 2010361的优良菌株第一代至第十代的菌丝干重在11.70～11.97g/L之间波动，波动幅度很小，表明其具有良好的遗传稳定性。
本实施例证明了本发明紫外诱变育种得到的保藏号为CCTCC NO：M2010361茯苓菌株不仅对多糖具有很好的耐受性，可产生更多的多糖，而且菌丝体的产量也有提高。
实施例2中药对茯苓摇瓶液体发酵的影响
1、培养基
种子培养基：葡萄糖20g，酵母浸膏4g，蛋白胨5g，K2HPO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，蒸馏水1L，初始pH 5.5。
发酵基础培养基：葡萄糖20g，酵母浸膏3.5g，蛋白胨4.5g，K2HPO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，蒸馏水1L，初始pH 5.5。
2、发酵方法
1)、茯苓摇瓶液体发酵菌种的制备
将50mL种子培养基培养基装入250mL三角瓶，按0.5％的比例接种实施例1得到的保藏号为CCTCC NO：M 2010361的茯苓菌株，25℃摇瓶振荡培养2d作为液体发酵菌种备用。
2)、接种培养
在摇瓶液体发酵基础培养基中以10g/L的浓度将薏苡仁等9味中药固体粉末(固体粉末的粒径小于250μm)分别加入摇瓶液体发酵基础培养基中，对照不加中药，于1.05kg/cm2，121.3℃灭菌20min。摇瓶液体发酵培养条件：冷却后按6％比例接入茯苓液体菌种，培养温度26℃，摇瓶装量60mL(250mL三角瓶)，150r/min摇瓶振荡培养7d，即得发酵液。
3)、菌丝体称重
取发酵液于6000r/min离心15min，收集沉积的菌丝球60℃烘干至恒重，用精密天平称重。
4)、胞外多糖的纯化与称量
取发酵液6000r/min离心15min，收取上清液；上清液浓缩后用Sevag法除蛋白；6000r/min离心20min，上清液加入3倍量的95％乙醇，冷藏12h。6000r/min离心20min，收集沉淀，低温干燥得茯苓胞外粗多糖；将茯苓胞外初多糖依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，低温干燥，得茯苓胞外多糖，用电子天平精确称重。
3、结果
不同中药对茯苓摇瓶液体发酵菌丝体产量和胞外多糖产量的影响如表2所示：
表2不同中药对茯苓深层发酵的影响
其中对照为不添加中药的发酵基础培养基，而其他条件相同。在茯苓菌丝体产量方面，黄芪、金银花和丹参对茯苓的菌丝体生长有明显的抑制作用，而其余的6味中药对茯苓的菌丝体生长有明显的促进作用，其中以薏苡仁最为显著，生物量增加了17.37％。在茯苓胞外多糖产量方面，9味中药均有利于胞外多糖产量的提高，分别比对照提高11.05％～82.02％。
本实施例证明了薏苡仁、黄芪、金银花、甘草、淡竹叶、桑叶、丹参、灵芝或者枸杞子其它们的提取物对茯苓发酵均有促进作用，特别是薏苡仁、甘草、淡竹叶、桑叶、灵芝或者枸杞子及它们的提取物对茯苓发酵有很好的促进作用。
实施例3不同中药量对茯苓摇瓶液体发酵的影响
1、培养基
种子培养基：葡萄糖20g，酵母浸膏4g，蛋白胨5g，K2HPO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，蒸馏水1L，初始pH 5.5。
发酵基础培养基：葡萄糖20g，酵母浸膏3.5g，蛋白胨4.5g，K2HPO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，蒸馏水1L，初始pH 5.5。
2、发酵方法
1)、茯苓摇瓶液体发酵菌种的制备
将50mL种子培养基装入250mL三角瓶，按0.5％的比例接种实施例1得到的保藏号为CCTCC NO：M 2010361的茯苓菌株，25℃摇瓶振荡培养2d作为液体发酵菌种备用。
2)、接种培养
在摇瓶液体发酵基础培养基中均以2.5g/L、5g、7.5g/L、10g/L、15g/L、20g/L的浓度将薏苡仁、甘草、淡竹叶、桑叶、灵芝和枸杞子固体粉末(固体粉末的粒径小于250μm)分别加入摇瓶液体发酵基础培养基中，对照不加中药，于1.05kg/cm2，121.3℃灭菌20min。摇瓶液体发酵培养条件：冷却后按6％比例接入茯苓液体菌种，培养温度26℃，摇瓶装量60mL(250mL三角瓶)，150r/min摇瓶振荡培养7d，即得发酵液。
3)、菌丝体称重
取发酵液于6000r/min离心15min，收集沉积的菌丝球60℃烘干至恒重，用精密天平称重。
4)、胞外多糖的纯化与称量
取发酵液6000r/min离心15min，收取上清液；上清液浓缩后用Sevag法除蛋白；6000r/min离心20min，上清液加入3倍量的95％乙醇，冷藏12h。6000r/min离心20min，收集沉淀，低温干燥得茯苓胞外粗多糖；将茯苓胞外初多糖依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，低温干燥，得茯苓胞外多糖，用电子天平精确称重。
3、结果
茯苓菌丝体产量和胞外多糖产量结果如下：
(1)不同薏苡仁添加量对茯苓摇瓶液体发酵结果如表3所示，当薏苡仁添加量为7.5g/L时菌丝体干重最高达14.41g/L，当薏苡仁添加量为15g/L时胞外多糖产量最高达8.79g/L。
表3不同浓度薏苡仁对茯苓深层发酵的影响
(2)不同甘草添加量对茯苓摇瓶液体发酵结果如表4所示，当甘草添加量为5g/L时菌丝体干重最高达12.66g/L，当甘草添加量为10g/L时胞外多糖产量最高达7.71g/L。
表4不同浓度甘草对茯苓深层发酵的影响
(3)不同淡竹叶添加量对茯苓摇瓶液体发酵结果如表5所示，当淡竹叶添加量为7.5g/L时菌丝体干重最高达13.55g/L，当淡竹叶添加量为15g/L时胞外多糖产量最高达7.48g/L。
表5不同浓度淡竹叶对茯苓深层发酵的影响
(4)不同桑叶添加量对茯苓摇瓶液体发酵结果如表6所示，当桑叶添加量为7.5g/L时菌丝体干重最高达12.91g/L，当桑叶添加量为20g/L时胞外多糖产量最高达7.81g/L。
表6不同浓度桑叶对茯苓深层发酵的影响
(5)不同灵芝添加量对茯苓摇瓶液体发酵结果如表7所示，当灵芝添加量为7.5g/L时菌丝体干重最高达13.71g/L，当灵芝添加量为20g/L时胞外多糖产量最高达9.06g/L。
表7不同浓度灵芝对茯苓深层发酵的影响
(6)不同枸杞子加量对茯苓摇瓶液体发酵结果如表8所示，当枸杞子添加量为5g/L时菌丝体干重最高达13.86g/L，当枸杞子添加量20g/L时胞外多糖产量最高达11.23g/L。
表8不同浓度枸杞子对茯苓深层发酵的影响
薏苡仁等6味中药固体粉末添加量的不同对茯苓摇瓶液体发酵的影响有较大的差异，中药添加量过高或过低都会影响茯苓的生长和胞外多糖的分泌，通常每味中药菌丝体干重达最高时的最适中药添加量不同于胞外多糖产量达最高时的最适中药添加量。6味中药对茯苓液体发酵的菌丝体产量和胞外多糖产量有较大的差异，研究表明，当薏苡仁添加量为7.5g/L时茯苓菌丝体干重最高达14.41g/L，当枸杞子添加量为20g/L时茯苓胞外多糖产量最高达11.23g/L。
本实施例证明了：
培养基中加入2.5g/L～20g/L的薏苡仁固体粉末可以促进茯苓液体发酵，优选的2.5g/L～10g/L的薏苡仁固体粉末对茯苓发酵有较好的促进作用，培养基中加入最优选的7.5g/L的薏苡仁固体粉末时得到的茯苓发酵产物的菌丝体产量最高；
培养基中加入2.5g/L～20g/L的甘草固体粉末可以促进茯苓液体发酵，优选的2.5g/L～10g/L的甘草固体粉末对茯苓发酵有较好促进作用，培养基中加入最优选的5g/L的甘草固体粉末时得到的茯苓发酵产物的菌丝体产量最高；
培养基中加入2.5g/L～20g/L的淡竹叶固体粉末可以促进茯苓液体发酵，优选的2.5g/L～15g/L的淡竹叶固体粉末对茯苓发酵有较好的促进作用，培养基中加入最优选的7.5g/L的淡竹叶固体粉末时得到的茯苓发酵产物的菌丝体产量最高；
培养基中加入2.5g/L～20g/L的桑叶固体粉末可以促进茯苓液体发酵，优选的2.5g/L～10g/L的桑叶固体粉末对茯苓发酵有较好的促进作用，培养基中加入最优选的5g/L的桑叶固体粉末时得到的茯苓发酵产物的菌丝体产量最高；
培养基中加入2.5g/L～20g/L的灵芝固体粉末可以促进茯苓液体发酵，优选的2.5g/L～15g/L的灵芝固体粉末对茯苓发酵有较好的促进作用，培养基中加入最优选的7.5g/L的灵芝固体粉末时得到的茯苓发酵产物的菌丝体产量最高；
培养基中加入2.5g/L～20g/L的枸杞子固体粉末可以促进茯苓液体发酵，优选的2.5g/L～10g/L的枸杞子的固体粉末对茯苓发酵有较好的促进作用，培养基中加入最优选的5g/L的枸杞子固体粉末时得到的茯苓发酵产物的菌丝体产量最高。
实施例4液体补料发酵
1、培养基
种子培养基：葡萄糖20g，酵母浸膏4g，蛋白胨5g，K2HPO4 1g，MgSO4.7H2O0.5g，初始pH值5.5，蒸馏水1L。1.05Kg/cm2，121.3℃灭菌20min。
发酵罐初始培养基：葡萄糖100g，酵母浸膏8.75g，蛋白胨11.25g，K2HP045g，MgSO4.7H2O 2.5g，初始pH值5.5，蒸馏水4.05L。1.05kg/cm2，121.3℃灭菌20min。
发酵罐补料培养基：葡萄糖100g，酵母浸膏8.75g，蛋白胨11.25g，蒸馏水600mL。0.56kg/cm2，112.6℃灭菌30min。
2、发酵方法
1)、茯苓摇瓶液体发酵菌种的制备
将50mL种子培养基装入350mL三角瓶，按0.5％的比例接种实施例1得到的保藏号为CCTCC NO：M 2010361的茯苓菌株，25℃摇瓶振荡培养2d作为液体发酵菌种备用。
2)、接种培养
在火焰保护下，将350mL发酵罐种子液接种到装有4.05L发酵罐初始培养基的发酵罐内发酵，在茯苓液体发酵第48h、60h、72h和84h时，由蠕动泵分四次加入100mL补料培养基或者200mL补料培养基补入发酵罐中。发酵条件：发酵温度设定为26℃，pH值设定为5.5，搅拌转速和通气量根据溶氧水平的高低而调整，溶氧水平控制在60％～90％。同时，分别考察了不同补料条件下茯苓发酵罐液体发酵的最佳发酵终点，发酵终点的确定步骤：①在茯苓液体发酵110h后，每隔1h取样20mL；②测定样品中茯苓菌丝体的生物量和胞外多糖含量；③根据测得的茯苓菌丝体的生物量和胞外多糖含量数值的大小，并结合发酵时间和发酵成本，确定发酵终点。至发酵终点时停止发酵，得到的发酵液即为发酵产物。
3)、菌丝体称重
取发酵液于6000r/min离心15min，收集沉积的菌丝球60℃烘干至恒重，用精密天平称重。
4)、胞外多糖的纯化与称量
取发酵液6000r/min离心15min，收取上清液；上清液浓缩后用Sevag法除蛋白；6000r/min离心20min，上清液加入3倍量的95％乙醇，冷藏12h。6000r/min离心20min，收集沉淀，低温干燥得茯苓胞外粗多糖；将茯苓胞外初多糖依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，低温干燥，得茯苓胞外多糖，用电子天平精确称重。
3、结果
不同时间和不同补料方式对茯苓发酵罐液体发酵的影响，结果见表9：
表9不同时间和不同补料方式对茯苓发酵罐液体发酵的影响
不同时间和不同葡萄糖浓度补料对发酵终点的影响，实验结果见表10：
表10不同时间和不同补料方式对茯苓发酵罐液体发酵终点的影响
综合考虑不同时间和不同补料方式对茯苓发酵罐液体发酵菌丝体产量、胞外多糖产量和发酵终点的影响，最佳的发酵工艺为：在发酵培养第48h、60h、72h和84h时，分别加入100mL、200mL、200mL和100mL的补料培养基。在最佳发酵工艺下，菌丝体产量达12.56g/L，胞外多糖产量达5.51g/L，发酵时间为117h。
本实施例证明了补料液体发酵的方式对茯苓发酵有促进作用，特别是在发酵培养第48h、60h、72h和84h时，分别加入100mL、200mL、200mL和100mL的补料培养基对茯苓菌丝体产量和胞外多糖的产量的促进作用尤为显著。
实施例5薏苡仁对茯苓发酵罐液体补料发酵的影响
1、培养基
种子培养基：葡萄糖20g，酵母浸膏4g，蛋白胨5g，K2HPO4 1g，MgSO4.7H2O 0.5g，初始pH值5.5，蒸馏水1L。1.05Kg/cm2，121.3℃灭菌20min。
发酵罐发酵培养基：葡萄糖100g，酵母浸膏8.75g，蛋白胨11.25g，K2HPO4 5g，MgSO4.7H2O 2.5g，初始pH值5.5，蒸馏水4.05L。1.05Kg/cm2，121.3℃灭菌20min。
发酵罐补料培养基：葡萄糖100g，酵母浸膏8.75g，蛋白胨11.25g，蒸馏水600mL。0.56Kg/cm2，112.6℃灭菌30min。
2、发酵步骤
1)、茯苓摇瓶液体发酵菌种的制备
在1L三角瓶中装入350mL液体种子培养基，按0.5％的比例接种冷冻甘油菌，培养温度25℃，150r/min摇瓶振荡培养2d作为液体菌种备用。
2)、接种培养
在4.05L发酵罐初始培养基中以2.5g/L的浓度加入薏苡仁，对照不加中药，1.05kg/cm2，121.3℃灭菌20min。
在火焰保护下，将350mL发酵罐种子液接种到装有上述培养基的发酵罐内发酵，在茯苓液体发酵第48h、60h、72h和84h时，由蠕动泵分依次将100mL、200mL、200mL和100mL的补料培养基补入发酵罐中。发酵条件：发酵温度设定为26℃，pH值设定为5.5，搅拌转速和通气量根据溶氧水平的高低而调整，溶氧水平控制在60％～90％，发酵培养117h，即得发酵液。
3)、菌丝体称重
取发酵液于6000r/min离心15min，收集沉积的菌丝球60℃烘干至恒重，用精密天平称重。
4)、液体发酵茯苓胞外多糖的纯化与称量
发酵液6000r/min离心15min，收取上清液。上清液浓缩后用Sevag法除蛋白。6000r/min离心20min，上清液加入3倍量的95％乙醇，冷藏12h。6000r/min离心20min，收集沉淀，低温干燥得茯苓胞外粗多糖。将茯苓胞外初多糖依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，低温干燥，得茯苓胞外多糖。用电子天平精确称量。
3、结果
茯苓发酵罐液体发酵菌丝体产量和胞外多糖产量结果如表11所示
表11薏苡仁对茯苓深层发酵的影响
浓度为7.5g/L的薏苡仁固体粉末对茯苓发酵罐补料液体发酵有促进作用，菌丝体产量提高24.85％，胞外多糖产量提高44.17％。
本实施例证明了培养基的改进结合液体补料发酵的方法对茯苓菌丝体的产量和胞外多糖含量有明显的促进作用。
综上，本发明提供的茯苓菌株具有较好的生产性能和稳定性，本发明提供的在培养基中加入中药固体粉末的液体发酵方法和液体补料发酵方法，可以提高茯苓液体发酵的水平，并显著提高茯苓的菌丝体干重和胞外多糖产量，满足市场对茯苓的需求，为茯苓相关保健食品和药品的开发打下基础。
机译： 一种新的哈茨木霉菌株的分离方法，该菌株的培养，该菌株产生的新肽，该菌株的应用以及通过培养方法获得的这些新肽或产物，作为一种方法植物检疫产品形式的生物防治
机译： 一种Cord虫草菌株的液体发酵方法
机译： 哈茨木霉的新菌株用于分离该菌株，该菌株的培养方法，该菌株产生的新肽的应用以及该菌株以及该方法获得的所述肽或产物的应用作为生物防治手段的一种生物杀菌剂。
