变异型酶的设计法、制备方法和变异型酶

技术领域

本发明涉及对蛋白质进行脱酰胺化的变异型酶的设计法、制备方法和变异型酶等。 

背景技术

蛋白质脱酰胺酶是水解蛋白质中的谷氨酰胺、天冬酰胺的酰胺基，转变为谷氨酸、天冬氨酸，而游离氨的酶。蛋白质脱酰胺酶可以适用于提高蛋白质的功能性(溶解性、乳化特性、泡沫特性、凝胶化特性等)、提高小麦麸质的生面团(ドウ)的伸展性、降低小麦变应原诱发性、提高从农产物中提取蛋白质的提取效率、提高蛋白质溶液中的钙溶解性等各种用途，是一种产业上利用性很高的酶。

蛋白质脱酰胺酶广泛存在自然界中。作为最为熟知的例子，可以列举微生物来源的蛋白质谷氨酰胺酶(专利文献1、2)。据报道，植物中，发芽中的小麦、菜豆、南瓜的种子中存在将蛋白质中的谷氨酰胺残基脱酰胺的酶(非专利文献1)。而且，已知的是生物体内也含有，而且在自然界中也广泛存在，例如，近年来作为食品加工用酶被广泛使用的放线菌来源的谷氨酰胺转移酶催化蛋白质中的谷氨酰胺残基和赖氨酸残基之间的交联反应，在反应系中不存在赖氨酸等伯胺时，对蛋白质中的谷氨酰胺残基进行脱酰胺化(非专利文献2)。而且，据报道，在其它微生物中，细菌(Bacillus circulans)的菌体内存在对肽中的谷氨酰胺残基进行脱酰胺化的酶，即肽谷氨酰胺酶(非专利文献3)。 

在利用蛋白质脱酰胺酶时，与其它酶一样，根据用途调节底物和酶的浓度、反应温度、反应时间等。可是，存在着只通过调节这种酶反应条件，无法制造出目的生成物的情况、无法获得所期待的收量的情况，对蛋白质脱酰胺酶的性质本身进行改良的必要性就产生了。而且，作为产业用酶剂利用时，保存稳定性十分重要，然而，由于一般来说，酶对氧的稳定性低，因此为了维持充分的保存稳定性，需要添加稳定化剂或脱气状态下的包装等，这关系到成本增加。 

为了改变蛋白质脱酰胺酶的性质，一般需要制备蛋白质脱酰胺酶的变异体，评价其活性、底物特异性等，鉴定优良的变异体，但这些工序需要很大的劳力。 

专利文献 

专利文献1：特开2000-50887号公报 

专利文献2：特开2001-218590号公报 

专利文献3：特开2004-97099号公报 

非专利文献 

非专利文献1：Vaintraub，I.A.，Kotova，L.V.&Shaha，R.(1996)Protein deamidases from germinating seeds.Physiol.Plantarum.96，662-666. 

非专利文献2：「産業用酵素」(1995)上岛孝之、丸善、3.2.6食品功能的改良「谷氨酰胺转移酶的利用」pp.40-42 

非专利文献3：Kikuchi，M.，Hayashida，H.，Nakano，E.&Sakaguchi K.(1971)Peptidoglutaminase.Enzymes for selectivedeamidation ofγ-amido of peptide-boundglutamine.Biochemistry 10，1222-1229. 

发明内容

本发明的目的之一是提供改良对蛋白质进行脱酰胺化的酶的新方法。此外，本发明的另外的目的是提供作用性和稳定性得到改良的变异型酶。作用性的变化可以使得酶使用量降低、使反应时间缩短、扩大用途等。另一方面，稳定性的改良可以提供保存稳定性高的酶剂。 

鉴于以上课题进行了积极研究，结果本发明人通过运用X射线结晶构造分析技术，在解朊金黄杆菌(Chryseobacterium proteolyticum)9670株(FERM BP-7351)来源的蛋白质谷氨酰胺酶中，获得了与底物的识别相关的重要认识，和与活性部位及其附近区域相关的重要认识。即，在成功实现该蛋白质谷氨酰胺酶的成熟体和前体的结晶化的同时，还成 功获得了其立体构造信息，弄清楚了活性部位和底物口袋。由此确定被认为与底物识别有关的氨基酸。而且，还弄清楚了活性部位的氨基酸，明确了其附近的被认为影响活性中心的氨基酸的侧链的电子状态的氨基酸残基。而且，还基于构造分析的结果，尝试改变酶的性质，结果成功地改变了底物特异性，并提高了稳定性。 

本发明主要是基于以上成果，提供以下的变异型酶的设计法等。 

[1]变异型酶的设计法，包含以下步骤： 

(1)蛋白质脱酰胺酶(变异对象酶)的氨基酸序列中，确定从以下氨基酸组成的组中选择的一个或两个以上的氨基酸的步骤：即相当于序列号2所示的氨基酸序列的35位氨基酸的氨基酸、相当于38位氨基酸的氨基酸、相当于39位氨基酸的氨基酸、相当于40位氨基酸的氨基酸、相当于41位氨基酸的氨基酸、相当于42位氨基酸的氨基酸、相当于43位氨基酸的氨基酸、相当于45位氨基酸的氨基酸、相当于46位氨基酸的氨基酸、相当于49位氨基酸的氨基酸、相当于79位氨基酸的氨基酸、相当于80位氨基酸的氨基酸、相当于81位氨基酸的氨基酸、相当于82位氨基酸的氨基酸、相当于83位氨基酸的氨基酸、相当于84位氨基酸的氨基酸、相当于103位氨基酸的氨基酸、相当于104位氨基酸的氨基酸、相当于105位氨基酸的氨基酸、相当于106位氨基酸的氨基酸、相当于117位氨基酸的氨基酸、相当于142位氨基酸的氨基酸、相当于143位氨基酸的氨基酸、相当于146位氨基酸的氨基酸、相当于166位氨基酸的氨基酸、和相当于185位氨基酸的氨基酸； 

(2)构建基于变异对象酶的氨基酸序列，将在步骤(1)确定的氨基酸取代为其它氨基酸或删除而得到的氨基酸序列的步骤。 

[2]如[1]所述的变异型酶的设计法，在步骤(1)中，确定出选自于以下氨基酸中的一个或两个以上的氨基酸：即相当于序列号2所示的氨基酸序列的39位氨基酸的氨基酸、相当于40位氨基酸的氨基酸、相当于41位氨基酸的氨基酸、相当于43位氨基酸的氨基酸、相当于79位氨基酸的氨基酸、相当于80位氨基酸的氨基酸、相当于81位氨基酸的氨基酸、相当于82位氨基酸的氨基酸、相当于142位氨基酸的氨基酸、相当于143位氨基酸的氨基酸、相当于146位氨基酸的氨基酸、相当于166 位氨基酸的氨基酸、和相当于185位氨基酸的氨基酸。 

[3]如[1]所述的变异型酶的设计法，在步骤(1)中，确定相当于序列号2所示的氨基酸序列的82位氨基酸的氨基酸。 

[4]如[1]所述的变异型酶的设计法，在步骤(1)中，确定选自以下氨基酸中的一个或两个以上的氨基酸：相当于序列号2所示的氨基酸序列的35位氨基酸的氨基酸、相当于38位氨基酸的氨基酸、相当于40位氨基酸的氨基酸、相当于41位氨基酸的氨基酸、相当于42位氨基酸的氨基酸、相当于43位氨基酸的氨基酸、相当于45位氨基酸的氨基酸、相当于46位氨基酸的氨基酸、相当于49位氨基酸的氨基酸、相当于80位氨基酸的氨基酸、相当于81位氨基酸的氨基酸、相当于82位氨基酸的氨基酸、相当于83位氨基酸的氨基酸、相当于84位氨基酸的氨基酸、相当于103位氨基酸的氨基酸、相当于104位氨基酸的氨基酸、相当于105位氨基酸的氨基酸、相当于106位氨基酸的氨基酸、和相当于117位氨基酸的氨基酸。 

[5]如[1]所述的变异型酶的设计法，在步骤(1)中，确定相当于序列号2所示的氨基酸序列的84位氨基酸的氨基酸。 

[6]如[1]～[5]中任一项所述的变异型酶的设计法，步骤(1)中氨基酸的确定，是通过比较所述变异对象酶的氨基酸序列与序列号2表示的氨基酸序列、以及/或者比较所述变异对象酶的立体构造与由序列号2表示的氨基酸序列构成的酶的立体构造来进行的。 

[7]如[1]～[6]中任一项所述的变异型酶的设计法，将步骤(1)中确定的氨基酸取代为电荷状态不同的氨基酸。 

[8]如[1]～[7]中任一项所述的变异型酶的设计法，所述变异对象酶是野生型酶。 

[9]如[1]～[8]中任一项所述的变异型酶的设计法，所述变异对象酶是微生物来源的蛋白质脱酰胺酶。 

[10]如[9]所述的变异型酶的设计法，所述变异对象酶是金黄杆菌属来源的蛋白质谷氨酰胺酶。 

[11]如[9]所述的变异型酶的设计法，所述变异对象酶是解朊金黄杆菌(Chryseobacterium proteolyticum)来源的蛋白质谷氨酰胺酶。 

[12]如[1]～[11]中任一项所述的变异型酶的设计法，所述变异对象酶的氨基酸序列与序列号2所示的氨基酸序列具有70％以上的同源性。 

[13]变异型酶的设计法，包括以下步骤： 

(1)进行蛋白质脱酰胺酶(变异对象酶)的前体(pro-enzyme)的结构分析，确定与底物特异性或氧化稳定性相关的一个或两个以上的氨基酸的步骤； 

(2)构建基于变异对象酶的氨基酸序列，将步骤(1)中确定的氨基酸取代为其它氨基酸、或删除而得到的氨基酸序列的步骤。 

[14]变异型酶的制备法，包括以下步骤： 

(1)准备编码通过[1]～[13]中任一项所述的设计法构建的氨基酸序列的核酸的步骤； 

(2)使所述核酸表达的步骤；和 

(3)回收表达产物的步骤。 

[15]一种变异型酶，由在蛋白质脱酰胺酶(变异对象酶)的氨基酸序列中，将下组氨基酸取代为其它氨基酸或删除而得到的氨基酸序列构成：即相当于序列号2所示的氨基酸序列的35位氨基酸的氨基酸、相当于38位氨基酸的氨基酸、相当于39位氨基酸的氨基酸、相当于40位氨基酸的氨基酸、相当于41位氨基酸的氨基酸、相当于42位氨基酸的氨基酸、相当于43位氨基酸的氨基酸、相当于45位氨基酸的氨基酸、相当于46位氨基酸的氨基酸、相当于49位氨基酸的氨基酸、相当于79位氨基酸的氨基酸、相当于80位氨基酸的氨基酸、相当于81位氨基酸的氨基酸、相当于82位氨基酸的氨基酸、相当于83位氨基酸的氨基酸、相当于84位氨基酸的氨基酸、相当于103位氨基酸的氨基酸、相当于104位氨基酸的氨基酸、相当于105位氨基酸的氨基酸、相当于106位氨基酸的氨基酸、相当于117位氨基酸的氨基酸、相当于142位氨基酸的氨基酸、相当于143位氨基酸的氨基酸、相当于146位氨基酸的氨基 酸、相当于166位氨基酸的氨基酸、和相当于185位氨基酸的氨基酸被取代为其它氨基酸或被删除而得到的氨基酸序列。 

[16]如[15]所述的变异型酶，被取代或删除的氨基酸是选自于下组中的一个或二个以上的氨基酸：即相当于由序列号2所示的氨基酸序列的39位氨基酸的氨基酸、相当于40位氨基酸的氨基酸、相当于41位氨基酸的氨基酸、相当于43位氨基酸的氨基酸、相当于79位氨基酸的氨基酸、相当于80位氨基酸的氨基酸、相当于81位氨基酸的氨基酸、相当于82位氨基酸的氨基酸、相当于142位氨基酸的氨基酸、相当于143位氨基酸的氨基酸、相当于146位氨基酸的氨基酸、相当于166位氨基酸的氨基酸和相当于185位氨基酸的氨基酸。 

[17]如[15]所述的变异型酶，被取代或删除的氨基酸是相当于序列号2所示的氨基酸序列的82位氨基酸的氨基酸。 

[18]如[15]所述的变异型酶，被取代或删除的氨基酸是选自于下组中的一个或二个以上的氨基酸：即相当于序列号2所示的氨基酸序列的35位氨基酸的氨基酸、相当于38位氨基酸的氨基酸、相当于40位氨基酸的氨基酸、相当于41位氨基酸的氨基酸、相当于42位氨基酸的氨基酸、相当于43位氨基酸的氨基酸、相当于45位氨基酸的氨基酸、相当于46位氨基酸的氨基酸、相当于49位氨基酸的氨基酸、相当于80位氨基酸的氨基酸、相当于81位氨基酸的氨基酸、相当于82位氨基酸的氨基酸、相当于83位氨基酸的氨基酸、相当于84位氨基酸的氨基酸、相当于103位氨基酸的氨基酸、相当于104位氨基酸的氨基酸、相当于105位氨基酸的氨基酸、相当于106位氨基酸的氨基酸和相当于117位氨基酸的氨基酸。 

[19]如[15]所述的变异型酶，被取代或删除的氨基酸是相当于序列号2所示的氨基酸序列的84位氨基酸的氨基酸。 

[20]如[15]～[19]中任一项所述的变异型酶，所述变异对象酶是野生型酶。 

[21]如[15]～[20]中任一项所述的变异型酶，所述变异对象酶是微生物来源的蛋白质脱酰胺酶。 

[22]如[21]所述的变异型酶，所述变异对象酶是金黄杆菌属来源的蛋白质谷氨酰胺酶。 

[23]如[21]所述的变异型酶，所述变异对象酶是解朊金黄杆菌(Chryseobacterium proteolyticum)来源的蛋白质谷氨酰胺酶。 

[24]如[15]～[23]中任一项所述的变异型酶，所述变异对象酶氨基酸序列与序列号2所示的氨基酸序列具有70％以上的同源性。 

[25]如[16]、[17]、[20]～[23]中任一项所述的变异型酶，其对底物蛋白质的作用性与所述变异对象酶相比发生变化。 

[26]如[18]～[23]中任一项所述的变异型酶，其对过氧化氢的稳定性高于所述变异对象酶。 

[27]编码[15]～[26]中任一项所述的变异型酶的基因。 

[28]含有[27]所述的基因的重组DNA。 

[29]具有[28]所述的重组DNA的微生物。 

附图说明

[图1]将Chryseobacterium proteolyticum9670株来源的蛋白质谷氨酰胺酶的成熟体(浓线)和前体(淡线)的α碳重合而成的图。 

[图2]以丝带模型表示Chryseobacterium proteolyticum9670株来源的蛋白质谷氨酰胺酶前体的高级结构的图。分别用螺旋状和箭头状表示α-螺旋和β-折叠。 

[图3]对Chryseobacterium proteolyticum9670株来源的蛋白质谷氨酰胺酶前体中活性中心Cys42附近和底物结合区域进行扩大的图。 

[图4]对被认为是对Chryseobacteriumproteolyticum9670株来源的蛋白质谷氨酰胺酶前体中的活性中心有影响的氨基酸区域进行扩大的图。 

具体实施方式

1.变异型酶的设计法 

本发明的第1方面提供基于对蛋白质脱酰胺化的酶的变异型酶的设计法。根据本发明的设计法，可以得到在作用性和/或稳定性这一点上，与变异前的酶不同的酶。换言之，本发明的设计法被用作用于使酶的作用性或稳定性发生变化的方法。具体地说，例如，为了使蛋白质脱酰胺酶对于各个蛋白质底物的活性和/或底物特异性发生变化，可以利用本发明的设计法。更具体的是，例如，为了提高蛋白质脱酰胺酶的稳定性，可以利用本发明的设计法。如果可以使对于各蛋白质底物的特异性发生变化，就能够期待即使对迄今为止反应性低的蛋白质也可以以更少量的酶进行脱酰胺化，即使用量减少。此外，如果赋予不同的底物特异性，就可以应用于新的用途。另一方面，如果能够提高氧化稳定性，就可以带来在酶的使用时或输送、保存的过程中，使用容易性提高等效果。 

蛋白质脱酰胺酶之一的蛋白质谷氨酰胺酶作用于蛋白质中的谷氨酰胺残基，转化为谷氨酸。利用这种性质，可以适用于提高蛋白质功能性(溶解性、乳化特性、泡末特性、凝胶化特性等)、提高小麦麸质的生面团的伸展性、降低小麦变应原诱发性，提高从农产物中提取蛋白质的提取效率、提高蛋白质溶液中的钙溶解性等各种用途，这是一种产业利用性高的酶。如果可以改变对于底物中的酰胺基的反应性，例如，可以谋求通用性的提高、酶使用量(添加量)的降低等，与此同时还可以实现该酶在新领域的应用。 

本说明书中“作用性”，在没有特别说明时，作为包括如下特性的术语来使用：与水解蛋白质或肽中的谷氨酰胺或天冬酰胺的酰胺基，分别转化成谷氨酸残基、天冬氨酸残基，游离氨的作用相关的特性。“作用性”可以按以下方式，在使用蛋白质或肽作为底物的试验系统中，测定底物浓度、反应温度等一定条件下的游离氨量，通过相对活性进行评价。 

(1)在176mM的磷酸缓冲液(pH6.0)中以1％浓度溶解或分散蛋白质或肽，在37℃下使蛋白质脱酰胺酶反应。 

(2)一定时间后，用Ammonia Test Wako(和光社)定量反应液中游离的氨的浓度，测定单位时间、单位酶的氨增加量。 

而且，可以通过比较通过使用蛋白质或肽作为底物的试验系统求出的Km值、Kcat值等，来评价“作用性”。 

本说明书中“氧化稳定性”，没有特别说明时，指的是，与氧化物存在下的上述作用性(即，水解蛋白质或肽中的谷氨酰胺或天冬酰胺的酰胺基，分别转化为谷氨酸残基、天冬氨酸残基，游离氨的活性)相关的稳定性。氧化稳定性可以用例如以下方法求出。 

(1)在含有0.45～0.9％的过氧化氢的176mM的磷酸缓冲液(pH6.0)中溶解一定浓度的底物(例如10mM Cbz-Gln-Gly)，37℃下使蛋白质脱酰胺酶反应。 

(2)一定时间后用Ammonia Test Wako定量反应液中游离的氨浓度，测定氨增加量。以不存在过氧化氢下的氨增加量作为100％，来表达过氧化氢存在下的氨增加量。 

本发明的变异型酶的设计法大致包括二个步骤，即确定变异的氨基酸的步骤(步骤(1))，和构建确定的氨基酸发生变异的氨基酸序列的步骤(步骤(2))。以下，说明各步骤的详细内容。而且，本说明书中，在设计变异型酶时成为基础的酶(要实施变异的酶)称为“变异对象酶”。 

步骤(1) 

步骤(1)中，在蛋白质脱酰胺酶(变异对象酶)的氨基酸序列中，确定要实施变异的一个或二个以上氨基酸(以下，也称为“变异对象氨基酸”)。本发明中的变异对象氨基酸，是在蛋白质脱酰胺酶(变异对象酶)的氨基酸序列中，选自以下组：即相当于序列号2所示的氨基酸序列的35位氨基酸的氨基酸、相当于38位氨基酸的氨基酸、相当于39位氨基酸的氨基酸、相当于40位氨基酸的氨基酸、相当于41位氨基酸的氨基酸、相当于42位氨基酸的氨基酸、相当于43位氨基酸的氨基酸、相当于45位氨基酸的氨基酸、相当于46位氨基酸的氨基酸、相当于49位氨基酸的氨基酸、相当于79位氨基酸的氨基酸、相当于80位氨基酸的氨基酸、相当于81位氨基酸的氨基酸、相当于82位氨基酸的氨基酸、相当于83位氨基酸的氨基酸、相当于84位氨基酸的氨基酸、相当于103位氨基酸的氨基酸、相当于104位氨基酸的氨基酸、相当于105位氨基酸的氨 基酸、相当于106位氨基酸的氨基酸、相当于117位氨基酸的氨基酸、相当于142位氨基酸的氨基酸、相当于143位氨基酸的氨基酸、相当于146位氨基酸的氨基酸、相当于166位氨基酸的氨基酸、和相当于185位氨基酸的氨基酸。而且，这些变异对象氨基酸是，分析Chryseobacterium proteolyticum9670株来源的蛋白质谷氨酰胺酶相关的成熟体(由序列号2的氨基酸序列构成)和前体(由序列号4的氨基酸序列构成)的立体结构，其结果提示与底物的识别有关的氨基酸、和/或已经明确了对活性中心的氨基酸和位于其附近的活性中心的氨基酸有影响的氨基酸。如果使这些氨基酸发生变异，可以期待酶的作用性(尤其是底物特异性)和/或氧化稳定性发生变化。 

这里，本说明书中使用氨基酸残基时的用语“相当于”，是指所比较的蛋白质(酶)之间对其功能发挥作出同等贡献的情况，特别是指对底物特异性的贡献是同等的。例如，在考虑一级结构(即氨基酸序列)的部分相同性的同时，排列比较对象的氨基酸序列和基准的氨基酸序列(也就是序列号2的氨基酸序列)以便能够进行最适比较时(此时可以根据需要导入空位，将比对最优化)、可以将对应于基准氨基酸序列中的特定氨基酸的位置的氨基酸确定为“相当的氨基酸”。代替一级结构之间的比较，或者在此之上还进行立体构造(三维构造)之间的比较，由此也可以确定“相当的氨基酸”。通过利用立体构造信息，获得可靠性高的比较结果。这种情况下，可以采用一边比较多个酶的立体构造的原子坐标一边进行比对的方法。变异对象酶的立体构造信息可以从例如Protein Data Bank(http://www.pdbj.org/index_j.html)获得。 

以下示出采用X射线结晶构造分析来确定蛋白质立体构造的方法的一例。 

(1)将蛋白质结晶。结晶在确定立体构造上不可或缺，但是除此之外，作为蛋白质的高纯度纯化法、高密度且稳定的保存法，也在产业上具有有用性。此外，可以使结合有作为配位体的底物或其类似化合物的蛋白质结晶。 

(2)对所制作的结晶照射X射线，收集衍射数据。而且，蛋白质结晶因X射线照射受损而衍射能劣化的情况有很多。此时，将结晶骤然冷却到-173℃左右，在此状态下收集衍射数据的低温测定技术最近得到了 普及。而且，最终为了收集用于确定构造的高分解能数据，利用辉度高的同步加速器辐射。 

(3)进行结晶构造分析时，除了衍射数据之外，还需要相位信息。对于目标蛋白质，类似蛋白质的结晶构造为未知时，无法采用分子置换法进行构造确定，必须采用重原子同型置换法来解决相位问题。重原子同型置换法是将汞、铂等原子序号大的金属原子导入到结晶中、并利用金属原子序号大的X射线散射能对X射线衍射数据的贡献来获得相位信息的方法。所确定的相位可以通过使结晶中的溶剂区域的电子密度平滑化来改善。溶剂区域的水分子变动大因而几乎观测不到电子密度，因此通过使该区域的电子密度近似为0，可以接近真实的电子密度，进而相位得到改善。此外，非对称单元中含有多个分子时，通过将这些分子的电子密度平均化可进一步大幅改善相位。在使用如此改善后的相位计算得到的电子密度图中拟合蛋白质模型。该过程是在电脑三维图形图像上使用MSI公司(美国)的QUANTA等程序进行的。其后，使用MSI公司的X-PLOR等程序进行构造精密化，来完成构造分析。 

对于目标蛋白质，类似蛋白质的结晶构造为已知时，可以使用已知蛋白质的原子坐标、采用分子置换法来确定。分子置换和构造精密化可以使用程序CNS_SOLVE ver.11等进行。 

本发明人等尝试从Chryseobacterium proteolyticum9670株的培养液中纯化的蛋白质谷氨酰胺酶的成熟体的结晶化、和从重组大肠杆菌中纯化的蛋白质谷氨酰胺酶前体的结晶化，成功得到两者的立体构造。而且，把蛋白质谷氨酰胺酶前体的立体构造的原子坐标示于说明书的最后。此外，分别把该蛋白质谷氨酰胺酶的成熟体的氨基酸序列示于序列表序列号2，将编码其的基因的碱基序列示于序列号1，将蛋白质谷氨酰胺酶前体的氨基酸序列示于序列表的序列号4，将编码其的基因的碱基序列示于序列号3。 

如后述的实施例所示，明确了Chryseobacterium proteolyticum9670株来源的蛋白质谷氨酰胺酶的成熟体分子呈 的六方晶系的P6₅22形，前体分子呈 的斜方晶系的P2₁2₁2₁形(参照下文公开的表1和表2)。而且，图1是将蛋白质谷氨酰胺酶的成熟体(浓线)和前体(淡线)的α碳重合而成的图，图2 是以丝带模型表示蛋白质谷氨酰胺酶前体的高级结构的图。α-螺旋和β-折叠分别用螺旋状和箭头状表示。图3是将前体中活性中心Cys42附近和底物结合区域扩大的图，图4是将被认为对活性中心有影响的氨基酸区域扩大的图。 

以改变底物特异性作为目的时，优选，变异对象氨基酸选自以下氨基酸构成的组：相当于序列号2所示的氨基酸序列的39位氨基酸的氨基酸、相当于40位氨基酸的氨基酸、相当于41位氨基酸的氨基酸、相当于43位氨基酸的氨基酸、相当于79位氨基酸的氨基酸、相当于80位氨基酸的氨基酸、相当于81位氨基酸的氨基酸、相当于82位氨基酸的氨基酸、相当于142位氨基酸的氨基酸、相当于143位氨基酸的氨基酸、相当于146位氨基酸的氨基酸、相当于166位氨基酸的氨基酸、和相当于185位氨基酸的氨基酸。这些变异对象氨基酸是对Chryseobacterium proteolyticum9670株来源的蛋白质谷氨酰胺酶前体的立体结构进行分析，其结果提示与底物特异性相关的氨基酸，包括配置在裂隙(cleft)周边的表面上的，和配置在活性中心的氨基酸附近的。 

我们预计上述氨基酸中82位的酪氨酸残基配置在紧贴在活性中心的半胱氨酸(42位)的前(pro)区域的氨基酸(Ala-(minus)67位等)的附近，位于活性口袋入口，与底物形成氢键，因此我们认为其在底物的识别中起重要的作用。于是，制作了将该氨基酸取代为其它氨基酸的变异体，研究其性质，结果确认了该氨基酸起着与底物特异性相关的重要作用(参照实施例的栏)。因此，本发明的另一个优选实施方式中，相当于该氨基酸(82位氨基酸)的氨基酸作为变异对象氨基酸。 

另一方面，在以提高氧化稳定性作为目的时，优选变异对象氨基酸选自由以下氨基酸组成的组：相当于序列号2所示的氨基酸序列的35位氨基酸的氨基酸、相当于38位氨基酸的氨基酸、相当于40位氨基酸的氨基酸、相当于41位氨基酸的氨基酸、相当于42位氨基酸的氨基酸、相当于43位氨基酸的氨基酸、相当于45位氨基酸的氨基酸、相当于46位氨基酸的氨基酸、相当于49位氨基酸的氨基酸、相当于80位氨基酸的氨基酸、相当于81位氨基酸的氨基酸、相当于82位氨基酸的氨基酸、相当于83位氨基酸的氨基酸、相当于84位氨基酸的氨基酸、相当于103位氨基酸的氨基酸、相当于104位氨基酸的氨基酸、相当于105位氨基 酸的氨基酸、相当于106位氨基酸的氨基酸、和相当于117位氨基酸的氨基酸。这些变异对象氨基酸是对Chryseobacterium proteolyticum9670株来源的蛋白质谷氨酰胺酶的成熟体和前体的立体结构进行分析，分析结果提示与氧化稳定性相关的氨基酸，包括与催化剂残基(Cys42、His83、Asp103)的相互作用或结构保持相关的氨基酸。 

由于上述氨基酸中的84位氨基酸，在与Chryseobacteriumproteolyticum9670株来源的蛋白质谷氨酰胺酶相关的立体结构分析中，配置于对活性中心的半胱氨酸(42位)附近的半胱氨酸的硫醇基的解离状态有影响的位置，由此预测其起到与活性中心半胱氨酸被氧化的容易度相关的重要作用。于是，制作将该氨基酸取代为其它的氨基酸的变异体，研究其性质，结果确认该氨基酸起着与氧化稳定性相关的重要作用(参照实施例的栏)。因此，在本发明的更优选方式中，相当于该氨基酸(84位氨基酸)的氨基酸成为变异对象氨基酸。 

本发明中变异对象酶的种类和来源等只要是水解蛋白质中的酰胺基的酶即可，没有特别限定。作为变异对象酶的例子，可以列举小麦、菜豆、南瓜种子中已经报告的对蛋白质中的谷氨酰胺残基进行脱酰胺的酶、哺乳动物、鱼或放线菌等微生物来源的谷氨酰胺转移酶、细菌(环状芽孢杆菌(Bacillus circulans))的肽谷氨酰胺酶等。优选微生物来源的蛋白质脱酰胺酶，更优选Chryseobacterium proteolyticum9670株来源的蛋白质谷氨酰胺酶成为变异对象酶。 

优选由对序列号2表示的氨基酸序列具有高同源性的氨基酸序列构成的酶作为变异对象酶。作为其理由，可举出能够期待实现有效的改良，以及确定变异对象氨基酸变得容易。具体地说，优选将与序列号2表示的氨基酸序列具有70％以上同源性的氨基酸序列构成的酶作为变异对象酶。其中，一般来说，同源性越高越好。例如将由具有80％以上、更优选90％以上、进而更优选95％以上同源性的氨基酸序列构成的酶作为变异对象酶。 

其中，两个氨基酸序列的同源性(％)例如可以按照以下方法确定。首先，以能够进行最佳比较地并列两个序列(例如，可以在第一序列中导入空位后将与第二序列的比对最优化)。第一序列的特定位置的分子(氨基酸残基)，与第二序列的相应位置的分子相同时，即称该位置的分 子是相同的。两个序列的同源性是在这两个序列中共同的同一位置的数目的函数(即、同源性(％)＝同一位置的数目/位置的总数×100)，优选也将比对的最优化所需要的空位数目和大小考虑在内。 

两个序列的比较和同源性的确定可以使用数学算法来实现。作为可以用于序列比较的数学算法的具体例，有在Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-68中记载的、在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-77中改变的算法，但并不限于此。这样的算法被整合到Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-10中记载的NBLAST程序和XBLAST程序(2.0版本)中。为了得到与某氨基酸序列相同的氨基酸序列，例如，用XBLAST程序、设为score  ＝50、wordlength＝3来进行BLAST多肽检索即可。为了得到用于比较的空位比对，可以利用Altschul等人(1997)Amino Acids Research 25(17)：3389-3402中记载的Gapped BLAST。利用BLAST和Gapped BLAST时，可以使用相应的程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。详细地说，请参照http://www.ncbi.nlm.nih.gov。作为能够用于序列比较的其他数学算法的例子，有Myers和Miller(1988)Comput Appl Biosci.4：11-17中记载的算法。这样的算法被整合到例如可以在GENESTREAM网站服务器(IGH Montpellier、法国)或ISREC服务器中利用的ALIGN程序中。氨基酸序列的比较中使用ALIGN程序时，例如，可以使用PAM120残基质量表，设为空位长度罚分＝12、空位罚分＝4。 

可以使用GCG软件包的GAP程序、使用Blossom 62基质或PAM250基质，设为空位权重＝12、10、8、6、或4、空位长度权重＝2、3、或4来确定两个氨基酸序列的同源性。此外，可以使用GCG软件包(可以利用http://www.gcg.com)的GAP程序，设为空位权重＝50、空位长度权重＝3来确定两个核酸序列的相同度。 

变异对象酶是典型的野生型酶(在自然中发现的酶)。然而，也可以将已经发生某种变异或施以改变后的酶作为变异对象酶。如此本发明可以用于进一步提高酶的特性。 

步骤(2) 

步骤(2)中，构建以变异对象酶的氨基酸序列为基础、将在步骤(1)中确定的氨基酸取代成其他氨基酸或删除而得的氨基酸序列。取代后的氨基酸的种类没有特别限定。因此，可以是保守性氨基酸取代，也可以是非保守性氨基酸取代。其中，所谓“保守性氨基酸取代”是指将某氨基酸残基取代成具有同样性质的侧链的氨基酸残基。氨基酸残基根据其侧链被分类为碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、非电荷极性侧链(例如门冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)这样的几个家族。保守性氨基酸取代优选是在同一家族内的氨基酸残基之间的取代。在一个优选方式中，将确定的氨基酸取代为电荷状态不同的氨基酸。如果通过这种取代，可以期待性质有大幅改变。 

2.变异型酶的制备法本发明的第2方面涉及变异型酶的制备法。本发明的制备法包括以下步骤。(1)准备编码通过本发明的设计法构建的氨基酸序列的核酸的步骤；(2)使所述核酸表达的步骤，和(3)回收表达产物的步骤。 

在步骤(1)中，基于采用本发明的设计法构建的氨基酸序列，对编码变异对象酶的基因施加必要的变异(即、取代或删除作为表达产物的蛋白质的在特定位置的氨基酸)，得到编码变异型酶的核酸(基因)。用于取代特异位置的碱基序列的方法在该技术领域中已知有很多(例如、参照分子克隆，第3版，冷泉港实验室出版，纽约)，可以从中选择适当的方法来使用。 

作为特异位置的变异导入法，可以采用特异位置的氨基酸饱和变异法。特异位置的氨基酸饱和变异法是以蛋白的立体构造为基础，推定与所需功能相关的位置，导入氨基酸饱和变异的“Semi-rational，semi-random”方法(J.Mol.Biol.331，585-592(2003))。例如，可以使用Quick change(Stratagene公司)等的试剂盒、Overlap extention PCR(Nucleic Acid Res.16，7351-7367(1988))来导入特异位置的氨基酸饱和变异。在PCR中使用的DNA聚合酶可以使用Taq 聚合酶等。但是优选使用KOD-PLUS-(东洋纺社)、Pfu turbo(Stratagene公司)等的精度高的DNA聚合酶。 

另一方面，通过在酶基因中插入随机的变异，选择与各变异体(改变体)的表达产物的底物特异性相比具有较好底物特异性的基因，也可以制作编码变异型酶的基因。导入这样的随机变异时，首先利用例如易错PCR在标的基因区域中随机地导入变异，构建变异型酶基因文库。接着，从所得的文库以酶活性或底物特异性为指标选出克隆。 

在步骤(2)中，使步骤(1)中准备的基因表达。接着在后续的步骤(3)中回收作为表达产物的变异型酶。通常利用适当的宿主-载体系进行基因表达～回收表达产物(变异型酶)，也可以利用无细胞合成系来进行。并且，关于利用宿主-载体系的变异型酶的制备法的详细情况，引用后述(4.编码变异型酶的核酸等栏)相应的记载。 

其中，所谓“无细胞合成系(无细胞转录系、无细胞转录/翻译系)”是指，不使用活细胞，而是使用源于活细胞的(或者采用基因工程方法得到的)核糖体、转录-翻译因子等，在体外从作为模板的核酸(DNA、mRNA)来合成其所编码的mRNA、蛋白质。在无细胞合成系中一般使用根据需要将细胞粉碎液纯化而得到的细胞提取液。细胞提取液一般含有蛋白质合成所必需的核糖体、启动因子等各种因子、tRNA等各种酶。进行蛋白质的合成时，在该细胞提取液中添加各种氨基酸、ATP、GTP等能量源、磷酸肌酸等蛋白质合成所必需的其他物质。自然，蛋白质合成时也可以根据需要补充另外准备的核糖体、各种因子、以及/或者各种酶等。 

还报道了再构成蛋白质合成所必需的各分子(因子)的转录/翻译系的开发(Shimizu，Y.et al.：Nature Biotech.，19，751-755，2001)。在该合成系中，由大肠杆菌基因组将由构成细菌的蛋白质合成系的3种启动因子、3种伸长因子、与终结相关的4种因子、使各氨基酸与tRNA结合的20种氨酰tRNA合成酶、以及甲硫氨酰tRNA转甲酰基酶组成的31种因子的基因扩增，使用它们在体外再构成蛋白质合成系。在本发明中可以利用这样的再构成的合成系。 

用语“无细胞转录/翻译系”能够与无细胞蛋白质合成系、体外翻译 系或体外转录/翻译系交换使用。在体外翻译系中，使用RNA作为模板来合成蛋白质。作为模板RNA使用全RNA、mRNA、体外转录产物等。在另一方的体外转录/翻译系中，使用DNA作为模板。模板DNA优选应包含核糖体结合区域，且含有适当的终止序列。而且，在体外转录/翻译系中，设定添加有各反应所必需的因子的条件，使得转录反应以及翻译反应连续进行。 

3.变异型酶根据以上的制备法，可以得到对蛋白质、肽的作用性发生变化的变异型酶、或氧化稳定性发生了变化的变异型酶。因此，本发明提供作为另一个方面的变异型酶。优选的一个方式的变异型酶，提高了对变异对象酶难以作用的蛋白质的作用性。而且，优选的其它方式的变异型酶与变异对象酶相比，其在过氧化氢存在下的稳定性也提高了。 

本发明的变异型酶由水解蛋白质的酰胺基的酶(变异对象酶)的氨基酸序列中，选自以下氨基酸中的一或二个以上的氨基酸被取代为其它氨基酸或被删除的氨基酸构成：即相当于序列号2所示的氨基酸序列的35位氨基酸的氨基酸、相当于38位氨基酸的氨基酸、相当于39位氨基酸的氨基酸、相当于40位氨基酸的氨基酸、相当于41位氨基酸的氨基酸、相当于42位氨基酸的氨基酸、相当于43位氨基酸的氨基酸、相当于45位氨基酸的氨基酸、相当于46位氨基酸的氨基酸、相当于49位氨基酸的氨基酸、相当于79位氨基酸的氨基酸、相当于80位氨基酸的氨基酸、相当于81位氨基酸的氨基酸、相当于82位氨基酸的氨基酸、相当于83位氨基酸的氨基酸、相当于84位氨基酸的氨基酸、相当于103位氨基酸的氨基酸、相当于104位氨基酸的氨基酸、相当于105位氨基酸的氨基酸、相当于106位氨基酸的氨基酸、相当于117位氨基酸的氨基酸、相当于142位氨基酸的氨基酸、相当于143位氨基酸的氨基酸、相当于146位氨基酸的氨基酸、相当于166位氨基酸的氨基酸、和相当于185位氨基酸的氨基酸。 

优选的是，在以改变底物特异性作为目的时，取代或删除的氨基酸选自下组中的一或二个氨基酸：即相当于序列号2所示的氨基酸序列的39位氨基酸的氨基酸、相当于40位氨基酸的氨基酸、相当于41位氨基酸的氨基酸、相当于43位氨基酸的氨基酸、相当于79位氨基酸的氨基酸、相当于80位氨基酸的氨基酸、相当于81位氨基酸的氨基酸、相当 于82位氨基酸的氨基酸、相当于142位氨基酸的氨基酸、相当于143位氨基酸的氨基酸、相当于146位氨基酸的氨基酸、相当于166位氨基酸的氨基酸、和相当于185位氨基酸的氨基酸。另一方面，在以提高氧化稳定性作为目的时，取代或删除的氨基酸选自下组中的一或二个氨基酸：即相当于序列号2所示的氨基酸序列的35位氨基酸的氨基酸、相当于38位氨基酸的氨基酸、相当于40位氨基酸的氨基酸、相当于41位氨基酸的氨基酸、相当于42位氨基酸的氨基酸、相当于43位氨基酸的氨基酸、相当于45位氨基酸的氨基酸、相当于46位氨基酸的氨基酸、相当于49位氨基酸的氨基酸、相当于80位氨基酸的氨基酸、相当于81位氨基酸的氨基酸、相当于82位氨基酸的氨基酸、相当于83位氨基酸的氨基酸、相当于84位氨基酸的氨基酸、相当于103位氨基酸的氨基酸、相当于104位氨基酸的氨基酸、相当于105位氨基酸的氨基酸、相当于106位氨基酸的氨基酸、和相当于117位氨基酸的氨基酸。 

更优选的是，取代或删除的氨基酸是相当于序列号2所示的氨基酸序列的82位和/或84位氨基酸的氨基酸。 

变异对象酶的种类或来源等，也与上述第一方面的情况一样，省略重复的说明。而且，变异对象酶的具体例子是由序列号2所示的氨基酸序列构成的酶(Chryseobacterium proteolyticum9670株来源的蛋白质谷氨酰胺酶)、专利文献1中示出氨基酸序列的酶(粘金黄杆菌(Chryseobacterium gleum)JCM2410株来源的蛋白质谷氨酰胺酶)、专利文献3中示出氨基酸序列的酶(茂原链轮丝菌(Streptomycesmobaraensis)S-8112株来源的谷氨酰胺转移酶)等。 

本发明的变异型酶的特征在于，在变异前的酶(即变异对象酶)的氨基酸序列中在特定位置具有变异(取代或删除氨基酸)的氨基酸序列，但也可以在该变异的位置以外进行部分氨基酸变异或改变。这样，本发明也可提供如下的蛋白质，即，虽然与具有施以上述变异的氨基酸序列的变异型酶相比时其功能同等，但是氨基酸序列在局部不同的蛋白质(以下、也称为“同源蛋白质”)。所谓“氨基酸序列在局部不同”是指，典型地说，通过构成氨基酸序列的1个～数个氨基酸缺失、取代、或1～数个氨基酸添加、插入、或它们的组合，氨基酸序列产生变异(变化)。其中，氨基酸序列的不同在与蛋白质的酰胺基的水解相关特性不大幅降 低的限度下(优选基本上保持的限度)是容许的。只要满足该条件，氨基酸序列不同的位置就没有特别限定，还可以在多个位置产生不同。其中，所谓“多个”是指例如相当于小于全部氨基酸约30％的数目，优选相当于小于约20％的数目，更优选相当于小于约10％的数目，进一步优选相当于小于约5％的数目，最优选相当于小于约1％的数目。即同源蛋白质与上述变异型酶的氨基酸序列中的任一个具有例如约70％以上、优选约80％以上、更优选约90％以上、进一步优选约95％以上、最优选约99％以上的同源性。 

变异型酶可以用于需要蛋白质的酰胺基的水解的任意的用途。例如，在蛋白质的功能性(溶解性、乳化特性、泡沫特性、凝胶化特性等)的提高、小麦麸质的生面团的伸展性的提高、小麦变应原诱发性的降低、从农产物中提取蛋白质的提取效率的提高、蛋白质溶液中的钙溶解性的提高等方面可以利用变异型酶。变异型酶的使用量可以适当设定成目的效果能够得到发挥。而且，如果用保存稳定性提高了的变异型酶，在酶使用时或输送、保存过程中，能带来使用容易性提高等效果。 

4.编码变异型酶的核酸等本发明进一步提供与本发明的变异型酶相关的核酸。即，提供可以作为用于鉴定编码变异型酶的基因、编码变异型酶的核酸的探针而使用的核酸，可以作为用于将编码变异型酶的核酸扩增或使其突变等的引物而使用的核酸。 

编码变异型酶的基因，典型地说，用于制备变异型酶。根据使用编码变异型酶的基因的基因工程调制法，可以得到更均质状态的变异型酶。此外，该方法可以说是适于制备大量变异型酶的方法。而且，编码变异型酶的基因的用途并不限于制备变异型酶。例如，也可以利用该核酸作为用于阐明变异型酶作用机理等的实验用工具、或者作为用于设计或制作酶的进一步变异体的工具。 

在本说明书中，所谓“编码变异型酶的基因”是指使之表达时得到该变异型酶的核酸，具有对应于该变异型酶的氨基酸序列的碱基序列的核酸自不必说，还包括在这样的核酸中添加有不编码氨基酸序列的序列而成的核酸。此外，还考虑密码的简并。 

本发明的核酸通过参考本说明书或附上的序列表所公开的序列信 息，使用标准的基因工程方法、分子生物学方法、生化学方法等，可以制成分离的状态。 

在本发明的其他方式中，提供如下的核酸，即，虽然与编码本发明的变异型酶的基因的碱基序列比较时其所编码的蛋白质功能同等，但是碱基序列在局部不同的核酸(以下、也称为“同源核酸”。此外，将规定同源核酸的碱基序列也称为“同源碱基序列”)。作为阿源核酸的例子，可以列举以编码本发明的变异型酶的核酸的碱基序列为基准，由包含1个或多个碱基取代、缺失、插入、添加、或倒位的碱基序列构成，而且编码具有水解蛋白质的酰胺基的活性的蛋白质的DNA。碱基的取代、缺失等可以在多个部位发生。其中，“多个”是指根据该核酸所编码的蛋白质的立体构造中的氨基酸残基的位置、种类的不同而不同，例如是2～40碱基、优选2～20碱基、更优选2～10碱基。 

如以上那样的同源核酸可以通过例如限制性内切酶处理、采用核酸外切酶或DNA连接酶等的处理、定点突变导入法(分子克隆，第3版，13章，冷泉港实验室出版，纽约)或随机突变导入法(分子克隆，第3版，13章，冷泉港实验室出版，纽约)来导入变异等而得到。此外，通过紫外线照射等其他方法也可以得到同源核酸。 

本发明的另外的方式涉及具有与编码本发明的变异型酶的基因的碱基序列互补的碱基序列的核酸。本发明的的另外的方式是提供对于编码本发明的变异型酶的基因的碱基序列、或者对于与之互补的碱基序列具有至少约60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.9％的相同碱基序列的核酸。 

本发明的另外的方式涉及具有与编码本发明的变异型酶的基因的碱基序列或与该同源碱基序列互补的碱基序列在严紧条件下杂交的碱基序列的核酸。其中，所谓“严紧条件”是指形成所谓的特异性杂交、不形成非特异性杂交的条件。这样的严紧条件可以参照本领域技术人员公知的例如分子克隆(第3版，冷泉港实验室出版，纽约)或Currentprotocols in molecular biology(由Frederick M.Ausubel等人编辑.，1987)进行设定。作为严紧条件，可以列举例如使用杂交液(50％甲酰胺、10×SSC(0.15M NaCl，15mM柠檬酸钠，pH 7.0)、5×Denhardt溶液、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、10μg/ml的变性鲑鱼精子DNA、50mM磷 酸缓冲液(pH7.5))在约42℃～约50℃下温育，然后使用0.1×SSC、0.1％SDS在约65℃～约70℃下进行清洗的条件。作为更优选的严紧条件，可以列举例如使用50％甲酰胺、5×SSC(0.15MNaCl，15mM柠檬酸钠，pH 7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、10μg/ml变性鲑鱼精子DNA、50mM磷酸缓冲液(pH7.5))作为杂交液的条件。 

本发明的另外的方式是提供具有编码本发明的变异型酶的基因的碱基序列、或者与之互补的碱基序列的一部分的核酸(核酸片段)。这样的核酸片段可以用于对具有编码本发明的变异型酶的基因的碱基序列的核酸等进行检测、鉴定、以及/或者扩增等。核酸片段设计为例如至少含有与在编码本发明的变异型酶的基因的碱基序列中连续的核苷酸部分(例如约10～约100碱基长、优选约20～约100碱基长、更优选约30～约100碱基长)杂交的部分。用作探针时可以对核酸片段进行标记。标记可以使用例如荧光物质、酶、放射性同位素。 

本发明的另外的方面涉及含有本发明的基因(编码变异型酶的基因)的重组DNA。本发明的重组DNA例如以载体的形态提供。在本说明书中用语“载体”是指可以将插入其中的核酸输送到细胞等靶内的核酸性分子。 

根据使用目的(克隆、蛋白质的表达)，还考虑宿主细胞的种类来选择适当的载体。作为以大肠杆菌为宿主的载体，可以例示M13噬菌体或其变异体、λ噬菌体或其变异体、pBR322或其变异体(pB325、pAT153、pUC8等)等，作为以酵母为宿主的载体，可以例示pYepSec1、pMFa、pYES2等，作为以昆虫细胞为宿主的载体，可以例示pAc、pVL等，作为以哺乳类细胞为宿主的载体，可以例示pCDM8、pMT2PC等。 

本发明的载体优选为表达载体。所谓“表达载体”是指可以将插入于其中的核酸导入到目标细胞(宿主细胞)内、且在该细胞内能够使之表达的载体。表达载体通常含有所插入的核酸表达所必需的启动子序列、促进表达的增强子序列等。还可以使用含有选择标记的表达载体。在使用所述表达载体时，可以利用选择标记确认表达载体是否导入(及其程度)。 

本发明的核酸向载体插入、选择标记基因的插入(必要时)、启动子 的插入(必要时)等，可以使用标准的重组DNA技术(例如，可参照分子克隆，第3版，1.84，冷泉港实验室出版，纽约，使用限制性内切酶及DNA连接酶的公知方法)进行。 

作为宿主细胞，从操作容易度的观点出发，优选使用大肠杆菌(大肠埃希菌)等细菌细胞，但只要是能够复制重组DNA且变异型酶的基因能够表达的宿主细胞，就可以利用。作为优选的宿主的代表例，利用T7系启动子时可以列举大肠埃希菌BL21(DE3)pLysS，不是这种情况时可以列举大肠埃希菌JM109。 

本发明的另外的方面涉及具有本发明的重组DNA的微生物(即转化体)。本发明的微生物可以通过使用了上述本发明的载体的转染或转化来得到。例如，可以通过氯化钙法(J.Mol.Biol.、第53卷、第159页(1970))、Hanahan法((J.Mol.Biol.、第166卷、第557页(1983))、SEM法(Gene、第96卷、第23页(1990))、Chung等人的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA、第86卷、第2172页(1989))、磷酸钙共沉淀法、电穿孔(Potter，H.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81，7161-7165(1984))、Lipofection(Felgner，P.L.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84，7413-7417(1984))等来实施。 

本发明的微生物可以用于生产本发明的变异型酶。即，本发明的另外的方面是提供通过使用上述微生物来生产本发明的变异型酶的方法。本发明的生产方法至少包括在产生本发明的变异型酶的条件下培养上述微生物的步骤。通常除了该步骤之外，还实施将所产生的蛋白质回收(分离及纯化)的步骤。 

本发明所述微生物(转化体)的培养根据常规方法进行即可。作为培养基中使用的碳源，只要是能够同化的碳化合物即可，可使用例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、糖蜜、丙酮酸等。此外，作为氮源只要是能够利用的氮化合物即可，例如可使用胨、肉提取物、酵母提取物、酪蛋白水解物、大豆粕碱提取物等。除此之外，根据需要使用磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、镁、钙、钾、铁、锰、锌等的盐类、特定的氨基酸、特定的维生素等。 

另一方面，培养温度可以设定在30℃～40℃的范围内(优选37℃附近)。培养时间可以考虑培养对象的转化体的生育特性、变异型酶的产生特性等来进行设定。培养基的pH在转化体生育且产生酶的范围内调 整。优选将培养基的pH设为6.0～9.0左右(优选pH7.0附近)。 

尽管还可以将含有生产变异型酶的菌体的培养液直接、或经浓缩、除去杂质等后作为酶溶液使用，但一般姑且从培养液或菌体中回收变异型酶。所产生的变异型酶只要是分泌型蛋白质就可以从培养液回收，如果是此外的情况可以从菌体内回收。从培养液回收时，例如可以通过将培养上清液过滤、进行离心处理除去不溶物后，进行减压浓缩、膜浓缩，利用硫酸铵或硫酸钠的盐析，利用甲醇、乙醇或丙酮等的分级沉淀法、透析、加热处理、等电点处理、凝胶过滤或吸附色谱法、离子交换色谱法、亲和性色谱法等各种色谱法(例如、Sephadex凝胶(Pha rmacia Biotech)等的凝胶过滤、DEAE Sepharose CL-6B(Pharmacia Biotech)、Octyl SepharoseCL-6B(Pharmacia Biotech)、CM Sepharose CL-6B(PharmaciaBiotech))等组合，进行分离、纯化来得到变异型酶的纯化品。另一方面，从菌体内回收时，通过将培养液过滤、进行离心处理等来获取菌体，接着通过加压处理、超声波处理等机械方法或采用溶菌酶等的酶的方法将菌体破坏后，与上述同样地进行分离、纯化，可以得到变异型酶的纯化品。 

还可以将如上所述得到的纯化酶通过例如冻干、真空干燥或喷干等形成粉末后提供。此时，可以将纯化酶预先溶解于磷酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液、Tris-盐酸缓冲液或GOOD缓冲液中。可以优选使用磷酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液。应说明的是，作为其中的GOOD缓冲液，可以列举PIPES、MES或MOPS。以下通过实施例更具体地说明本发明，但本发明并不限于这些实施例。 

实施例 

1.蛋白质谷氨酰胺酶的成熟体的X线结晶结构分析(1)蛋白质谷氨酰胺酶的成熟体的制备Chryseobacterium proteolyticum9670株来源的蛋白质谷氨酰胺酶成熟体是按已经报道的(Yamaguchi，S.，Jeens D.J.&Archer，D.B.(2001)Protein-glutaminase from Chryseobacteriumproteolyticum，an enzyme that deamidates glutaminyl residues inproteins.Purification，c haracterization and gene cloning.Eur.J.Biochem.，268，1410-1421)方法制备的。 

(2)结晶化 

蛋白质谷氨酰胺酶的成熟体的结晶化按以下程序进行。首先，使用Hampton Research公司的24孔板，通过沉滴(sitting drop)蒸气扩散法进行筛选。20℃下静置，数日后，观察到三个孔中的结晶。这其中，采用最好的条件，使用悬滴(hanging drop)蒸气扩散法，用由5μl的酶液(40mg/ml)和5μl的贮存溶液(1.0M磷酸铵0.1M柠檬酸钠pH5.6)构成的10μl的悬滴，得到良好的结晶。在X线分析之前用含有30％甘油的贮存溶液处理后，用液氮(-173℃)骤冷。 

(3)X线分析 

X射线衍射数据在液氮温度下使用SPring-8(兵库县)的同步加速器-放射线BL-38B1收集，使用HKI2000程序加工。收集 分解能的X射线衍射数据，确定结晶学参数。空间组为P6₅22、晶格常数为 

(4)三维构造的确定 

三维构造通过如下确定：在2mM Na[AuCl₄]中浸渍5分钟，导入金原子，通过利用该反常散射确定位相的重原子同型置换法，在分解能 进行确定。位相确定中使用SEHLXD，SHELXC程序，使用WinCoot建模，结构精密化使用Refmac5，SHELXL。数据收集和精密化的统计值数据示于表1。 

[表1] 

2.蛋白质谷氨酰胺酶前体的X线结晶结构分析(1)蛋白质谷氨酰胺酶前体在大肠杆菌中的表达质粒的制备按以下方式通过PCR扩增编码Chryseobacterium proteolyticum 9670株来源的蛋白质谷氨酰胺酶前体的基因(GenBank Accesion No.AB046594)。以通过Sambrook等人的方法(Molecular Cloning：a laboratory manual，第二版，冷泉港实验室出版，1989)分离的Chryseobacterium proteolyticum9670株的染色体DNA作为PCR的模板，合成序列号5和序列号6的寡核苷酸，作为引物。PCR反应使用KODプラスシステム(东洋纺)，进行94℃/2分钟、94℃/15秒-70℃/30秒-68℃/70秒的循环30次。将所得到的PCR片段用限制性内切酶NdeI及XhoI处理后，连接用相同的两种酶切断而得到的质粒pET20(b)(Novagen公司)，得到表达质粒pETPG1。通过确定碱基序列确认所得到的PCR片段正确地编码蛋白质谷氨酰胺酶前体。 

序列号：55’-CGTGCCATATGGATTCCAACGGGAATCAGG-3’ (下划线为限制性内切酶NdeI识别位点)序列号：65’-CTCGCTCGAGAAATCCACAGCTGGATACAT-3’(下划线为限制性内切酶XhoI识别位点) 

(2)蛋白质谷氨酰胺酶前体在大肠杆菌中的表达将上述的表达质粒通过转化导入到大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen公司)中。将得到的转化体接种到含有100μ/ml的氨苄青霉素的LB培养基800ml×2，在37℃振荡。在600nm的浊度到达0.6～0.8的时刻添加异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)使得最终浓度为0.5mM，进而在18℃培养15小时。采用离心分离从培养液中收集菌体，悬浮于缓冲液(20mM磷酸钠(pH6.3)、0.5MNaCl、10mM咪唑)。 

(3)重组蛋白质谷氨酰胺酶前体的纯化 

将在(2)中得到的悬浮液在冰水中进行20分钟、200μA的超音波处理后，供给14000rpm、4℃、30分的离心分离，得到粗提取液。将其供给给Ni-NTA亲合层析(Qiagen公司)，用20mM磷酸钠/300mM咪唑(pH7.0)洗脱。将获得的洗脱蛋白质提供给TALON亲合层析(Clontech公司)，同样用20mM磷酸钠/300mM咪唑pH7.0洗脱，获得了蛋白质谷氨酰胺酶前体。用0.1M磷酸钠(pH 6.1)，对该纯化物进行缓冲液交换，并浓缩至27.5mg/ml左右。 

(4)结晶化 

蛋白质谷氨酰胺酶前体的结晶化按以下程序进行。首先，使用Hampton Research公司的PEG/Ion Screen，通过使用两块24孔板的沉滴蒸气扩散法进行筛选。20℃下静置，数日后，观察到22个孔中的结晶。这其中，最好的结晶用由2μl的酶液(27mg/ml)和2μl的贮存溶液(20％PEG3350，0.2M柠檬酸铵pH5.1)构成的4μl沉滴获得。在X线分析之前用含有20％甲基戊二醇的贮存溶液处理后，用液氮(-173℃)骤冷。 

(5)X线分析X射线衍射数据在液氮温度下使用SPring-8(兵库县)的同步加速器-放射线BL-38B1收集，使用HKL2000程序加工。收集 分解能的X射线衍射数据，确定结晶学参数。空间组为P2₁2₁2₁、 晶格常数为 

(6)三维构造确定三维构造使用先前分析的蛋白质谷氨酰胺酶原子坐标，通过分子置换法，在分解能 确定。位相确定中使用phaser，使用WinCoot建模，结构精密化中使用Refmac5。数据收集和精密化的统计值数据示于表2。 

[表2] 

获得的Chryseobacterium proteolyticum9670株来源的蛋白质谷氨酰胺酶的成熟体(浓线)和前体(淡线)的三维构造的模型示于图1(重合了α碳的图)。而且，前体的高级结构的丝带模型示于图2。而且，前体的原子坐标数据示于说明书的最后。图3是将前体中活性中心Cys42附近和底物结合区域扩大的图，图4是将被认为对活性中心有影响的氨基酸区域扩大的图。 

3.蛋白质谷氨酰胺酶变异体Tyr82Ser的制作 

根据2.获得的Chryseobacterium proteolyticum9670株来源的蛋白质谷氨酰胺酶前体的三维构造，基于配置在裂隙周边的表面或配置在活性中心的氨基酸附近的原因，作为能够影响底物特异性的氨基酸，确定出39位氨基酸、40位氨基酸、41位氨基酸、43位氨基酸、79位氨基酸、80位氨基酸、81位氨基酸、82位氨基酸、142位氨基酸、143位氨基酸、146位氨基酸、166位氨基酸和185位氨基酸。其中，82位的酪氨酸残基配置在紧贴在活性中心的半胱氨酸(42位)的前区域的氨基酸(Ala-(minus)67位等)的附近，我们认为其起到与底物的识别相关的重要的作用(图3)。而且，位于通向活性中心的裂隙的入口的4个酪氨酸残基(43、82、142、143位)具有由于其疏水性而吸引蛋白质分子的功能，82位的酪氨酸残基位于话性口袋入口，预测与底物形成氢键(图3)。这种推测下，按以下程序，将该氨基酸(Tyr82)取代为其它氨基酸，例如亲水性的、立体障碍小的氨基酸，验证了其效果。 

(1)蛋白质谷氨酰胺酶变异体Tyr82Ser的前体表达 

基于编码Chryseobacterium proteolyticum9670株来源的蛋白质谷氨酰胺酶前体的基因的序列，合成用于将Tyr82取代为丝氨酸的引物。合成序列号：7中所示的变异用的正向引物和与其分别相当的反向引物，调制到100ng/μl的浓度。以Chryseobacterium proteolyticum9670株来源的蛋白质谷氨酰胺酶前体的表达质粒pETPG1作为模板，用Quickchange PCR系统(Stratagene公司)进行PCR反应。制备1μl(20ng/μl)的pETPG1、5μl的10×PCR缓冲液(添加在后述的DNA聚合酶中的物质)、1.0μl(各2.5mM)的dNTP、各1.25μl的变异引物组(正向以及反向引物)、39μl的灭菌水、1μl(2.5U)的Pfu Turbo Hotstart DNA聚合酶(Stratagene公司)，进行95℃/30秒(变性)-60℃/1分(退火)-68℃ /4.7分(伸长)的循环17次，最终进行68℃/5分的扩增。用1％琼脂糖凝胶电泳确认所得到的PCR产物后，对于剩余的PCR产物，为了分解经甲基化的模板质粒，用限制性内切酶Dpn I处理，转化成大肠杆菌感受态细胞DH5α菌株。从所得到的氨苄青霉素耐受性转化体中分离质粒DNA，确认碱基序列，获得目的变异基因。将具有目的变异基因的质粒导入到表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)株，与2.(2)和(3)同样地表达、纯化蛋白质谷氨酰胺酶变异体Tyr82Ser的前体。 

序列号：7 

5’-TGTGTGGCGTGGAGCTCTCACGTTGCAATATTG-3’(下划线为编码取代氨基酸) 

(2)蛋白质谷氨酰胺酶变异体Tyr82Ser的成熟体的纯化 

接着，为了去除前体区域，添加9.32U/mg-蛋白质的胰蛋白酶(Sigma公司)，于30℃下反应4小时。将反应液提供给TALON亲合层析，在未吸附级分中取出蛋白酶后，用20mM磷酸钠/300mM咪唑(pH7.0)洗脱。用20mM柠檬酸钠缓冲液pH4.9透析洗脱级分，提供给MonoS阳离子交换层析(GE Healthcare Bioscience公司)。通过用0.5M的NaCl梯度洗脱吸附的蛋白质，纯化出具有活性的蛋白质谷氨酰胺酶变异体Tyr82Ser的成熟体。 

4.蛋白质谷氨酰胺酶变异体Tyr82Ser的底物特异性 

研究3.中制备的蛋白质谷氨酰胺酶变异体Tyr82Ser的成熟体对各种蛋白质的特异性。在含有α-乳白蛋白(Sigma公司)、β-乳球蛋白(Sigma公司)、分离大豆蛋白(Fuji Pro F、不二制油社)、小麦麸质(Viten、Roquette公司)和酪蛋白(和光社)各0.2％的196μl的20mM磷酸缓冲液(pH6.0)中添加0.3μg/4μl蛋白质谷氨酰胺酶变异体Tyr82Ser的成熟体，于37℃反应10～200分钟。添加三氯醋酸使得终浓度达到0.2M，停止反应后，用Ammonia Test Wako(和光社)定量游离的氨。使用等量的变异型蛋白质谷氨酰胺酶的成熟体作为对照。求出单位时间的游离氨量，以对α-乳白蛋白的游离氨量作为100％，以相对值表示对各种蛋白质的游离氨量。结果示于表3。 

[表3] 

蛋白质谷氨酰胺酶变异体Tyr82Ser与野生型蛋白质谷氨酰胺酶相比，更容易作用于β-乳球蛋白、分离大豆蛋白、小麦麸质，另一方面，清楚了其对酪蛋白的反应性降低。这样一来，通过导入变异，可以使对各种蛋白质的作用性发生变化。根据以上结果，能够确认Tyr82的变异对于底物特异性的改变有效。而且，如果作用性提高，能够减少酶使用量。而且，还可以期待扩大用途。 

5.蛋白质谷氨酰胺酶变异体Val84Asp的制备 

对Chryseobacterium proteolyticum9670株来源的蛋白质谷氨酰胺酶的成熟体和前体的三维构造进行分析的结果是，作为与催化剂残基(Cys42、His83、Asp103)的相互作用或结构保持相关，能够影响氧化稳定性的氨基酸，确定出35位氨基酸、38位氨基酸、40位氨基酸、41位氨基酸、42位氨基酸、43位氨基酸、45位氨基酸、46位氨基酸、49位氨基酸、80位氨基酸、81位氨基酸、82位氨基酸、83位氨基酸、84位氨基酸、103位氨基酸、104位氨基酸、105位氨基酸、106位氨基酸和117位氨基酸。这其中，84位氨基酸配置在活性中心的半胱氨酸(42位)的附近的影响半胱氨酸的硫醇基的解离状态的位置(图4)，其被认为起着与活性中心半胱氨酸的被氧化容易度相关的重要作用。这种推测下，按以下程序将该氨基酸(Val84)取代为其它氨基酸，例如具有负电荷的氨基酸，并验证了其效果。 

以编码Chryseobacterium proteolyticum9670株来源的蛋白质谷氨酰胺酶前体的基因的序列为基础，合成用于将Val84取代为天冬氨酸的引物。合成序列号：8中所示的变异用的正向引物和与其分别相当的反向 引物，用与以下3.(1)相同的方法，表达并纯化蛋白质谷氨酰胺酶变异体Val84Asp的前体。再用与3.(2)相同的方法，纯化出有活性的蛋白质谷氨酰胺酶变异体Val84Asp的成熟体。 

序列号：8 

5’-GCGTGGAGCTACCACGATGCAATATTGGTAAGC-3’(下划线为编码取代氨基酸) 

6.蛋白质谷氨酰胺酶变异体Val84Asp的氧化稳定性 

为了研究5.中制备的蛋白质谷氨酰胺酶变异体Val84Asp的氧化稳定性，研究过氧化氢存在下的稳定性。含有0.45或0.9％的过氧化氢的10mM Z-Gln-Gly(肽研究所社)/100mM磷酸缓冲液(pH6.0)的底物液中加入0.809μg的蛋白质谷氨酰胺酶变异体Val84Asp的成熟体，于37℃反应20分钟。添加三氯醋酸以使终浓度达到0.2M，，停止反应后，用Ammonia Test Wako(和光社)定量游离的氨。使用0.121μg的野生型蛋白质谷氨酰胺酶的成熟体作为对照。求出单位时间的游离氨量，以过氧化氢非存在下的游离氨量作为100％，以相对值表示各过氧化氢浓度下的游离氨量，作为残存活性。结果示于表4。 

[表4] 

这样，清楚了蛋白质谷氨酰胺酶变异体Val84Asp与野生型蛋白质谷氨酰胺酶相比，在过氧化氢存在下的稳定性显著提高。这样，能够通过导入变异而提高氧化稳定性。这样，能够确认Val84的变异对于氧化 稳定性的提高是有效的。而且，如果提高氧化稳定性，就可以节省稳定化剂，或减少稳定化剂的使用量。而且，制造工序(尤其是包装工序)中的使用也变得容易。 

产业上利用的可能性 

本发明的设计法·制备法可用于改变对蛋白质脱酰胺化的酶。通过作用性得到提高的变异型酶，可以例如减少酶使用量或缩短反应时间、扩大用途(向无法作用的底物的应用等)等。而且，通过氧化稳定性获得提高的变异型酶，可以例如省略用于维持保存稳定性的稳定化剂或减少稳定剂的使用量、简化制造工序(例如可以不进行脱气状态下包装)等。另一方面，通过利用本发明的设计法·制备法，可以期待可以提高能够适用于根据野生型酶无法预料的新用途的变异型酶。即，本发明可以有助于扩大对蛋白质脱酰胺化的酶的用途、使用容易度的提高。 

本发明不受上述发明实施方式和实施例说明的任何限定。在不脱离请求保护的范围的记载，本领域技术人员能够容易想到的范围下的各种变化方式都包括在本发明中。本说明书中明示的论文、公开专利公报和特许公报等内容，其所有内容作为援引进行引用。 

Chryseobacterium proteolyticum9670株来源的蛋白质谷氨酰胺酶前体的立体结构的原子坐标如下所示。 

受理局登记栏

国际局登记表