干扰素治疗慢性丙型肝炎转归预测蛋白芯片

【技术领域】

本发明涉及一种蛋白质芯片，具体来说涉及一种慢性丙型肝炎转归预测蛋白 质芯片。

【背景技术】

丙型肝炎病毒(HCV)感染是当前最重要的病毒感染性疾病之一。全球约 1.7亿人慢性感染HCV，慢性HCV感染可能进一步发展为肝硬化甚至肝癌。由 于当前尚无有效疫苗，目前每年仍新增三到四百万HCV感染者。干扰素α(IFN-α) 和利巴韦林联合治疗是目前最为有效的治疗方法，但其需要皮下注射用药，用药 周期很长，治疗费用昂贵，有多种药物副作用等不利因素；而干扰素治疗后的 HCV持续病毒学应答仅约50％。因此发现可以对IFN-α治疗慢丙肝的预后进行 预测判断的因素，无疑有助于减轻患者医疗痛苦和经济负担^[1]。

蛋白质芯片是一种高通量的蛋白功能分析技术，可用于蛋白质表达谱分析， 研究蛋白质与蛋白质的相互作用，甚至DNA-蛋白质、RNA-蛋白质的相互作 用，筛选药物作用的蛋白靶点等。蛋白芯片技术的基本原理是将各种蛋白质有序 地固定于滴定板、滤膜和载玻片等各种载体上成为检测用的芯片，然后，用标记 了特定荧光抗菌素体的蛋白质或其他成分与芯片作用，经漂将未能与芯片上的蛋 白质互补结合的成分洗去，再利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术，测定芯片 上各点的荧光强度，通过荧光强度分析蛋白质与蛋白质之间相互作用的关系，由 此达到测定各种蛋白质功能的目的。为了实现这个目的，首先必须通过一定的方 法将蛋白质固定于合适的体上，同时能够维持蛋白质天然构象，也就是必须防止 其变性以维持其原有特定的生物活性。

【发明内容】

本发明的目的是提供一种蛋白质芯片，用于预测干扰素治疗慢性丙型肝炎效 果。

干扰素抗病毒生物学功能的发挥主要依赖于干扰素信号通路激活后下游各 种干扰素刺激基因(Interferon stimulate gene，ISG)的表达。I型干扰素与细胞表 面受体结合后，通过激活JAK-STAT通路诱导下游干扰素刺激基因ISG的表达， 而ISG在抑制病毒复制中可能起直接作用。病毒生活周期中的病毒进入细胞、 转录、RNA定植、翻译、病毒成熟、装配及释放等多个环节，均可能成为IFN 的作用靶点。既往的基因芯片分析显示IFNα诱导表达ISG数量可达近千个。对 当前可查及的一些数据，如黑猩猩HCV感染模型、HCV感染者的肝组织样本和 IFN-α处理的Huh7细胞检测的综合分析显示数十个ISGs的表达可能与HCV的 清除有较密切相关^[2-5]。而既往经证实对HCV复制有调节作用的ISG有以下几个： ①2，5’-OAS/RNase L通路可降解HCV RNA^[6]；②PKR可抑制HCV RNA的翻 译过程^[7]。③近年研究显示Viperin通过其N末端的α双性分子定位于脂滴，通 过SAM区抑制HCV RNA复制^[5，8]。④ISG56可抑制病毒蛋白的翻译而降低病 毒水平^[9]；⑤ISG20通过其外切酶活性减少HCV RNA的水平^[10]。⑥ISG15和 USP18可促进HCV的复制，并削弱了IFNa和利巴韦林联合治疗清除HCV的能 力，siRNA敲除其表达可有助于加强IFN抑制HCV RNA复制的能力^[11，12]。⑦我 们研究发现BST2可以抑制HCV病毒的释放。

上述体内外研究揭示了ISG与HCV清除的相关性，但这些ISG在临床上干 扰素治疗慢性丙肝患者中的意义并不明确。通过对临床样本的随访研究，我们发 现干扰素治疗慢性丙肝患者肝组织或者外周血单个核细胞中以下13个ISG基因 (表一)在治疗前后的蛋白水平的表达改变，在治疗早期或治疗前预测IFN治 疗的长期疗效有预测价值。

表一对干扰素治疗慢性丙肝预后有预测功能的干扰素刺激基因列表

注：上述ISG的蛋白序列见所附序列表。

据表一中的基因列表，购买合适的抗体，并将之点样至基质上制成高通量 的蛋白芯片。

采慢性丙肝患者治疗前和干扰素治疗早期(如第1周)的外周血单个核细 胞，用液氮快速多次冻融后离心法提取细胞蛋白；或者在治疗前分离慢性丙肝患 者的外周血单个核细胞行体外细胞培养，并进行干扰素诱导处理2天或不处理 (对照组)，用液氮快速多次冻融后离心法提取细胞蛋白。

将待测样品蛋白与蛋白芯片上的抗体列阵进行杂交。再用荧光染料标记的 抗体进行二次杂交，信号用专用激光扫描仪进行分析，并用专用软件记录分析后 得出检测结果。由于在蛋白芯片列阵中某一特定位置上的探针是已知的，所以对 微列阵每一位点的强度进行检测，即可对ISG蛋白表达进行定性定量分析。

对得到的治疗前后或诱导前后样本中ISG蛋白表达水平及其改变的结果， 并进行如下述标准的评分计算处理。根据评分结果进行预测干扰素治疗后获得持 续抗HCV应答的概率评估。

A：评分标准：

除ISG15、UPS18和STAT1以外的各ISG：

蛋白表达水平变化值(治疗后/治疗前或IFN处理后/处理前)

＞＝3以3分计值

1-3分以实际分数计值

ISG15和USP18：

蛋白表达信号水平(治疗前或IFN处理前，以Actin水平为内参，ISG15或 US P18/Actin＞1/5为高水平，1/5～1/10为中等水平，＜1/10为低水平)。

高水平表达：1分

中等水平表达：2分

低水平表达：3分

磷酸化STAT1的水平：

蛋白磷酸化水平变化值(治疗后/治疗前或IFN处理后/处理前)

＞＝3以3分计值

1-3分以实际分数计值

B：持续抗HCV应答的概率评估

对表一13个ISG表达计算分值进行加法计算。

通过大量的实验，发明人发现如下现象：

总分值33-39分：一年后HCV持续清除概率为80-100％

总分值＞26-32：一年后HCV持续清除概率为50-80％

总分值＞20-25：一年后HCV持续清除概率25-50％

总分值＞13-19：一年后HCV持续清除概率＜25％

本发明的有益效果是：

1、应用此项发明，在患者应用干扰素治疗的早期或治疗前，即对干扰素治 疗的长期疗效进行预测。有助于慢性丙肝患者治疗方案的优化和选择，减少患者 痛苦和治疗费用。

2、蛋白芯片具有高通量，检测方便的特点，便于临床应用。

【具体实施方式】

下面通过具体的实施例来对本发明进行进一步的说明。

实施例：

12例慢性丙型肝炎患者在长效干扰素加利巴韦林治疗前取抗凝血10ml， Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，分离后的单个核细胞平均分为对 照组和实验组。对照组用DMEM培养基普通培养48h，实验组用DMEM培养基 普通培养含100U/ml的IFNα处理48小时，提取上述样本的蛋白。

用蛋白芯片进行检测，获得实验组和对照组ISG相对表达水平的变化值， 并按上述评分标准对ISG总分值进行评估如表二所示，其中：

5例患者蛋白质芯片的ISG表达总分值为33-39分(组1)，预测其在一年的 长效干扰素加利巴韦林治疗后能获得持续病毒学应答概率大于80％。

4例患者蛋白质芯片的ISG表达总分值为26-32分(组2)，预测其在一年的 长效干扰素加利巴韦林治疗后能获得持续病毒学应答概率50-80％。

3例患者蛋白质芯片的ISG表达分值为总分值13-19(组3)：预测治疗一年 后HCV持续清除概率＜25％。

治疗一年后跟踪随访一年，以定量PCR的HCV RNA检测拷贝数(检测下 限为500拷贝/ml)为预后判断指标。组1共有4例患者获得持续病毒学应答， HCV RNA结果低于检测下限，其持续病毒学应答率为80％；组2共有2例患者 获得持续病毒学应答，其持续病毒学应答率为50％。组3无持续病毒学应答患者， 其应答率为0％。随访结果符合预测结果。

主要参考文献

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