MAPK-ERK1/2信号通路抑制剂在制备去除或抑制肿瘤细胞中双微体药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种能够去除或抑制肿瘤细胞中双微体的药物，特别涉及一种能够 去除或抑制MAPK-ERK1/2信号转导通路持续激活的恶性肿瘤细胞中双微体的药 物。属于肿瘤生物治疗技术领域。

背景技术

双微体（double minutes或double minute chromosomes，DMs）是基因扩增的主 要细胞遗传学标志，为细胞中位于染色体外、小的、成对存在的无中心粒的染色质 小体，是染色体外遗传单位的一种主要存在形式。

1962年首次在一些恶性肿瘤细胞和渗出液及肺癌胸水的转移细胞中发现这种 染色体外的微体。目前已在白血病、恶性淋巴瘤等多种血液系统肿瘤，和肺癌、结 肠癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌及儿童神经母细胞瘤等实体性肿瘤中都可检测到双 微体，双微体是恶性肿瘤基因扩增的主要的细胞遗传学标记。不同类型的肿瘤细胞 中双微体具有较高的异质性，携带基因扩增使细胞具有选择优势，在各自不同的肿 瘤中发挥抗凋亡、促进肿瘤细胞生长等作用。在肿瘤演进的晚期有重要作用，与各 种癌症病人的不良预后及耐药性密切相关。

肿瘤细胞常表现出细胞信号转导通路异常调节，而双微体的形成也是肿瘤细胞 内外信号转导通路异常调节的表现形式。细胞内外信号转导通路中丝裂原活化蛋白 激酶（MAPK）家族在肿瘤中表现出各种异常尤为突出。MAPKs信号转导通路中癌 性突变最经常影响到的是ERK1/2通路，在大约1/3的人类癌症中都出现ERK1/2通 路异常调节，关系肿瘤表型的多个方面。

1983年SNAPKAM.R.等首次发现低浓度的羟基脲（HU）可以诱导双微体丢失， 减少携带的DHFR基因的扩增拷贝数，降低肿瘤的恶性表型；至今Von HoffD.D.、 Raymond E.、Guan X.、Shimizu N.和Prochazka P.等分别在研究中证实双微体会在选 择压力下缓慢丢失。从肿瘤细胞中消除双微体上扩增的癌基因和耐药基因，降低其 致癌性或恢复细胞对药物的敏感性，去除双微体是治疗以基因扩增为标志的疾病的 可行途径。不足之处是在临床实际中也会将羟基脲应用于肿瘤治疗，但对肿瘤并没 有较强的特异性，羟基脲半衰期短，高剂量，易产生快速耐受性。

针对肿瘤的特点进行特异性治疗可以提高肿瘤治疗的敏感性和特异性，有的放 矢，由于某些肿瘤细胞可检测到双微体的形成和MAPK-ERK1/2信号转导通路异常 激活，针对这一特点对肿瘤细胞双微体形成密切相关的重要靶点进行干预，通过减 少肿瘤细胞中双微体数目，从而控制肿瘤细胞的演进，针对肿瘤细胞中双微体的靶 向性治疗将会成为一种新的肿瘤治疗策略。

发明内容

本发明的目的在于针对目前肿瘤治疗的效果欠佳，进而提供一种针对含有双微 体的肿瘤的靶向生物治疗策略，可以特异性的针对MAPK-ERK1/2信号转导通路异 常而出现ERK1/2蛋白激酶持续磷酸化的含有双微体的肿瘤类型。

本发明人以研究发现的恶性肿瘤细胞中双微体与ERK1/2蛋白激酶活性存在密 切关系为理论依据，通过研究发现，MAPK-ERK1/2信号转导通路抑制剂能够去除 或抑制肿瘤细胞中双微体。

因此，本发明提出了MAPK-ERK1/2信号转导通路抑制剂在制备去除或抑制肿 瘤细胞中双微体药物中的应用。

在本发明中，优选的，所述的肿瘤细胞为MAPK-ERK1/2信号转导通路持续激 活的恶性肿瘤细胞。

在本发明中，优选的，所述的MAPK-ERK1/2信号转导通路抑制剂为U0126 （1,4-Diamino-2,3-dicyano-1,4-bis(o-aminophenylmercapto)butadiene，1,4-二氨基-2,3- 二氰基-1,4-双(邻氨基苯巯基)丁二烯），其化学结构式如式I所示。或PD 98059 （2-(2-Amino-3-methoxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one，2-(2-氨基-3-甲氧基苯 基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮），其化学结构式如式II所示。

以上所述的抑制剂可购自德国Calbiochem公司（U0126，货号#662005；PD 98059 货号#513000）。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

1、检测恶性肿瘤细胞的细胞遗传学特征

从美国标准生物品收藏中心（ATCC）和文献报道选择以下含有双微体的恶性 肿瘤细胞为研究对象，人卵巢癌细胞系UACC-1598，人结直肠腺癌细胞系 NCI-H716、人结肠腺癌细胞系NCI-H508、人神经外胚层瘤细胞系SK-PN-DW、人 髓性白血病细胞系HL-60和人胃腺癌细胞系NCI-N87。

（1）常规细胞培养

（2）细胞中期核型标本制备检测细胞株含有双微体的信息

2、检测含有双微体的细胞的MAPK-ERK1/2信号转导通路活性状态

在人类肿瘤中经常出现MAPK-ERK1/2信号转导通路持续性地被激活， MAPK-ERK1/2等多级蛋白激酶被异常激活，ERK1/2蛋白激酶持续处于磷酸化状 态。因此，检测选择Western blotting技术，用针对ERK1/2Thr202/Tyr204位点的特 异性抗体anti-phospho-ERK1/2(Thr202/Tyr204)抗体检测不同细胞中ERK1/2 Thr202/Tyr204位点的磷酸化水平。

3、MAPK-ERK1/2信号转导通路抑制剂对细胞中双微体的影响

从上述实验确认人卵巢癌细胞UACC-1598中ERK1/2蛋白激酶处于持续磷酸化 状态，用低浓度MAPK-ERK1/2信号转导通路抑制剂持续作用此种细胞两周，检测 细胞中双微体的变化。

（1）双微体数目检测

抑制剂作用后，常规进行中期核型制备，计数50-100个核型中的双微体。另有 中期核型标本-20℃保存，以备用于后续荧光原位杂交（FISH）实验。

（2）双微体携带基因扩增水平检测

已知人卵巢癌细胞UACC-1598细胞中双微体上携带MCL1、MYCN和EIF5A2 基因扩增，通过实时定量PCR（qPCR）方法和荧光原位杂交技术检测抑制剂作用 下MCL1、MYCN和EIF5A2基因的扩增水平。

4、MAPK-ERK1/2信号转导通路抑制剂对细胞生物学行为的影响

（1）绘制细胞生长曲线检测加入抑制剂后的细胞增殖能力变化；

（2）流式细胞术检测加入抑制剂后的细胞周期变化；

分别收集加入抑制剂和对照组细胞，依cycle TEST^TM PLUS DNA试剂盒提供的 操作步骤进行，行流式细胞术检测细胞周期的改变。

（3）细胞克隆形成能力检测；

（4）细胞侵袭能力检测。

应用BD BioCoat^TM Matrigel^TM Invasion Chamber对抑制剂和对照组细胞进行重 组基底膜侵袭实验。

由此方案可特异性的针对MAPK-ERK1/2信号转导通路异常而出现ERK1/2蛋 白激酶持续磷酸化的含有双微体的肿瘤，用MAPK-ERK1/2信号转导通路抑制剂 通过减少细胞中双微体的数目而降低肿瘤细胞的恶性程度。

相较于现有技术本发明方法的有益效果是对于双微体阳性的肿瘤细胞的生物 治疗提供新的靶向性治疗方案，提高了治疗的特异性。特异针对含有双微体并且 ERK1/2蛋白激酶处于持续磷酸化的恶性肿瘤细胞，用MAPK-ERK1/2细胞转导通 路抑制剂作用通过减少肿瘤细胞中的双微体数目及携带癌基因的扩增而降低肿瘤 细胞的恶性程度。

附图说明

图1是肿瘤细胞中含有双微体情况的细胞中期核型图；

A：UACC-1598；B：NCI-H716；C：NCI-H508；D：SK-PN-DW；E：HL-60； F：NCI-N87

图2是肿瘤细胞中含有双微体的数目的统计散点图；

图3是各种人类恶性肿瘤细胞株ERK1/2Thr202/Tyr204位点磷酸化状态的 Western Blotting图；

图4是加入MAPK-ERK/2抑制剂后肿瘤细胞UACC-1598中ERK1/2蛋白激酶 的磷酸化水平的Western Blotting图；

图5是MAPK-ERK1/2抑制剂作用后的UACC-1598细胞中期核型图；

A：+DMSO；B：+U0126；C：+PD 98059

图6是加入抑制剂后的肿瘤细胞双微体数目统计散点图；

图7是MAPK-ERK1/2抑制剂作用下肿瘤细胞双微体携带基因MCL1、MYCN 和EIF5A2扩增的实时定量PCR柱状图；

图8是肿瘤细胞双微体携带基因扩增分布荧光原位杂交图；

Green标记的RP11-54A4；Cy3标记的RP11-115J24

图9是加入抑制剂后的肿瘤细胞双微体携带基因扩增的荧光原位杂交条形统 计图；

图10是加入MAPK-ERK1/2抑制剂作用后UACC-1598细胞生长曲线图；

图11是加入MAPK-ERK1/2抑制剂作用后UACC-1598细胞细胞周期分布图；

A：+DMSO；B：+U0126；C：+PD 98059

图12是加入MAPK-ERK1/2抑制剂作用后UACC-1598细胞平板克隆形成示意 图；

图13是加入MAPK-ERK1/2抑制剂作用后UACC-1598细胞平板克隆形成统计 图；

图14是加入MAPK-ERK1/2抑制剂作用后UACC-1598细胞侵袭过重组基底膜 图（×400）。

A：+DMSO；B：+U0126；C：+PD 98059

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用 于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

实施例1MAPK-ERK1/2信号通路抑制剂对肿瘤细胞中双微体的影响

1、选择含有双微体的恶性肿瘤细胞为研究对象

从ATCC中选择含有双微体的恶性肿瘤细胞系作为研究对象，包括人卵巢癌细 胞系UACC-1598，人结直肠腺癌细胞系NCI-H716、人结肠腺癌细胞系NCI-H508、 人神经外胚层瘤细胞系SK-PN-DW、人髓性白血病细胞系HL-60和人胃腺癌细胞系 NCI-N87。

为了解每种细胞株含有双微体的情况，首先制备各种细胞株的中期染色体标 本。将处于对数生长期的UACC-1598、NCI-H716、NCI-H508、SK-PN-DW、HL-60 和NCI-N87细胞加入终浓度为0.01μg/mL的秋水仙素，37℃继续培养1-2h，将细 胞用吸管吹打下来，将细胞悬液转入离心管中1000r/min离心8min，PBS冲洗两 次，加入37℃预热的0.075mol/L的KCL，在37℃水浴中低渗作用11-15min，逐 滴加入1mL新鲜固定液（甲醇:冰醋酸=3:1）进行预固定，1500r/min离心5min， 弃上清加入10mL固定液，轻轻混匀，室温固定30min，1500r/min离心5min， 重复一次，弃上清，加入适当固定液混匀，将细胞悬液以一定高度滴于预冷的载玻 片上，室温晾干。Giemsa染液染色5min，流水冲洗，晾干。置于显微镜下观察， 拍照（图1所示）。

图1显示了每种细胞株的典型细胞中期分裂相（箭头所示为双微体）。

A：UACC-1598；B：NCI-H716；C：NCI-H508；D：SK-PN-DW；E：HL-60； F：NCI-N87。

观察到各种细胞中期分裂相中存在成对的双微体，双微体数目不等，每种细 胞株计数50-100个分裂相中的双微体，UACC-1598、NCI-H716、NCI-H508、 SK-PN-DW、HL-60和NCI-N87细胞株中所含双微体数目如图2所示，所含双微 体数目不等。UACC-1598双微体数目41.65±29.91对、NCI-H716双微体数目 51.89±28.99对、NCI-H508双微体数目27.25±21.27对、SK-PN-DW双微体数目 35.10±22.16对、HL-60双微体数目6.17±8.70对和NCI-N87双微体数目0.00±0.00 对。由此，初步选择UACC-1598、NCI-H716、NCI-H508、SK-PN-DW和HL-60这 5种含有双微体的细胞株为研究对象进行研究。

2、检测含有双微体的细胞株的MAPK信号转导通路活性状态

在人类肿瘤中经常出现MAPK-ERK1/2信号转导通路持续性地被激活， MAPK-ERK1/2等多级蛋白激酶被异常激活，持续处于磷酸化状态的情况。因此， 通过常规Western blotting技术检测UACC-1598、NCI-H716、NCI-H508、SK-PN-DW 和HL-60这5种含有双微体的肿瘤细胞株中ERK1/2蛋白激酶的磷酸化状态。

常规蛋白质提取，蛋白质浓度的测定，SDS-PAGE凝胶电泳，Western blotting 分析，用针对ERK1/2Thr202/Tyr204位点的特异性抗体 anti-phospho-ERK1/2(Thr202/Tyr204)抗体检测不同细胞中ERK1/2Thr202/Tyr204位 点的磷酸化水平。

结果见图3，在UACC-1598细胞中ERK1/2明显发生自身持续磷酸化，可用 ERK1/2Thr202/Tyr204位点特异性磷酸化抗体检测到，与在HEK 293T细胞中过表 达ERK1/2上游MEKK3蛋白激酶时ERK1/2Thr202/Tyr204发生位点磷酸化水平相 当；而其他几种细胞株几乎没有检测到ERK1/2Thr202/Tyr204位点的磷酸化。说明 UACC-1598细胞中ERK1/2蛋白激酶持续性地被激活，持续处于磷酸化活化状态。

3、MAPK-ERK1/2信号转导通路抑制剂对细胞中双微体的影响

从上述实验中确认UACC-1598中ERK1/2蛋白激酶处于持续磷酸化状态，选择 UACC-1598进行加入MAPK-ERK1/2抑制剂处理。

常用MAPK-ERK1/2信号转导通路抑制剂名称：U0126 （1,4-Diamino-2,3-dicyano-1,4-bis(o-aminophenylmercapto)butadiene，1,4-二氨基-2,3- 二氰基-1,4-双(邻氨基苯巯基)丁二烯）和PD98059 （2-(2-Amino-3-methoxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one，2-(2-氨基-3-甲氧基苯 基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮），购自德国Calbiochem公司（U0126，货号#662005；PD 98059货号#513000）。

两种特异性抑制剂U0126和PD 98059可降低ERK1/2蛋白激酶的磷酸化水平 （图4）。

细胞中双微体的产生及维持存在是随细胞周期进行的缓慢进行的过程和状态。 具体操作方法：用低浓度MAPK-ERK1/2信号转导通路抑制剂U0126 10μg/mL和 PD98059 10μg/mL持续加入培养液作用UACC-1598细胞两周，检测对UACC-1598 中双微体的影响。

（1）双微体数目检测

在U0126和PD 98059抑制剂作用UACC-1598细胞两周后，检测细胞中双微 体的数目情况（图5）。结果通过分别计数每组60-100例中期分裂相的双微体，我 们检测到在加入U0126和PD 98059抑制剂的UACC-1598细胞组，双微体数目明 显减少，通过统计学方差分析SNK两两比较法（Student-Newman-Neuls），*P<0.05， 有统计学意义（图6）。

通过以上实验，发现抑制MAPK-ERK1/2信号转导通路活性可减少ERK1/2 蛋白激酶处于持续活性状态的UACC-1598细胞中的双微体数目。

（2）双微体携带基因水平检测

已知UACC-1598细胞中双微体上携带MCL1、MYCN和EIF5A2基因扩增，接 下来，通过实时定量PCR和荧光原位杂交技术检测MAPK-ERK1/2抑制剂作用下 MCL1、MYCN和EIF5A2基因的扩增水平。

①实时定量PCR检测双微体携带基因扩增水平

抑制剂作用UACC-1598细胞14天时，按QIAamp DNA Extract Kit说明书操作 提取细胞总DNA。检测已知的UACC-1598细胞中双微体上携带的基因MCL1、 MYCN和EIF5A2的DNA扩增水平。检索NCBI Gene数据库，获得MCL1、MYCN 和EIF5A2基因序列，应用Primer3.0 software设计并合成基因特异性引物。所用引 物由Invitrogen公司合成，序列如下：

hMCL1-F：5'-CTGGAGATTATCTCTCGGTAC-3'

hMCL1-R：5'-CTGACTCGTTTCGGTTTC-3'

hMYCN-F：5'-ACCACAAGGCCCTCAGTAC-3'

hMYCN-R：5'-GCAACGGCATTCTCTCAG-3'

hEIF5A2-F：5'-TACTTGGCAGAGATTAAACAGG-3'

hEIF5A2-R：5'-ACAAAGTATTTGCACCTTGAAG-3'

hACTB-F：5'-ACCGCGAGAAGATGACCCAG-3'

hACTB-R：5'-TTAATGTCACGCACGATTTCCC-3'

将qPCR反应体系加入96孔板中，在Roche LightCycler480型荧光定量PCR仪 SYBR Green I/HRM Dye(465-510)系统下运行。每一样本测量3次，按照说明书提 供的最佳反应条件，94℃4min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，共45个循环； MCL1、MYCN和EIF5A2的DNA扩增水平以ACTB为内参进行比较，计算不同实 验的数据平均值±标准差。统计方差分析SNK两两比较法（Student-Newman-Neuls） （*P<0.01）。

结果如图7所示，MAPK-ERK1/2抑制剂作用UACC-1598细胞两周时，与对照 组相比，MCL1、MYCN和EIF5A2的DNA扩增水平明显下降。说明抑制 MAPK-ERK1/2信号转导通路活性会通过减少UACC-1598细胞中双微体数目而减 少双微体上携带MCL1、MYCN和EI5A2的基因扩增。

②荧光原位杂交技术检测双微体携带基因扩增水平

以覆盖MCL1和EIF5A2基因的BAC克隆RP11-54A4和RP11-115J24作为模 板通过Green或Cy3标记FISH探针。与加入抑制剂和对照组中期分裂相玻片上， 进行荧光原位杂交。用安装有CCD摄像头的ZEISS Axioskop荧光显微镜观察间期 细胞中荧光信号，图像拍摄并进行图像分析。

每组分别计数80-100个细胞，将杂交信号结果进行分类，杂交信号覆盖细胞面 积分为<30%，30%~60%和>60%，同时分为分散型杂交信号和聚集型杂交信号，结 果如图8所示。统计分析，绘图，多样本比较的Ridit分析，结果如图9所示，MCL1 和EIF5A2的相应BAC克隆RP11-54A4（MCL1）和RP11-115J24（EIF5A2）为探 针的荧光信号与UACC-1598细胞杂交，与对照组相比，抑制剂组信号分布减少， 说明抑制剂作用后双微体上携带的基因扩增减少。

4、MAPK-ERK1/2信号转导通路抑制剂对细胞生物学行为的影响

（1）绘制细胞生长曲线检测MAPK-ERK1/2抑制剂对UACC-1598细胞增殖能 力的影响

将加入抑制剂和对照组UACC-1598细胞分别按每孔0.5×10⁴个接种入96孔板 培养。次日开始每天取3孔计数，取平均值作为日平均细胞数，连续计数6天，绘 制细胞生长曲线，结果如图10所示。与UACC-1598对照组细胞相比，加入抑制剂 后细胞生长速度明显降低，*P<0.01，说明抑制剂可降低细胞增殖能力。

（2）流式细胞术检测细胞周期

用MAPK-ERK1/2抑制剂作用两周的UACC-1598细胞，双微体数目及携带基 因扩增减少，细胞周期是否会发生变化，应用流式细胞术检测细胞周期的分布情况。 分别收集U0126和PD98059作用两周的UACC-1598细胞及对照组细胞，胰酶消 化，全培养液终止消化，1500r/min离心5min沉淀细胞，之后用冷的PBS洗3 次重悬细胞，1500r/min离心5min。之后用75%的冷乙醇，4°C固定过夜（超过 24h），之后再用冷的PBS洗两遍。依cycle TEST^TM PLUS DNA试剂盒提供的操作 步骤进行，行流式细胞术检测细胞周期的改变，重复3次。

结果如图11和表1所示，MAPK-ERK1/2抑制剂作用后，细胞周期分布中，G1 期细胞分布减少，S+G2期细胞分布增多，卡方检验，*P<0.01，**P<0.0001有统计 学意义，说明DNA合成减慢，细胞增殖不旺盛。

表1MAPK-ERK1/2抑制剂作用后UACC-1598细胞周期分布

（3）细胞克隆形成实验检测MAPK-ERK1/2抑制剂对UACC-1598细胞克隆形 成能力的影响

将加入抑制剂和对照组UACC-1598细胞分别按每孔2000个接种入6孔板培养。 14日后MTT染色，结果如图12和图13所示。与UACC-1598对照组细胞相比，加 入抑制剂后细胞克隆形成数目明显降低，方差分析后，两两比较，*P<0.01，说明抑 制剂可降低细胞增殖能力。

（4）重组基底膜实验检测MAPK-ERK1/2抑制剂对细胞侵袭能力的影响

应用BD BioCoat^TM Matrigel^TMInvasion Chamber对加入抑制剂和对照组细胞进 行重组基底膜侵袭实验。从-20℃取出侵袭小室放入24孔板中，室温放置，向24孔 板和Transwell小室加入热的（37℃）500μL无血清1640培养基，放入CO₂孵箱中 于37°C条件下水化2h。水化后，小心的将液体移出，不要碰到matrigel基底膜。 分别取加入抑制剂和对照组细胞，PBS冲洗1次，胰酶消化，用无血清1640培养 基重悬细胞。吸取部分细胞悬液进行细胞计数。依细胞浓度吸取适量细胞悬液，使 细胞含量为1×10⁶个细胞/mL，以无血清1640培养基稀释细胞悬液至500μL，待用。 向24孔板中加入750μL全培养基，之后，将小室放入24孔板中，注意小室膜下不 要产生气泡。迅速加入500μL细胞悬液（5×10⁴个细胞/孔），镜下观察，吹打均匀。 37℃孵箱中，培养24h。每种细胞种3个复孔。取出24孔板，用干净的棉签轻轻 擦除小室膜上未穿过膜的细胞。膜在无水甲醇中固定1min，水洗两遍。苏木素染 色5min，水洗干净（至无色），伊红染色1min，水洗干净。晾干，用手术刀片将 膜切下，光镜下观察，拍照（做完后最好立即照相），计数100倍镜下每孔3个视 野的阳性孔数（穿过细胞）和阴性孔数（未穿过细胞），其中膜孔内紫色深染的为 穿过膜的细胞（图14）。

结果显示，加入MAPK-ERK1/2抑制剂后UACC-1598细胞穿过基底膜数目较 对照组明显减少（表2），数据经统计学卡方检验分析，*P<0.0001，有统计学意义。 由此说明加入MAPK-ERK1/2抑制剂后UACC-1598细胞的侵袭能力下降，细胞恶 性程度降低。

表2MAPK-ERK1/2抑制剂作用后UACC-1598细胞侵袭能力下降

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性 的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进 行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。