猪流感病毒和猪蓝耳病病毒混合病毒样颗粒、制备方法和应用

技术领域

本发明涉及猪流感病毒和猪蓝耳病病毒混合病毒样颗粒，及其制备和应用。

背景技术

猪流感是由猪流感病毒(Swine influenza virus，SIV)引起的不同日龄、性别和品种猪只 的一种急性、热性和高度接触性的呼吸道传染病，其临床上以突发、高热、咳嗽、呼吸困难、 衰竭和死亡为特征。各年龄、性别、品种猪均能感染，发病率高。单独感染猪流感病毒可导致 猪只生产性能下降，料肉比升高，增重减缓，给猪场造成一定的经济损失。更为严重的是，猪 是禽、人、猪流感病毒重组和复制的“混合器”，猪流感病毒不需重组就有最大限度感染人的 能力。而且早期的人流感病毒还可以储存于猪体内，并在一定时期内再次感染人。目前，常见 的猪流感主要有H1N1、H1N2和H3N2等3种亚型。值得重视的是，SIV更多见与其它疫病， 如猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪伪狂犬病毒、传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌、猪附 红细胞体等并发或继发感染，使疫情变得反复而复杂，是现代集约化猪场普遍存在且难以根除 的猪呼吸道传染病之一，对养猪业危害极大。

甲型H1N1流感病毒的流行不仅给很多国家的养殖业造成了巨大的经济损失，而且对世界 范围内的人民公共卫生安全造成了一个很大的挑战。2009年4月爆发于墨西哥的甲型H1N1流 感全球瞩目，随后，美国和加拿大等国也相继出现人感染H1N1猪流感的情况并有部分病人死 亡。在短期内研制有效疫苗来预防甲型H1N1流感病毒抑制疫情传播和加重迫在眉睫。目前国 内生产的用于禽畜预防流感病毒的疫苗大部份是采用传统的鸡胚法培养增殖活病毒，经化学试 剂灭活后生产成疫苗。这种技术又分为两类不同的制备法：一是直接用野生型病毒感染鸡胚制 备，另一类是先采用反向遗传技术改造野生病毒的遗传性，然后用“拯救”改造的新病毒来感 染鸡胚，增殖病毒，生产疫苗。

这些流感疫苗制备技术有其优点，但亦存在着很大的缺陷。尤其是流感感毒的与众不同特 性，例如：高频率突变，双重及多重亚型病毒之间遗传物质重组及抗原漂移等——使这些疫苗 的长期安全性及有效性受到了极大挑战，甚至产生了“无效疫苗”，难以应付新的突变型H1N1 流感病毒的传染。除此以外，这些疫苗制剂还存在着以下不足：

1、生产周期长：从获得新的亚型病毒株到疫苗生产上市，耗时5-8个月，难以遏制新的 疫情大爆发。

2、生产条件高：为预防人为的污染环境及生产的活病毒的泄漏扩散，整套生产必须按规 定在生物安全三级实验室条件下进行，病毒的灭活必须保证完全，彻底。

3、无法区别被免疫过的猪只与受病毒感染的猪只。

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)又称 为猪蓝耳病(Blue ear disease)，其病原为猪蓝耳病病毒(PRRSV)，是一种小的囊膜单股正 链RNA病毒。于1987年首先暴发于美国(Keffaber，1989；Zeman et al，1993)，主要表现为妊 娠娠母猪发生早产、流产、产死胎、弱仔和木乃伊胎，仔猪和育肥猪发生呼吸道疾病，死亡率 升高，饲料报酬率降低。随之加拿大、德国、荷兰等北美洲及欧洲国家也先后报道发生该病 (Bilodeau et al，1991；Wensvoort et al，1991)。自1991年起，亚洲地区的我国台湾省、 日本、韩国、菲律宾等亦相续报道了该病(Albina et al，1997a；Blahs et al，2000)。我 国大陆于1996年首次报道此病并分离到病毒(郭宝清等，1996)，随后该病在我国呈蔓延趋势 (蔡雪晖等，2000)。2006年5月份一种所谓的猪“高热病”在我国爆发，并迅速蔓延到全国， 给我国养猪业造成了巨大的经济损失，后来“高热病”被证明就是PRRS(Tian et al，2007)， 是由PRRSV变异株引起的，现称为“高致病性蓝耳病”。

同多数病毒性疾病的防制相同，对PRRS的防制仍以疫苗免疫预防为主。目前PRRS主要商 品化疫苗是灭活苗和弱毒苗两种常规疫苗，使用后虽均可减轻临床症状，但不能阻止强毒感染 和病猪的排毒及持续性感染的发生。但目前使用的PRRS商用常规疫苗弱毒疫苗及灭活疫苗因 存在安全隐患或免疫效果差的缺陷而不能提供理想的免疫保护。特别危险的是，PRRSV具有抗 体依赖增强的特点，就是在猪体内存在抗体的情况下，PRRSV感染能使猪群发病率和死亡率提 高，造成更大的损失。因此，研究高效、安全、可靠的疫苗显得非常必要。

病毒样颗粒(VLPs)是含有某种病毒的一个或多个主要结构蛋白，在体外表达系统中自动 组装成的不包含病毒核酸的空心颗粒，它的形态和大小与真实的病毒粒子相同或相似，所以能 有效的诱导机体免疫系统产生免疫保护反应，作为一种新型疫苗病毒样颗粒(VLPs)显示出了 良好的良好的免疫效力和应用前景。典型的H1N1 SIV粒子呈球形或椭圆形，直径80～120nm， H1N1流感病毒的基因组8个基因片段共编码11种蛋白，病毒的外壳是一层由脂质及脂蛋白构 成的膜，包裹着病毒的遗传物质及核蛋白。共有4种蛋白质，属于病毒主要结构蛋白，它们是： 基质蛋白M1，形成病毒外壳的主体蛋白；核蛋白NP，形成病毒粒子核衣壳，参与病毒粒子形 成；红细胞凝集素HA，病毒外壳表面膜上的主要糖蛋白，共有16个亚型。是诱发宿主机体产 生抗体的主要抗原体。神经氨酸苷酶NA，亦是病毒外壳表面膜上的一种糖蛋白，共有9个亚 型，同样是诱发抗体产生的主要抗原体。

流感毒的表面膜蛋白HA和NA是引起机体产生免疫应答的主要抗原，而基质蛋白M1是形 成病毒外壳的主要成分，亦可作为组织型免疫应答的抗原。有关研究证明，基质蛋白M1的正 确表达，是保证病毒外壳形成的重要环节，而膜蛋白NA的功能之一是把病毒实体从宿主细胞 表面剥离下来，形成病毒颗粒，因此禽流感病毒的结构蛋白M1、HA和NA是合成新型抗禽流感 病毒疫苗的核心。蛋白HA、NA和M1等3个主要结构蛋白同时表达就可以自动组装成空心的 没有病毒基因组的病毒样颗粒。另外研究证明流感病毒的型特异性抗原NP蛋白可有效刺激CTL (细胞毒T淋巴细胞)反应，抑制病毒感染，在病毒样颗粒中加入NP蛋白将会在一定程度上 提高这种新型疫苗的细胞免疫水平。

猪流感病毒和猪蓝耳病病毒在猪体内互为影响，同时感染会加重病情。因此开发出一种二 价疫苗同时预防H1N1猪流感和猪蓝耳病病毒的VLPs是本领域技术人员亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种二价疫苗，该疫苗能够同时预防H1N1猪流感和猪蓝耳病 病。

本发明的目的通过下列技术方案得以实现。

本发明提供混合病毒样颗粒包含猪流感病毒的基质蛋白M1，猪流感病毒的表面抗原红细 胞凝集素HA，一个融合膜蛋白，其包含猪蓝耳病病毒GP5蛋白的主要抗原表位的膜外域，流 感病毒的红细胞凝集素HA的跨膜区和膜内区；所述含猪蓝耳病病毒GP5蛋白的主要抗原表位 的膜外域替换流感病毒的红细胞凝集素HA的5’端的大致相同长度的膜外域；在所述混合病 毒样颗粒的表面上同时表达流感病毒的表面抗原红细胞凝集素HA和猪蓝耳病病毒GP5蛋白。

本发明还提供猪流感和蓝耳病二价疫苗，包含所述的混合病毒样颗粒和佐剂。

本发明还提供制备混合病毒样颗粒的方法。

利用包含所述融合蛋白的病毒样颗粒构成的疫苗，可同时预防H1N1猪流感和猪蓝耳病病， 并具有明显的优点和效果：

(1)H1N1猪流感和猪蓝耳病VLP二价疫苗能引起机体免疫系统产生强型应答，免疫力强， 持续时间长，能同时预防H1N1猪流感和猪蓝耳病。

(2)由于病毒样颗粒不含病毒基因组，这种空壳结构的VLPs在免疫动物体内就不会发 生病毒基因与宿主染色体基因整合，而且整个生产过程不接触活的有感染力的病毒，因此非常 安全。对于流感病毒和蓝耳病病毒两种病毒来说，都无病毒扩散之虞。

(3)和一般的基因工程亚单位疫苗比较，因为病毒样颗粒更接近天然病毒的形态和大小， 能刺激机体产生更好的免疫反应，免疫效果更好。

(4)可区别出被人工免疫了的动物与被病毒感染的动物。病毒样颗粒不含流感病毒NS、 PB1、PB2等蛋白，因此进行血清测试时，用病毒样颗粒颗粒疫苗免疫的动物，将不会产生特 异性抗NS或PB的抗体，可以区分是否野毒感染。对于蓝耳病来说，用GP5蛋白之外的任何蓝 耳病病毒结构蛋白如E蛋白、N蛋白等作为检测抗原，都可以区分是否野毒感染。

下面结合附图和具体实施方式进一步详细描述本发明，但本发明不局限于这些实施方式， 任何在本发明基本精神上的改进或替代，仍属于本发明权利要求书中所要求保护的范围。

附图说明

图1为通过不同特异性引物PCR扩增的HA(a1)、NA(a2)、M1(b)、NP(c)、HG(d)基因片 段的电泳图；

图2为重组昆虫杆状病毒表达质粒rBacmid-HA/HF-NA、rBacmid-M1、rBacmid-NP示意图；

图3为病毒样颗粒western blot结果。

图4为病毒样颗粒中的M1蛋白和S1蛋白的间接免疫荧光结果。A、M1抗体为RBITC标记 显示橙色荧光，C、S1抗体为FITC标记显示绿色荧光，B、D为阴性对照。

图5A是蔗糖密度梯度离心纯化后的病毒样颗粒在电子显微镜下的图象，b为a的局部放 大图。

具体实施方式

本发明以Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统为基础，利用H1N1猪流感病毒的基质蛋白M 和核蛋白NP，以及表面膜蛋HA和NA蛋白，共同自动组装构建出H1N1猪流感病毒的病毒样颗 粒(VLP)。在此基础上，构建H1N1猪流感病毒与蓝耳病病病毒的二价VLPs。

首先，将蓝耳病病毒的主要表面抗原基因GP5的部分膜外域替换H1N1流感病毒的HA蛋白 基因的一部分膜外域，二者构成融合基因(HG)，GP5基因位于融合基因HG的5’端，替换相 等长度的HA基因的5’端序列，以保障融合基因的长度与HA基因长度大致相等。

然后，按照形成流感病毒样颗粒的方法，将H1N1流感病毒的基质蛋白M1、核蛋白NP及 表面膜蛋白HA和NA的基因，以及表达猪蓝耳病病毒GP5和流感病毒HA的融合蛋白HG的基因， 构建于昆虫杆状病毒的载体质粒内，并使其重组入昆虫杆状病毒的遗传物质DNA内，利用宿主 昆虫细胞表达这些外源蛋白，自动组装成不含流感病毒遗传物质的病毒样颗粒，病毒样颗粒形 成后将释放入细胞培养液中。这样形成的VLPs既具有H1N1流感病毒的主要表面抗原，又具有 猪蓝耳病病毒的主要表面抗原GP5，为H1N1猪流感病毒与猪蓝耳病病毒二价VLPs。

需要指出的是，有研究表明，不同的膜蛋白在细胞内表达后会被转运到细胞膜的不同微区 域，在细胞膜上的分布主要取决于膜蛋白的跨膜区和膜内域。未经改造的GP5和HA蛋白有可 能在表达后分布于细胞膜的不同微区域，因而当未经改造的GP5和HA蛋白同时表达时，他们 有可能同时整合到同一VLP，但他们在VLP中的含量和比例有很大差异。本发明将GP5蛋白的 部分膜外域融合到缺失部分膜外域的HA上，这样HG融合蛋白和HA蛋白含有同样的HA的部分 膜外域，跨膜区和膜内域；这样保证HG融合蛋白和HA蛋白分布在同一细胞膜的微区域；因此 在VLP的形成过程中，HG融合蛋白和HA蛋白非常可能地被一样有效地整合到VLP上，他们在 VLP中的含量和比例得到保证。

另外，流感病毒的结构蛋白作为二价VLP的骨架是因为我们发现流感病毒VLP高产、稳定； 同时HA蛋白的整合到VLP是高效的；这样可以保证在VLP的表面有足够的HA蛋白，可以作为 有效的疫苗使用。

通过下面给出的具体实施例可以进一步清楚地理解本发明，但下述实施例并非对本发明的 限定。

实施列1：M1、NP、HA、NA和融合基因HG的扩增。

(1)蓝耳病病毒GP5片断与猪流感病毒HA融合基因HG的合成

将蓝耳病病毒的主要结构蛋白基因GP5去掉跨膜区，然后用去掉跨膜区的GP5替换H1N1 流感病毒的HA蛋白基因的一部分，二者构成融合基因(HG)，GP5基因位于融合基因HG的5’ 端，替换相等长度的HA基因的5’端序列，以保障融合基因的长度与HA基因长度大致相等， 其核酸序列见SEQ ID NO：9、其编码的氨基酸序列见SEQ ID NO：10。融合基因根据其核酸序列 SEQ ID NO：9合成。

(2)H1N1亚型猪流感病毒RNA抽提和RT-PCR

按GibcoBRL公司TRIzol LS Reagent RNA提取试剂盒的使用说明书(方法)进行。分别 取250μL禽流感病毒H5N1亚型毒株感染尿囊液和750μL TRIzol LS，加入1.5mL微量离心 管内，用吸管吹打充分混匀，室温放置10min；加入200μL氯仿，剧烈振荡15s，室温静置5 分钟后，4℃下12000rpm离心15min；取上清于一新的灭菌1.5mL离心管内，加入500μL异 丙醇，充分混匀，室温放置10min，在4℃下12000rpm离心10min；倾去上清，沉淀中加入70％ 的乙醇750μL，轻轻混匀，洗涤一次，4℃下12000rpm离心15min，弃去上清，风干；加入 10μL用DEPC水处理的无RNA酶的三蒸水溶解病毒RNA(沉淀)，直接用于RT-PCR或-80℃保 存备用。参照TaKaRa的AMV反转录酶的使用说明进行，在20μL反应体系中分别加入以下组分： RNA：3μL；5×RT buffer：4μL；dNTPs：4μL；RNA酶抑制剂：0.5μL；引物UP：1μL； 引物DN：1μL；AMV：2μL；DEPC水：补至20μL。混匀后，室温放置10min，42℃保温1h， 冰浴2min，RT产物直接用于PCR扩增或-20℃保存。

(3)M1、NP、HA、NA、HG基因的PCR扩增

根据HA基因序列(序列1和序列2)设计的1对引物，用于扩增HA基因，其两端分别加 上了Xho Ⅰ和Nco Ⅰ/酶切位点，位于P10启动子下，引物序列如下：

HA Xho Ⅰ：5’-5’GCCCTCGAGATGAAGGCAATACTAGTG-3’(SEQ ID NO：11)

HA Nco Ⅰ：5’-GCCCCATGGTTAAATACATATTCTGCACTG-3’(SEQ ID NO：12)

根据NA基因序列(序列3和序列4)设计的1对引物，用于扩增NA基因，其两端分别加 上了Sal Ⅰ和HindⅢ的酶切位点位于P_PH启动子下，这2个引物序列分别是：

NA Sal Ⅰ：5’-GCCGTCGACATGAATCCAAACCAAAG-3’(SEQ ID NO：13)

NA HindⅢ：5’-GCCAAGCTTCTACTTGTCAATGGTG-3’(SEQ ID NO：14)

根据M1基因序列(序列5和序列6)设计的1对引物，用于扩增M1基因，其两端分别加 上了Sal Ⅰ和HindⅢ的酶切位点位于P_PH启动子下，这2个引物序列分别是：

M1 Sal Ⅰ：5’-GCCGTCGACATGAGTCTTCTAACCGAG-3’(SEQ ID NO：15)

M1 HindⅢ：5’-GCCAAGCTTTCACTTGAATCGTTG-3’(SEQ ID NO：16)

根据NP基因序列(序列7和序列8)设计的1对引物，用于扩增NP基因，其两端分别加 上了Xho Ⅰ和Nco Ⅰ/酶切位点，位于P10启动子下，引物序列如下：

NP Xho Ⅰ：，5’-AGTCTCGAG ATGAGTGACATCGGAGCCAT-3’(SEQ ID NO：17)

NP Nco Ⅰ：5’-CATGCCATGGTTAATTGTCATACTCCTCTGCATTG-3’(SEQ ID NO：18)

根据融合基因HG的序列(序列9和序列10)，设计的1对引物，用于扩增融合基因HG， 其两端分别加上了Xho Ⅰ和Sph I酶切位点，位于P10启动子下，引物序列如下：

HF Xho I：5’-CCGCTCGAGATGGTTCCGTCTCGTG-3’(SEQ ID NO：19)

HF Sph I：5’-ACATGCATGCTTAAATACATATTCTGCACTG-3’(SEQ ID NO：20)

采用M1、NP、HA、NA、HG各自特异性引物，将反转录的产物或合成的DNA片断直接用作 PCR扩增M1、NP、HA、NA、HG基因的模板。PCR反应条件为94℃预变性3min，94℃变性40S， 56℃退火90s，72℃延伸90s，循环30次，最后延伸10min，PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶(含 0.5ug/ml溴化乙锭，EB)电泳检测。PCR扩增的HA基因的长度约1.7Kb(图1a)，NA基因的 长度约1.35Kb(图1a)，M1基因的长度约0.75Kb(图1b)，NP基因的长度约为1.5Kb(图1c)， 融合基因HF的长度约为1.7Kb(图1d)。所有的PCR产物样品经电泳凝胶抽提后，获得纯化的 M1、NP、HA、NA、HF基因DNA片段，经限制性内切酶Xho Ⅰ/NcoI(消化HA片段)、Sal/HindⅢ (消化NA片段)，Xho Ⅰ/NcoI(消化NP片段)、Sal Ⅰ/HindⅢ(消化M1片段)、Xho I/Sph I (消化HG片断)37℃分别消化后，再进一步纯化，以备下一步构建重组质粒用。具体操作如下： 制备1％琼脂糖凝胶含0.5ug/ml溴化乙锭，将所有PCR样品加入凝胶的样品槽内，设置电压 100V，电泳时间40min在长波紫外灯下，切下含有样品带的凝胶条，装入小塑料离心管中。参 照胶回收试剂盒(Qiagen公司产品)说明书，抽提纯化M1、NP、HA、HG和NA基因DNA片段。 经限制性内切酶37℃过夜消化后，用胶回收试剂盒(Qiagen公司产品)，按照说明指导，离心 过柱，纯化回收酶切消化后的M1、NP、HA、NA、HG片段。

实施例2：构建表达M1、NP、HA、NA、HG基因的昆虫杆状病毒表达质粒及在昆虫细胞中合成 重组的昆虫杆状病毒

(1)构建表达M1和NP基因的重组质粒

昆虫杆状病毒质粒PFastBac-dual(Invitrogen公司产品)经限制性内切酶Sal Ⅰ/ HindⅢ37℃酶切3小时后，用胶回收试剂盒回收纯化酶切后的质粒PFastBac-dual。在T4DNA 连接酶的作用下，酶切后的质粒与酶切后的M1DNA片段于16℃连接过夜。反应体系如下：10×T4 连接缓冲液1ml，M1酶切回收的DNA片段3ml，酶切PFastBac-dual质粒回收产物1ul，T4DNA 连接酶1ul，ddH20补至10ul。采用热休克方法将连接产物转导入Top10感受态细胞中加入到 于一小塑料离心管中，轻轻混合后将小管置于冰上30min，转入42℃水浴中热休克90s，迅速 放回冰上5分钟，想其中加入200ulLB培养液。37℃摇床培养1小时。取100ul菌液涂布于 LB固体培养基(含有氨苄和庆大霉素两种抗生素)上，37℃培养16h，从平板上挑取阳性克隆 菌落，进行菌液PCR，抽提质粒后用Sal Ⅰ/HindⅢ进行单双酶切鉴定。DNA序列测定后，获 得重组质粒PFastBac-dualM1。

表达NP基因的重组质粒PFastBac-dualNP的构建方法同上。

(2)构建表达HA/HG和NA基因的重组质粒

昆虫杆状病毒表达质粒PFastBac-dual经限制性内切酶Xho Ⅰ/Nco Ⅰ酶切后，在T4 DNA 连接酶的作用下，将被同样的内切酶消化后的HA基因DNA片段插入到P10启动子的下方，此 连接产物随后经热体克法转导入Top10感受态细胞中，培养、抽提数个阳性克隆菌落的重组质 粒DNA，菌液PCR和Xho Ⅰ/Nco Ⅰ酶切鉴定及DNA序列测序确定无误后，挑选其中的1个重组 质粒DNA，进行第二次酶切。所用的限制性内切酶为Sal Ⅰ/HindⅢ。用同样的内切酶酶切NA 基因DNA片段，并将其插入到重组质粒的另一个启动子P_PH的下方，经转化、筛选、培养、抽 提，获得二度重组的质粒。DNA测序后，即为所需的重组昆虫杆状病毒表达质粒 PFastBac-dual-HA-NA。整个实验操作步骤及条件与上述构建PfastBac-dualM1质粒所述相同。

同时表达融合基因HG和NA基因的重组质粒PFastBac-dual-HG-NA的构建方法同上。

(3)重组昆虫杆状病毒基因组的合成及提取

将纯化的重组PfatBac-dual-M1、PfatBac-dual-NP、PFastBac-dual-HA-NA和 PFastBac-dual-HG-NA质粒分别转导入特殊的E.coli感受态细胞株DH 10 Bac细胞中(美国 Invitrogen公司产品)。DH10Bac细胞含有一特殊的大分子质粒Bacmid，其内包含有昆虫杆状 病毒AcMNPV的全部基因组。一旦重组的表达质粒整合入大分子质粒Bacmid的特别位点后，经 3种抗菌素(庆大霉素、四环素和卡那霉素)的筛选及IPIG的诱导和X-Gal底物反应进行蓝 白斑筛选，阳性克隆菌落呈白色，而非重组的野生菌落呈兰色。实验条件均按照Invitrogen 公司提供的实验手册指导而设定。挑选的阳性克隆置于3ml的LB培养液中(含上述3种抗生 素)，经37℃摇床培养24小时，按照实验手册标明的大分子质粒Bacmid小量制备法，提取纯 化带有M1基因、NP基因、HA-NA或HG-NA基因的重组大分子质粒Bacmid。

(4)重组昆虫杆状病毒的制备

将昆虫细胞株sf9细胞(美国Invitrogen公司产品)培养于无血清的sf-900II昆虫细胞 培养液中(Invitrogen公司产品)，温度设置为27℃，根据Invitrogen公司提供的实验手册， 采用脂质体转染法，将纯化的重组大分子质粒Bacmid与脂质溶液cellfectin(Invitrogen公 司产品)混合，转染入sf9细胞中，27℃培养4至5天后，收集细胞培养上清液，3000rpm离 心10分钟收集上清液，获得低滴度的重组昆虫杆状病毒，再用此上清液感染新培养的sf-9 细胞；3天后收集细胞培养上清液，即为所需的放大培养后的高浓度重组昆虫杆状病毒，命名 为Bac-M1，Bac-NP、Bac-HA-NA和Bac-HG-NA。对获取的用于放大培养和蛋白表达的重组昆虫 杆状病毒进行蚀斑实验，确定病毒的噬斑形成单位(plaque forming units，PFU)。

1)用含10％FBS的Grace’s培养基将Sf9细胞传代接种到六孔培养板中，细胞密度为约 1×10⁶个cells/ml，每孔加2ml(6孔板)，轻轻混匀室温使细胞贴壁1小时以上。

2)将P3代种毒液用不含FBS的Grace’s培养基做10倍倍比稀释待用。

3)弃去六孔板中的培养基，用不含血清的培养基清洗细胞3次，然后将上述稀释好的重 组病毒液加入孔中，每个稀释度做两个复孔，室温下感染1小时。

4)制备覆盖液(以下为一块六孔板的量)：7ml 2×Grace’s medium+140μl的双抗+7ml 2％的高压灭菌agarose胶+1.4ml FBS，轻轻地混匀，然后将瓶再放置42℃水浴，病毒感染1h 后吸尽每孔中的病毒液，并快速用上述制备的覆盖液覆盖细胞。

5)待琼脂糖凝固后将六孔板用保鲜膜包好并置于27℃培养箱中培养3-5天。

6)加入1ml浓度为1mg/ml的中性红，室温孵育2小时后吸去染液，观察到重组病毒 形成的近似透明的小点即为空斑。计算统计观察病毒空斑的形成情况(PFU)。

用于放大培养重组杆状病毒Bac-M1，Bac-NP、Bac-HA-NA和Bac-HG-NA的细胞离心沉淀物， 经细胞裂解缓冲液处理后，4℃离心(13,000rpm)10分钟(或者将细胞在冰浴的情况下进行 超声波破碎)，收集上清液，进行SDS-PAGE凝胶电泳，分析基质蛋白M1(或者NP、HA、HG和 NA蛋白)是否在昆虫细胞Sf9中表达。简单而言，将10ul上清液样品中加入10ul的2XSDS上 样缓冲液，100℃处理5min后，10000rpm离心5分钟，将所有20ul的上清样品加入4％-12％SDS- 聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen公司产品)的点样孔中。设置电泳条件为恒定电压100V，温度 为4℃，电泳时间约3小时。待指示液溴酚兰接近凝胶底部时，停止电泳。凝胶置于1％R型 考马斯亮蓝染色液中，摇晃染色1小时，然后置于脱色液中脱色过夜。

实施例3：M1、NP、HA、HG和NA基因在共同转染的悬浮培养的昆虫细胞sf-9中的表达

将200ml sf-9细胞混合液悬浮培养于1升体积的三角摇瓶中，细胞培养液为无血清的 sf-900II(或Invitrigen公司的Grace insect medium)，摇床的摇速为100rpm，温度恒定于 27℃。当细胞浓度达到2×10⁶细胞/ml时，用Bac-M1、Bac-NP、Bac-HA-NA、Bac-HG-NA昆 虫杆状病毒共同转染sf9细胞。病毒的MOI比例为3(Bac-M1和Bac-NP)：1(Bac-HA-NA)：1 (Bac-HG-NA)。转染的细胞经恒温摇动培养3天后，收集所有样品，4℃离心30分钟，离速 为3000rpm，收集上清液。离心下来的细胞沉淀物用细胞裂解液处理后，4℃离心10分钟，离 速10,000rpm。保留离心后的上清液。实验进行的同时构建合成的野生型昆虫杆状病毒用于转 染悬浮培养的sf-9细胞，MOI为5。作为设置的阴性对照，转染后的细胞培养、样品的收集及 细胞裂解的条件与步骤与上述实验一样。收集的所有样品，用于Western blots分析。其实验 操作如下：每个样品(包括阴性对照)分别取10ul的细胞裂解抽提液及细胞培养上清液，再 各自加入10ul的2×SDS上样缓冲液。100℃处理5min后，将所有20ul的混合样品加入4％-12％ SDS聚丙烯酰胺凝胶的点样孔中。设置恒定电压120V，温度为4℃，时间3小时，当蓝色指示 剂溴酚兰完全靠入凝胶底端时，停止电泳，取出凝胶。剪一张与凝胶相同大小的硝酸纤维素膜 (PVDF膜)及两张滤纸，PVDF膜用甲醇浸泡5分钟后与凝胶、滤纸一起浸入预冷2小时以上 的转移缓冲液中，按滤纸——凝胶——硝酸纤维素膜——滤纸的顺序安装入转印夹。将夹中靠 近凝胶的一侧接负极，恒压25V转移电泳1h.用镊子夹取出硝酸纤维素膜，用PBS-T漂洗液洗 涤，而后转移至5％的脱脂奶粉/PBS溶液中，摇荡封闭1小时。用PBS-T漂洗液洗涤3次，每 次3分钟；然后将硝酸纤维素膜转入一塑料袋中，加入3ml以1∶500稀释于5％脱脂奶粉/PBS 中抗H1N1猪流感病毒鸡源多克隆抗体(一抗)，置于4℃平缓摇动过夜。翌日，取出纤维素膜， 用PBS-T漂洗液洗涤3次，每次10分钟，将此硝酸纤维素膜再装入另一新的塑料袋中，加入 5ml以1∶10000稀释于5％脱脂奶粉/PBS中的辣根过氧化物酶标记的驴抗鸡IgG(二抗)，室温 下摇动温育1h。弃二抗，PBS-T漂洗纤维素膜3次，每次10分钟，将漂洗后的硝酸纤维素膜 移至一平皿中，加入DAB第五显色液，可见在各自相对应的分子量位置上，M1、NP、HA/HG和 NA的特异性条带。说明M1，NP，HA/HG和NA在转染的悬浮培养的SF-9昆虫细胞中有效地表 达了。

实施例4：病毒样颗粒的纯化及间接免疫荧光检测和电镜观察。

将上述离心收集的细胞上清液装入13ml的超速离心管内，称重、平衡、封管后，放入超 速离心机(Bechmem公司产品)内，4℃100,000rpm离心1小时，然后取出离心管，小心倒掉 上清液，保留离心管底的深沉物。加入5ml的PBS，放入4℃冰箱内，溶解24小时。次日，在 另一个13ml的超速离心管内，先小心地加入1ml 60％的庶糖溶液，然后依次加入1ml30％及3ml 20％的庶糖溶液，最后将5ml的溶解后的样品液置于其上。精确称重、平衡后，封管上超速离 心机。4℃100,000rpm离心1小时。取出离心管，分别收集位于20％与30％及30％与60％浓度交 界处的二条带，即纯化的病毒样颗粒。Weatern blots分析纯化浓缩后的病毒样颗粒样品。其 操作步骤与上述实施例3中Western blots分析一样，只是将所取的样品进行了稀释，即1ul 的病毒样颗粒样品，加入9ul的水，再加入10ul的2×SDS上样缓冲液。100℃变性5min后， 上样入4％-12％聚丙烯酰氨凝胶样品槽内，Western blots结果显示，从这二条带所获得的大 分子颗粒，的确是由M1、NP、HA/HG和NA构成的病毒样颗粒。尤其是从30％与60％浓度交界处 取得的似病毒颗粒含量大，特异性条带浓度深。说明转染后，病毒样颗粒在宿主细胞中有效地 自我组装，并释放入细胞培养上清液中，进一步的间接免疫荧光实验和电镜结果证实了这一点 (图4、图5)。

间接免疫荧光实验操作步骤如下：将sf9细胞种到24孔板中，每孔10万细胞，将VLP按 照MOI＝3的感染复数对所种细胞进行感染，感染72小时后，用PBS将细胞洗涤3次，每次5 分钟，然后加入100％预冷的甲醇-20°固定细胞10分钟，再加入0.05％的Triton x-100室温 处理10分钟，加入3％的BSA四度封闭过夜，第二天用PBS将细胞洗涤3次，每次5分钟，然 后向孔中加入RBITC标记的A型流感特异的M1单克隆抗体，或者FITC标记的抗GP5的单抗， 37°反应1小时，反应结束后用PBS将细胞洗涤3次，每次5分钟，洗涤结束后在荧光显微镜 下观察。用抗M1的单抗和GP5的单抗进行免疫电镜观察，可以看到荧光标记的病毒样颗粒， 其中抗M1的抗体为RBITC标记，显示橙色荧光(图4A)，抗GP5的抗体为FITC标记，显示 绿色荧光(图4C)，而对照没有荧光信号((图4B、D)。

电镜拍片实验操作如下：将少量的纯化浓缩后的似病毒颗粒样品固定处理后，置于新制备 的无负荷的塑胶/碳包被网络格上，用数滴蒸馏水轻轻冲洗几次后，加上2％磷钨酸钠溶液进行 负染色。电子透视显微镜下观察并拍片，如图5所示，病毒样颗粒的外观及体积大小相近。

实施例5：H1N1猪流感和猪蓝耳病二价VLPs免疫小鼠

BALB/C小鼠购自中山大学动物实验中心，各组免疫动物具体免疫实施方式见表1。6-8周 龄的SPF BALB/C小鼠在免疫3次后15天眼球取血，各组小鼠血清用来检测IgG抗体水平和 HI抗体水平。H1N1猪流感IgG采用IDEXX公司H1N1流感抗体ELISA试剂盒检测，蓝耳病IgG 抗体IDEXX公司PRRSV抗体ELISA试剂盒检测检测，用OD₄₅₀值表示抗体水平。HI抗体检测采 用HI实验参照甘孟侯(第二版，中国农业出版社)进行。结果表明，H1N1猪流感和蓝耳病二 价VLPs免疫6-8周龄BALB/C小鼠，免疫小鼠血清中既有抗H1N1猪流感的抗体(表2、表3)， 也产生了抗蓝耳病病毒的抗体(表3)。

表1 H1N1猪流感和猪蓝耳病二价VLPs免疫BALB/C小鼠实验方案

表2 H1N1猪流感和猪蓝耳病二价VLPs免疫BALB/C小鼠血清HI检测结果

表3 H1N1猪流感和猪蓝耳病二价VLPs免疫BALB/C小鼠血清中特异性IgG检测结果

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的 限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。