豌豆孢囊线虫特异性RAPD标记和SCAR标记快速分子检测方法

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及豌豆孢囊线虫特异性RAPD标记全序列、特异性SCAR标 记引物序列及豌豆孢囊线虫SCAR标记快速分子检测方法。

背景技术

豌豆孢囊线虫（H.goettingiana Liebscher,1892），是欧洲一些国家中侵染豌豆的主要病害。 目前已在欧洲、非洲、前苏联和地中海地区有分布，美国也有报道，但是相关分布范围较小。 豌豆孢囊线虫在我国的分布和传播正在调查中，目前在青海，湖北，四川等地均有为害大豆 的发现。豌豆孢囊线虫的寄主主要为豆科的豌豆(PisumsativumL.)，蚕豆(Viciafaba)，野豌豆 (Viciaspp.)，大豆(Glycines max)，小扁豆(Lens sculenta)等（Winslow R D.Provisional lists of  host plants of some root eelworm(Heterodera spp.).Annals of Applied Biology 1954, 41:591-605），此外还可寄生野草寄主，寄主范围相对较窄。通常进行3-6年轮作就可降低豌 豆孢囊线虫种群水平不对寄主构成危害，但必须严格控制野草寄主（Di Vito M,Greco N.The  pea cyst nematode.In:Lamberti,F.& Taylor,C.E.(Eds).Cyst nematodes.New York & London, Plenum Press 1986,321-332）。被侵染的豌豆植株会矮化，叶片变黄，根部分支减少，不能开 花或者花过早脱落，同受大豆孢囊线虫侵染的大豆一样，豌豆的根部发育不良。豌豆孢囊线 虫完成一代大约需要3-15周，时间随着土壤温度的改变而变化。含有卵的孢囊即使在无寄主 的条件下也能存活12年。豌豆孢囊线虫侵染后，豌豆开花期表现出矮缩黄萎，豌豆孢囊线虫 抑制豌豆根瘤的形成和固氮作用，从而使豌豆产量降低，同时还可导致植株对土壤中一些对 根部为害的菌类敏感，从而造成线虫与菌类的复合侵染。

目前豌豆孢囊线虫的鉴定大部分仍然依赖于传统的形态学鉴定方法，豌豆孢囊线虫的孢 囊与其近缘属种的孢囊形态类似，形态学鉴定耗时、需要很熟练的技术作为基础，并且需要 专门从事分类的人员来完成，因此豌豆孢囊线虫传统的形态学鉴定方法不适用于大规模的样 品检测且不能有效的调查豌豆孢囊线虫的分布和扩散。

为了弥补形态学鉴定的不足，快速、准确的对农作物孢囊线虫进行鉴定和检测，分子检 测技术迅速发展。20世纪80年代后期发展成功的DNA多聚酶链式反应（PCR技术），使得 直接扩增DNA成为可能，在PCR基础上还产生了各种新的分子标记技术，例如RFLP，RAPD, AFLP，Real-time PCR,SSR等。这些分子标记和检测技术都成功的应用到植物寄生线虫特别是 农作物孢囊线虫的分类鉴定和检测过程中。

各种分子标记检测技术各有利弊，在这些分子标记中，RAPD标记（RandomAmplified  Polymorphism DNA）的优点在于所需DNA量极少，要求设备也相对简单。在植物寄生线虫 的分子检测中应用也越来越广泛。RAPD标记由Williams等和Welsh等两个研究小组在1990 年发现。随着RAPD技术的应用，RAPD的缺点也凸显出来，由于RAPD引物非常短，只有 十个碱基，退火温度也较低，如果PCR体系变化，或者仪器变化，重复性会变差，而且易产 生非特异性的条带。为了弥补这一不足，Paran和Michelmore于1993年提出可以将其转为 SCAR（sequence characterized amplified region）标记（Paran I,Michelmore R W.Development of  reliable PCR-based markers linked to downy mildew risistence genes in lettuce.Theoretical and  Applied Genetics 1993,85:985-993.），并应用到了快速分子检测中。

在孢囊线虫的RAPD检测实例方面，Edward P.Caswell-Chen等（Edward P，Caswell-Chen, Valerie M,Williamson,FrancesF.Wu.Random amplified polymorphic DNA analysis of  Heterodera cruciferae and H.schachtii populations.Journal of Nematology 1992,24(3):343-351） 运用RAPD标记区分了H.cruciferae和H.schachtii，用10个不同的随机引物扩增燕麦孢囊线 虫的不同种群的DNA,产生了78条清晰的谱带。1995年Lopez-Braiia I等（Lopez-Braiia I, Romero M D,Delibes A.Analysis of Heterodera avenae populations by the random amplified polymorphic DNAtechnique.Genome 1995,Vol.39:1996）对禾谷孢囊线虫群体做了RAPD分 析。1996年，Jianbo Li等（Jianbo Li,Jamal Faghhihi,John M.Ferris,et al.The use of RAPD  amplified DNA as markers for virulence characteristics in soybean syst menatode.Fundamental  And Applied Nematology 1996,19(2):143-150）用RAPD标记技术研究了大豆抗性品种与大豆 孢囊线虫的致病型之间的关系。1997年，Blok V.C.等（Blok V C,Philips,Harrower B E. Comparison of British populations of potato cyst nematodes with populations from continental  Europe and south America using RAPDs.Genome 1997,40:286-293）通过RAPD技术研究马铃 薯金线虫和马铃薯白线虫两个群体的线虫致病型之间的遗传关系。

RAPD标记与SCAR标记的联合应用后，在孢囊线虫的分子检测方面也取得了一定进展， 例如Fullanodo,A.et.al（Fullaondo A,Barrena E,Viribay M,Barrena I,Salazar A,Ritter E. Identification of potato cyst nematode species Globodera rostochiensis and G.pallida by PCR using  specific primer combinations.Nematology 1999,1:157-163）用随机引物OPG5分别扩增出区分 马铃薯金线虫和马铃薯白线虫特异性RAPD标记片段，转化成SCAR标记后，分别扩增出了 315bp的马铃薯金线虫片段和798bp的马铃薯白线虫片段。Ou,S.Q.,Peng D.L.（Ou S Q,Peng  D L,Li Y，Moens M.Identification of Heterodera glycines using PCR with sequence characterised  amplified region(SCAR)primers.Nematology 2008,10(3):397-403）采用RAPD技术，获得了 基于大豆孢囊线虫基因组DNA的特异性SCAR标记，构建的特异性SCAR标记引物扩增出 500bp大豆孢囊线虫的特异性SCAR片段，选用核糖体引物D2A和D3B作为内标与上述特 异性引物SCNF1和SCNR1相结合，发明了一步双重PCR方法检测大豆孢囊线虫，在PCR 扩增条件下，大豆孢囊线虫群体都获得了500bp的特异性SCAR标记片段和800bp片段。在 其他线虫的检测方面，RAPD和SCAR标记也有不少应用，例如Meng Qing-peng等（Meng  Qingpeng,Long H,Xu J H.PCR assays for rapid and sensitive identification of three major root-knot nematodes,Meloidogyne incognita,M.javanica and M.arenaria.Acta Phytopathologica  Sinica 2004，34(3):204-210）成功地将南方根结线虫和爪哇根结线虫特异的随机扩增多态性 DNA片段转化为SCAR标记。Adam M.A.M.等（Adam M A M,Phillips M S,Blok V C.Molecular  diagnostic key for identification of single juveniles of seven common and economically important  species of root-knot nematode(Meloidogyne spp.).Plant Pathology 2007,56:190-197）运用SCAR 标记技术区分了根结线虫属的七种线虫。

国内外虽然有关于豌豆孢囊线虫核糖体DNA的ITS区域的研究报道，但在我国，豌豆 孢囊线虫的报道较少，并且国内外尚未见基于基因组DNA的RAPD和SCAR标记特异性分 子检测豌豆孢囊线虫的报道。

发明内容

针对上述技术领域的空白，本发明提供豌豆孢囊线虫特异性RAPD标记的全长序列，同 时设计SCAR标记特异性引物将RAPD标记转化为更加稳定的SCAR标记，提供豌豆孢囊线 虫特异性RAPD和SACR标记的快速分子检测方法，为制定线虫的快速分子检测、豌豆孢囊 线虫病的早期诊断和制定线虫病害综合治理对策服务。

豌豆孢囊线虫特异性RAPD标记的DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。

根据豌豆孢囊线虫特异性RAPD标记的DNA片段的保守序列设计的特异性引物。

优选该特异性引物HgoF1和HgoR1，其序列为：

HgoF1：5’-GATGTTGTGCTTTCACAGGTTTG-3’，

HgoR1：5’-TGTTTGTACTCACTCCTTCGCTC-3’。

豌豆孢囊线虫SCAR标记快速分子检测方法，其特征在于PCR反应体系中含有上述特 异性引物HgoF1和HgoR1。

所述反应体系：反应体系总体积为25μl，其中2.5μl 10×PCR含Mg2+的Buffer；2.0μl dNTP；1.0μl引物HgoF1（0.1μg/μl）；1.0μl引物HgoR1（0.1μg/μl）；0.25μl Taq DNA聚合 酶（5U/μl）；1.0μl模板DNA（豌豆孢囊线虫及其它孢囊线虫群体提取的基因组DNA）；ddH₂O 补足25μl。

所述PCR的扩增程序为：94℃预变性5min，然后94℃30S，56℃30S，72℃1min循环 35次，72℃延伸10min，保存在4℃条件下。

本发明利用RAPD技术，获得了基于豌豆孢囊线虫基因组DNA的特异性RAPD标记， 经克隆测序后，设计SCAR标记引物，将RAPD标记转换成SCAR标记，利用该SCAR标记 的特异性引物，可检测出目标线虫。

本发明构建了特异性SCAR标记的特异性引物HgoF1和HgoR1（即SEQ ID NO2和SEQ  ID NO3）。利用此特异性引物，在PCR扩增条件下，所有豌豆孢囊线虫群体都获得了544bp 的特异性SCAR标记片段，而其它线虫类则没有544bp的特异性SCAR标记片段。本发明构 建的特异性引物HgoF1和HgoR1，特异性强，准确，灵敏。

本发明应用特异性SCAR标记PCR检测技术检测目标线虫，与重复性较差的RAPD技 术（RAPD-PCR）、核糖体DNA限制性内切酶技术（RFLP-PCR）检测方法相比，能够更省 时、准确、灵敏，更能建立快速、准确的豌豆孢囊线虫检测技术。该技术可应用于对豌豆孢 囊线虫发生的大豆田间土壤样品及豌豆孢囊线虫病发生的早期快速分子检测，具有实际的应 用价值。

附图说明

图1：用12个Operon系列的含10个碱基的随机引物对豌豆孢囊线虫Hgo01进行扩增的扩增 结果，

M为标准DNA分子标记（DNA marker DL 2,000）；1-12：随机引物OPA₀₂,OPA₀₆,OPA₀₉,OPA₁₃, OPA₁₈,OPB₁₅,OPC₀₆,OPD₁₃,OPG₀₆,OPG₀₈,OPG₁₀,OPK₁₆;13：阴性对照。（代码见表1和表2） 图2：用随机引物OPA₀₆扩增豌豆孢囊线虫、禾谷孢囊线虫、菲利普孢囊线虫、大豆孢囊线 虫、旱稻孢囊线虫、大麦孢囊线虫、香蕉穿孔线虫、马铃薯腐烂茎线虫等的RAPD的特异性 DNA片段结果，

M为标准DNA分子标记（DNA marker DL 2,000）；1-9:Hgo01,Hgo02,Hgo03,Hgo04,Hgo05, Hgo08,Hgo09,Hgo10,Hgo12;10-20:Hf01,Hf06,Ha01,Ha06,Hg01,Hg03,He01,He04,Hl01, Rs01,Dd01;21：阴性对照。（代码见表1）

图3：用豌豆孢囊线虫特异性SCAR标记引物（HgoF1和HgoR1）扩增6种孢囊线虫和2种 非孢囊线虫的结果，

M为标准DNA分子标记（DNA marker DL 2,000）；1-12:Hgo01,Hgo02,Hgo03,Hgo04,Hgo05, Hgo06,Hgo07,Hgo08,Hgo09,Hgo10,Hgo11,Hgo12;13-23:Hf01,Hf06,Ha01,Ha06,Hg01, Hg03,He01,He04,Hl01,Rs01,Dd01;24：阴性对照。（代码见表1）

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

本发明的实验选用的材料：

供试线虫包括19个禾谷孢囊线虫群体，11个菲利普孢囊线虫群体，3个大豆孢囊线虫群 体，12个豌豆孢囊线虫群体，5个旱稻孢囊线虫群体，1个大麦孢囊线虫群体，1个马铃薯腐 烂茎线虫群体，1个松材线虫群体，1个香蕉穿孔线虫群体，共计54个线虫群体。如表1所 示。所述供试线虫样品可以对公众发放。

表1供试线虫样品代码及群体来源

表2供试RAPD引物

主要试剂：rTaq酶PCR扩增试剂盒和pMD18-T Simple Vector购自TaKaRa公司；DNA marker、DH5α感受态细胞、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根生化公司。引物由上海生工生物 技术有限公司合成。序列测定由北京六合华大基因科技有限公司完成。其他常规试剂均为北 化生产的分析纯。

实施例1:豌豆孢囊线虫特异性RAPD引物的筛选

1.1豌豆孢囊线虫基因组DNA的提取

分别挑取供试孢囊线虫群体1个饱满的孢囊，放入10ml灭菌双蒸水的PCR管中，在液 氮中冷冻。对于马铃薯腐烂茎线虫等线虫群体则是挑取单头线虫放入10ml灭菌的双蒸水中， 同样在液氮中冷冻。取出后置于冰上，用75％酒精消毒的玻璃棒在PCR管中转动至冰融化， 将孢囊捅破，释放卵，或将线虫弄断。加入8ml的10×的PCR buffer，2ml蛋白酶K溶液 (600mg/ml)，在-80℃条件下冷冻2h后，将PCR管取出，置65℃下温育1.5h，然后95℃10min， 最后1000rpm下离心1min，取上清DNA悬浮液于-20℃保存备用。

1.2豌豆孢囊线虫特异性RAPD标记（SCAR标记）的筛选

参考彭德良（2003）研究小麦禾谷孢囊线虫群体的遗传变异分析结果，在能产生多态性 的RAPD引物中，以Hgo01豌豆孢囊线虫群体的DNA为模板，遴选12个Operon系列的含 10个碱基的随机引物OPA₀₂,OPA₀₆,OPA₀₉,OPA₁₃,OPA₁₈,OPB₁₅,OPC₀₆,OPD₁₃,OPG₀₆,OPG₀₈, OPG₁₀,OPK₁₆（如表2）进行扩增。扩增结果显示，随机引物OPA₀₆获得的特异性片段稳定， 因此选用OPA₀₆对12个豌豆孢囊线虫群体和其他线虫群体的DNA进行扩增，寻找出豌豆孢 囊线虫群体的特异性RAPD标记片段位734bp和604bp。

以供试孢囊线虫的DNA为模板，以表2中的RAPD随机引物进行PCR扩增。RAPD-PCR 反应体系为25μl，配比如下：10×PCR Buffer 2.5μl，10mmol/L dNTP 2.0μl，RAPD随机引 物3.0μl，rTaq DNA多聚酶0.25μl（5U/μl），模板DNA 0.5μl，灭菌重蒸水补足25μl。在 EppendorfPCR扩增仪上进行扩增。

PCR扩增条件为94℃5min；94℃30s，35℃30s,72℃1min,10个循环；94℃30s；35 ℃1min;72℃1min,30个循环;72℃延伸10min；4℃保存。PCR扩增后，取5μl扩增产物加 1μl加样缓冲液在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，用0.5×TAE作为电泳缓冲液，120V电压下电 泳40min，EB染色后，凝胶分析系统进行照相分析，可以看出随机引物OPA₀₆经过多次RAPD 扩增多态性较稳定。（图1）。

实施例2:豌豆孢囊线虫RAPD标记序列的测定和SCAR标记引物的设计

以供试豌豆孢囊线虫和其他线虫的DNA为模板，以RAPD引物OPA₀₆进行PCR扩增。 RAPD-PCR反应体系为25μl，配比如下：10×PCR Buffer 2.5μl，10mmol/L dNTP 2.0μl，RAPD 引物OPA₀₆3.0μl，rTaq DNA多聚酶0.25μl（5U/μl），模板DNA0.5μl，灭菌重蒸水补足25μl。 在EppendorfPCR扩增仪上进行扩增。

PCR扩增条件同实施例1，从图2中可以看出用随机引物OPA₀₆扩增豌豆孢囊线虫群体 获得约750bp和600bp的特异性DNA片段（图2）。将随机引物OPA₀₆扩增豌豆孢囊线虫获 得的750bp和600bp左右的RAPD特异性DNA片段从琼脂糖凝胶上切割，使用DNA回收试 剂盒对RAPD特异性DNA片段进行回收和纯化后，纯化后的RAPD-PCR产物连接到pMD18-T Simple Vector载体上，PCR产物与载体连接后，转化到DH5αE.coli感受态中进行克隆，通过 蓝白斑筛选将表现为阳性克隆的重组质粒委托华大基因公司进行序列测定。用DNAMAN软 件对序列进行分析比较。

根据豌豆孢囊线虫RAPD特异性的DNA片段序列测序结果，结果表明RAPD标记片段 大小为734bp和604bp。通过Primer 5.0软件进行分析，734bp的片段不能转化成为SCAR标 记，取604bp的片段（见SEQ ID NO1）其中保守序列构建了一对豌豆孢囊线虫特异性SCAR 标记引物，该引物对各含23碱基。将豌豆孢囊线虫特异性SCAR标记上游引物和下游引物分 别命名为HgoF1和HgoR1，其序列特征如下：

HgoF1：5’-GATGTTGTGCTTTCACAGGTTTG-3’

HgoR1：5’-TGTTTGTACTCACTCCTTCGCTC-3’

实施例3：豌豆孢囊线虫特异性SCAR标记的快速分子检测

特异性SCAR标记快速分子检测的反应体系体积为25μl，其中含有2.5μl 10×PCR Buffer （含Mg++）；2.0μl dNTP；1.0μl引物HgoF1（0.1μg/μl）；1.0μl引物HgoR1（0.1μg/μl）；0.25μl Taq DNA聚合酶（5U/μl）；1.0μl模板DNA（豌豆孢囊线虫及其它孢囊线虫群体提取的基因 组DNA）；ddH₂O补足25μl。

所应用的豌豆孢囊线虫特异性SCAR标记引物序列如下：

HgoF 1：5’-GATGTTGTGCTTTCACAGGTTTG-3’

HgoR1：5’-TGTTTGTACTCACTCCTTCGCTC-3’

PCR扩增程序为：94℃预变性5min，然后94℃30S，56℃30S，72℃1min循环35次， 72℃延伸10min，保存在4℃条件下。取5μl PCR反应产物与1μl上样缓冲液混匀在1.5%的 琼脂糖凝胶上电泳，用0.5×TAE作为电泳缓冲液，120V电压下电泳40分钟，EB染色后， 凝胶分析系统进行照相分析。

利用豌豆孢囊线虫特异性SCAR标记特异性引物，在56℃的退火温度和35-40个循环的 条件下扩增，豌豆孢囊线虫群体都获得544bp特异性SCAR标记片段（图3中1-12泳道）， 而其他孢囊线虫（图3中13-21泳道），香蕉穿孔线虫（图3中22泳道），马铃薯腐烂茎线虫 （图3中23泳道）等都没有获得544bp SCAR标记片段。说明本发明所构建的SCAR标记引 物对豌豆孢囊线虫具有特异性，这是目前国际首例豌豆孢囊线虫特异性SCAR标记引物。