一种基于石墨烯修饰电极同时测定芦丁和槲皮素的电化学方法

技术领域

本发明涉及中药黄酮类物质的测定，特别是一种可以同时测定芦丁和槲皮素的电化学方 法，同时涉及该石墨烯修饰玻碳电极的制备方法，属于电化学分析技术领域。

背景技术

黄酮类物质芦丁(Rutin)和槲皮素(Quercetin)广泛的存在于植物界和人类的日常饮 食中，它们参与毛细血管壁的构建，并且可以减低血管的渗透性和脆性，越来越广泛地被作 为抗癌、抗氧化等多功效物质。目前，芦丁已经作为一种药物被应用于临床治疗中。作为芦 丁的糖基，槲皮素经常和芦丁共存。如果某些含有芦丁的药片和软胶囊存放不当，槲皮素也 许会出现在芦丁的水解产物中。而且，他们经常被发现共同存在于中草药中，例如红花，槐 米，香草，连翘等。然而，同时含有这两种成分的中草药却具有不同药理作用，红花，是草 红花干燥的花瓣，经常被用来治疗子宫充血，心血管类疾病，血栓症和高胆固醇。槐米，是 槐角干燥的花蕾，具有除热，参与毛细血管构建和预防高血压等作用。由于组成成分及各组 分的药效在中药医学中是非常重要的，所以发展一种方法用于天然药物中芦丁和槲皮素成分 的鉴定是非常必要的。

目前对黄酮类成分中槲皮素和/或芦丁的分离和鉴定的分析方法主要有：高效液相色谱 法、毛细管电泳法或流动注射分析并联合其他的检测技术，例如荧光分光光度法、质谱、脉 冲极谱法、电化学检测和化学发光等。这些检测技术的联用虽然具有高的选择性，但也存在 一些不利因素，如前处理的繁琐，操作的复杂性，时间和试剂的大量消耗，高的成本等；而 且，在中药的分析中，应用高效液相色谱经常由于色谱柱的污染造成柱的短寿命。因此急需 要发展一种可以同时检测芦丁和槲皮素的简单，快速，准确的方法。

采用电化学法进行芦丁和槲皮素的同时检测具有设备简单，检测周期短，操作容易等优 点，因而具有更广阔的应用前景。并且容易小型化和开发便携式的仪器，成本低廉，产业化 方便。然而由于芦丁和槲皮素在常规玻碳电极上的氧化电位相近，芦丁和槲皮素的氧化峰出 现重叠，这就限制了其应用于芦丁和槲皮素的同时测定。

发明内容

基于对玻碳电极进行化学修饰可以改善其电化学性能，本发明提供一种基于石墨烯修饰 电极同时测定芦丁和槲皮素的电化学方法。

其技术解决方案是：

一种基于石墨烯修饰电极同时测定芦丁和槲皮素的电化学方法，该方法采用石墨烯修饰 玻碳电极作为工作电极，采用循环伏安法和差示脉冲伏安法对芦丁和槲皮素进行同时测定。

上述基于石墨烯修饰电极同时测定芦丁和槲皮素的电化学方法具体包括以下步骤：

a选取天然石墨为原料制备石墨烯，或购买商品化的石墨烯；

b将步骤a得到的石墨烯溶于蒸馏水中，配制成浓度为1～2mg/mL的石墨烯分散水溶液， 取2μL～3μL上述浓度的石墨烯分散水溶液滴涂到洁净的玻碳电极的表面，再置于红外灯下 烤干即得石墨烯修饰电极；

c将步骤b得到的石墨烯修饰电极作为工作电极，与作为参比电极的饱和甘汞电极，作 为对电极的铂丝电极组成三电极系统，在CHI-660B电化学工作站上完成芦丁和槲皮素的同时 电化学测定。

上述步骤a中，所述石墨烯的制备方法包括以下步骤：

a1选取天然石墨为原料制备氧化石墨；

a2将氧化石墨溶于蒸馏水中，按1mg氧化石墨需置于1mL～1.2mL蒸馏水的比例添加， 添加完成后所得氧化石墨溶液呈红棕色悬浮液，超声振荡至溶液清晰透明无颗粒状物质，再 将所得氧化石墨溶液与肼溶液混合，氧化石墨溶液与肼溶液的体积比为4∶1，二者混合后呈 黑色悬浮液，然后将黑色悬浮液缓慢升温至95℃～100℃，并在此温度下回流反应24h，反应 完成后过滤得滤渣，再对滤渣进行洗涤干燥，得到石墨烯。

上述步骤a1中，所述氧化石墨的制备方法包括以下步骤：

将2.5g～3g天然鳞片石墨缓慢加入到装有57mL～65mL浓硫酸的烧杯中，搅拌并在冰浴 条件下向烧杯中继续缓慢加入1.2g～1.25g硝酸钠与7g～7.5g高锰酸钾组成的混合物，然后 在冰浴条件下反应2h，再置于32℃～38℃水浴中，保温25min～30min，保温完成后向烧杯 中缓慢加入110mL～115mL二次蒸馏水，然后升温至98℃，并在此温度下维持15min，再向烧 杯中加入温水稀释，直至烧杯内溶液体积达到350mL停止温水加入，然后向烧杯中加入H₂O₂， 趁热过滤，直至滤液中无SO₄^2-，收集滤渣，并将滤渣于50℃在P₂O₅存在下干燥24h，得到氧 化石墨。

上述步骤c中，所述电化学测定的方法包括以下步骤：

将石墨烯修饰电极先在空白底液中进行多次循环伏安扫描，扫描电压为-0.1～0.7V， 扫描速率为80mV/s，直到曲线稳定为止；然后将三电极系统放于适量芦丁和槲皮素的标准溶 液中，开路富集60s，静止2s，在-0.1V～0.7V扫描区间内进行循环伏安法和差示脉冲伏 安分析，扫描速率为100mV/s。

每次扫描结束后，将石墨烯修饰电极置于pH 7.0的空白磷酸盐缓冲溶液中，在-0.2～1.0 V电位区间循环伏安法扫描至芦丁和槲皮素的电化学响应消失，即可更新电极表面，更新后的 石墨烯修饰电极室温下保存待用。

上述空白底液为磷酸盐缓冲溶液，该磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.1mol/L，pH为7.0。

本发明的有益技术效果是：

本发明提供了一种同时测定芦丁和槲皮素的电化学方法，首先是石墨烯修饰玻碳电极的 制备，选取石墨烯作为玻碳电极的修饰材料，先采用改进的哈默法制备氧化石墨，然后通过 控制氧化石墨与肼添加量的配比、反应温度与回流反应时间制得具有纳米片层结构的石墨烯， 选取石墨烯配制合适浓度的石墨烯分散水溶液，再将适量石墨烯分散水溶液滴涂到洁净的玻 碳电极表面，并在红外灯下烤干制得石墨烯修饰玻碳电极。再次是选取上述石墨烯修饰电极 为工作电极，并与饱和甘汞电极、铂丝电极组成三电极系统，对芦丁和槲皮素进行电化学测 定。经验证，该三电极系统对芦丁和槲皮素具有高的催化活性，检测的灵敏度高，氧化反应 的过电位低，选择性好，可以实现对芦丁和槲皮素的同时测定，是一种高稳定性、高灵敏度 和高选择性的检测电极，而且其制备工艺简单，原理可靠，环境友好。

附图说明

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步说明：

图1为实施例1制得的石墨烯透射电镜照片；

图2为实施例1制得的石墨烯修饰电极同时测定相同浓度的芦丁和槲皮素的差示脉冲曲 线。

具体实施方式

实施例1

称取2.5g粒度为200目的天然鳞片，将其缓慢加入到装有57.5mL浓硫酸的烧杯中，搅 拌并在冰浴条件下向烧杯中继续缓慢加入1.25g硝酸钠与7.5g高锰酸钾组成的混合物，然后 在冰浴条件下反应2h，再置于32℃～38℃水浴中，保温30min，保温完成后向烧杯中缓慢加 入115mL二次蒸馏水，然后升温至98℃，并在此温度下维持15min，再向烧杯中加入40℃的 温水稀释，直至烧杯内溶液体积达到350mL停止温水加入，然后向烧杯中加入质量百分比浓 度为5％的H₂O₂，趁热过滤，直至滤液中无SO₄^2-(用BaCl₂溶液检测)，收集滤渣，并将滤渣于 50℃在P₂O₅存在下干燥24h，得到氧化石墨，密封保存待用。

称取100mg上述氧化石墨放入装有100mL蒸馏水的圆底烧瓶中，添加完成后所得氧化 石墨溶液呈红棕色悬浮液，超声振荡至溶液清晰透明无颗粒状物质，再量取20mL该氧化石 墨溶液并与5mL肼溶液混合，混合后呈黑色悬浮液，然后将黑色悬浮液缓慢升温至100℃， 并在此温度下回流反应24h，反应完成后过滤得滤渣，再用蒸馏水和甲醇将滤渣洗涤干净， 再将洗净后的滤渣在空气流通的情况下干燥，得到石墨烯，密封保存待用。选取少量制得的 石墨烯进行透射电镜实验，所得透射电镜照片如图1所示，从图1中可以看出，本实施例制 得的石墨烯具有纳米片层结构，形貌良好，具有完整的二维平面结构。

将上述石墨烯配制成浓度为1mg/mL的石墨烯分散水溶液，取2μL滴涂到洁净的玻碳电 极的表面，再置于红外灯下烤于即得石墨烯修饰电极。

将得到的石墨烯修饰电极作为工作电极，与作为参比电极的饱和甘汞电极，作为对电极 的铂丝电极组成三电极系统，在CHI-660B电化学工作站上用于对浓度为1×10^-4mol/L的芦丁 和浓度为1×10^-4mol/L的槲皮素同时进行电化学测定。电化学测定方法如下：将石墨烯修饰电 极先在空白底液中进行多次循环伏安扫描，扫描电压为-0.1～0.7V，扫描速率为80mV/s， 直到曲线稳定为止；然后将三电极系统放于上述浓度的芦丁和槲皮素的标准溶液中，开路富 集60s，静止2s，在-0.1V～0.7V扫描区间内进行循环伏安法和差示脉冲伏安分析，扫 描速率为100mV/s。图2分别示出在得到的石墨烯修饰电极上浓度均为1×10^-4mol/L的芦丁 与槲皮素混合后的差示脉冲曲线a，浓度为1×10^-4mol/L的槲皮素单独存在时的差示脉冲曲线 b，浓度为1×10^-4mol/L的芦丁单独存在时的差示脉冲曲线c，浓度均为1×10^-4mol/L的芦丁和 槲皮素混合后的混合液在裸玻碳电极上的差示脉冲曲线d。从图2中可以看出，未经修饰的 裸玻碳电极(图2曲线d)上芦丁与槲皮素的灵敏度较低且不能分离，而在石墨烯修饰电极 上芦丁与槲皮素得到了很好的分离，氧化峰电位差为124mV，并且两者同时存在时不会对其 中一组分的电化学信号产生影响，可实现芦丁和槲皮素的同时测定，而且峰电流得到明显的 增大(是裸玻碳电极的5倍以上)；并得到了芦丁和槲皮素的工作曲线，芦丁：ip(μA)＝14.65 +4088.25C(mol/L)，R＝0.9996；槲皮素：ip(μA)＝11.35+4018.56C(mol/L)，R＝ 0.9995，该三电极系统对芦丁和槲皮素的检出限分别为1.2×10^-8mol/L和9.0×10^-9mol/L。 而且，作为工作电极的石墨烯修饰电极连续检测的重复性好，稳定性高且易被更新。

上述电化学测定方法中，空白底液选用浓度为0.1mol/L、pH为7.0的磷酸盐缓冲液， 该磷酸盐缓冲液采用下述方法制备：将61.0mL浓度为0.2mol/L的磷酸氢二钠和39mL浓 度为0.2mol/L的磷酸二氢钠混合，得到浓度为0.2mol/L、pH为7.0的磷酸盐缓冲液， 再取25mL上述磷酸盐缓冲液并稀释到50mL即得浓度为0.1mol/L、pH为7.0的磷酸盐 缓冲液。

上述浓度为1×10^-4mol/L的芦丁和浓度为1×10^-4mol/L的槲皮素的混合溶液的制备方法如 下：称取0.332g芦丁，乙醇溶解，定容到50mL容量瓶中，得到浓度为1×10^-2mol/L的芦丁溶 液；称取0.151g槲皮素，乙醇溶解，定容到50mL容量瓶中，得到浓度为1×10^-2mol/L的槲皮 素溶液；分别量取0.5mL浓度为1×10^-2mol/L的芦丁溶液，0.5mL浓度为1×10^-2mol/L的 槲皮素溶液，25mL浓度为0.2mol/L、pH 7.0的磷酸盐缓冲液一并置于50mL容量瓶中， 二次蒸馏水水定容，得到浓度为1×10^-4mol/L的芦丁和1×10^-4mol/L的槲皮素的混合溶液。

进一步的，将上述方法制得的石墨烯修饰电极作为工作电极，用于槐米中芦丁和槲皮素 的同时测定。将槐米用蒸馏水洗净后晒干，然后在烘箱中于50℃干燥4h，粉碎，过筛。称 取2.00g槐米粉末，加入20mL乙醇中，超声提取30min，抽滤，滤液旋转蒸发至少于10mL， 定容于10mL容量瓶。采用上述电化学方法进行分析测定，得到槐米中槲皮素的浓度为4.49 mg/g，芦丁的浓度为11.18mg/g；加标回收结果显示该三电极系统对槲皮素和芦丁测定的回 收率分别为99.8％和100.1％，相对标准偏差分别为1.5％和1.3％，得到了满意的结果。

上述石墨烯修饰电极测定完成后可重复利用，具体操作方法为：每次扫描结束后，将石 墨烯修饰电极置于pH7.0的空白磷酸盐缓冲溶液中，在-0.2～1.0V电位区间循环伏安法 扫描至芦丁和槲皮素的氧化还原峰消失，即可更新电极表面，更新后的石墨烯修饰电极室温 下保存待用。

上述石墨烯修饰电极也可采用下述方法制得。

如：石墨烯的制备方法同上，将得到的石墨烯配制成浓度为1.5mg/mL的分散水溶液，取 2μL滴涂到洁净的玻碳电极的表面，再置于红外灯下烤干即得石墨烯修饰电极。

再如：石墨烯的制备方法同上，将得到的石墨烯配制成浓度为2mg/mL的分散水溶液，取 2μL滴涂到洁净的玻碳电极的表面，再置于红外灯下烤干即得石墨烯修饰电极。

如：将商品化的石墨烯配制成浓度为1mg/mL的分散水溶液，取3μL滴涂到洁净的玻碳 电极的表面，再置于红外灯下烤干即得石墨烯修饰电极。

应当理解的是，上述针对较佳实施例的描述较为详细，并不能因此而认为是对本发明专 利保护范围的限制，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明权利要求所 保护的范围情况下，还可以做出替换、简单组合等多种变形，这些均落入本发明的保护范围 之内，本发明的请求保护范围应以所附权利要求为准。