一种预测干扰素治疗慢性乙型肝炎疗效的血浆miRNA谱及检测试剂盒

技术领域

　　本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体地，涉及血浆miRNA表达水平预测干扰素治疗慢性乙肝疗效。本发明还涉及检测miRNA水平的方法和试剂盒。

背景技术

乙型肝炎病毒（HBV）感染能引起慢性肝脏疾病并显著增加罹患肝细胞癌的风险。虽然已广泛使用乙肝表面抗原重组抗原疫苗预防感染，HBV感染仍然是世界各国的重要健康问题。干扰素α与核苷类似物，如拉米夫定、阿德福韦、恩替卡维、替比夫定等是HBV感染的主要治疗药物。干扰素治疗通常只能在有限的病人中获得完全应答，中止治疗后容易复发。近年来应用聚乙二醇化干扰素(又称长效干扰素，主要有PEG-IFNα2a, PEG-IFNα2b两种)显著提高了e抗原血清转换(PEG-IFNα2a 32% ， PEG-IFNα2b 36%) 和一小部分病人表面抗原血清转换(2.9%， PEG-IFNα2a)。然而，长效干扰素容易引发如流感样症状、抑郁、性格改变等副作用。核苷类似物，如拉米夫定、阿德福韦、恩替卡维、替比夫定等，是乙肝逆转录聚合酶的有效抑制剂，能阻断病毒基因组复制。但是，这类药物治疗不能获得较高的血清转换率，且有很大一部分病人在停止用药后复发。另外，长期使用容易引起耐药突变的形成。

尽管近些年在慢性乙肝的治疗手段、病毒血清转换率和病毒学应答方面都有了显著提高， 慢性乙肝的治疗效果仍不够理想。特别是长效干扰素对于发展中国家的低收入家庭非常昂贵。因此，目前急需能够在治疗前预测干扰素治疗效果的方法，从而为个人化治疗提供解决方案。

目前已知的与治疗预后相关的因素有： 1. 治疗前ALT水平， 2. 治疗前HBV DNA, 3. 性别， 4. 肝脏组织学状态， 5. 治疗过程中HBsAg低度变化动态。 然而，目前的指标的预测能力有限，急需一种能在血液中中检测的，有较高预测准确度的分子标记。

发明内容

本发明要解决的技术问题是确定一种能在血液中中检测的，有较高预测准确度的分子标记。

近年来的研究显示小非编码RNA（约22和核苷酸），又称小RNA（microRNA,miRNA）。小RNA存在于各类组织中，能通过与靶mRNA3’未翻译末端核苷酸配对促进其降解或抑制翻译。miRNA是由长前体RNA进行转录产生，并被Drosha（一种核酸酶）预处理后通过exportin-5介导的出核过程转运到细胞浆。miRNA进一步被DICER酶剪切，最后形成17-24个核苷酸的成熟miRNA，并与RISC复合体结合，执行基因沉默功能。小RNA是一类在血浆中存在的短核苷酸，已有报道证明可以作为肝脏损伤和妊娠的非常敏感的分子标记。

本发明经过大量研究，确定了一种预测干扰素治疗慢性乙型肝炎疗效的血浆miRNA谱，该miRNA谱包括SEQ ID NO 1-11中一个或多个miRNA。

并且，根据该miRNA谱提供了一种预测干扰素治疗慢性乙型肝炎疗效的试剂盒，该试剂盒含有针对SEQ ID NO 1-11中一个或多个miRNA特异性探针核苷酸。

同时，提供了一种预测干扰素治疗慢性乙型肝炎疗效的芯片，该芯片含有针对SEQ ID NO 1-11中一个或多个miRNA特异性探针核苷酸。

本发明还提供了一种预测干扰素治疗慢性乙型肝炎疗效的方法，即检测SEQ ID NO 1-11中一个或多个miRNA在使用干扰素前血浆、血清样品中表达水平，对样品中表达水平与标准水平差异利用统计方法分析预测干扰素疗效。

所述miRNA中至少一种的表达水平高于或者低于已知的标准水平。

具体的，该方法包括步骤：（1） 血浆、血清样本小RNA的抽提， （2）   核酸样本与具有如SEQ ID No.1-11中一个或多个miRNA特异性探针的芯片进行杂交， （3） 对杂交信号与对照样本的杂交结果进行比较。

所述的统计方法是分析样品中表达水平与标准水平差异的显著性。

所述的统计方法包括： miRNA表达谱通过最大关联度最小冗余度分析对每个miRNA评分；利用近邻分类算法作为预测引擎进行类别判断；特征值递增分析法和留一法交叉验证优化入选miRNA的数量。

本发明中，乙肝病人治疗前部分miRNA的表达谱能够预测干扰素α治疗效果，并据此公开了相关miRNA的检测方法、预测模型建立的方法及检测试剂盒。

本发明提供了一个独特的能够区分HBV患者是否对长效干扰素或普通干扰素治疗应答（初期病毒学应答，治疗12周大于2log HBVDNA 降低）的miRNA表达谱。此表达谱由hsa-let-7a SEQID NO.1/11，hsa-miR-30a  SEQID NO.2/11, hsa-miR-1290 SEQID NO.3/11, hsa-miR-106b SEQID NO.4/11, hsa-miR-1224-5p SEQID NO.5/11, hsa-miR-939 SEQID NO.6/11, hsa-miR-1281 SEQID NO.7/11, hsa-miR-198 SEQID NO.8/11, hsa-let-7f SEQID NO.9/11, hsa-miR-22 SEQID NO.10/11, hsa-miR-638 SEQID NO11/11组成。本发明提供了血清miRNA表达谱的检测方法， 具体而言，该方法包括步骤， （1）抽提血浆总RNA， （2） 利用微阵列结束检测总RNA中特定miRNA的表达谱。 可以按照本领域的常规方法操作。

所述的统计方法使用logistic回归分析结合miRNA SVM 预测模型进行类别判断。

所述的统计方法包括下列各项中的一个或者几个：（1）miRNA表达谱通过 OneR 方法对每个miRNA评分， （2）支持向量机(Support Vector Machine)作为预测引擎进行类别判断， （3）特征值递增分析法（IFS）和留一法交叉验证优化入选miRNA的数量。

利用本发明的miRNA表达谱分析了66例接受长效干扰素治疗的HBV患者样本，其敏感度为 73.3%和特异度 75%。 此miRNA谱由11个特异的核苷酸序列组成，其表达在无应答和快速应答组中有显著差异。

本发明进一步在28例接受普通干扰素治疗的HBV患者中验证了此预测模型，并取得71.4%的准确度。 

本发明提供了一种miRNA表达谱,能够以较高准确度预测预测干扰素治疗慢性乙型肝炎疗效。与其他已知与疗效相关因素相比，此表达谱是一个独立的预测因素。此表达谱与HBV耐药突变分析结合将有助于个体化治疗方案的开展，最终降低治疗费用并提高完全应答的比例。相应的检测方法方便、快速，成本较低。本发明同时还提供了高效、低廉的相应的检测试剂盒和芯片。

附图说明

图1. 优化能够预测干扰素疗效的miRNA谱流程图。

图2. 干扰素疗效预测的IFS（递增特征值）曲线图。 X轴， 特征值的数量， Y轴， 去一交互检验准确度。在选取10个特征值时到达准确度达到最高。 

图3. A.各临床参数与miRNA预测系统的优势比; B. 单独miRNA模型（上图）和加入ALT后（下图）logistic回归模型的分类图。

具体实施方式

实施例1：miRNA表达谱的检测

一.        实验材料：

本发明从94例接受长效干扰素和普通干扰素的慢性乙肝患者中获得血浆和血清样本。本研究通过了伦理委员会的审核，所有病人都签署了知情同意书。训练集包括66例接受EG-IFN α2a (180μg/周) 或 PEG-IFN α2b (100μg/周)的HBV患者，测试集中包括28例接受普通干扰素(IFN-α2b 或IFN-α1b， 3-5MU/qod)的HBV患者。入组病人的基本临床数据表1所示，其中81.9%为e抗原阳性，平均病毒载量为7.05 log₁₀ 拷贝/毫升。入组排除标准： 入组的HBV患者在开始治疗前6个月未接受核苷类似物或干扰素治疗， 病毒载量在5×10⁴ 拷贝/ml以上， 肝脏谷丙转氨酶不正常 (>1.0 ULN). 排除标准包括HIV或HCV共感染。 所有病人都检测了HBV表面抗原， e抗原 （雅培 AXSYM HBsAg (正常值: 0–2S/N) and HBe 2.0 MEIA Kit (正常值: 0–1.0S/CO)， 病毒载量通过定量PCR检测（匹基生物）。快速应答定义为在治疗开始后12周HBVDNA有大于2log的降低， 小于2log的降低定义为无应答。

二.        实验方法

RNA抽提和miRNA芯片

使用mirVana? PARIS?  (Ambion, Austin, TX)试剂盒，从400μl血浆样本中抽取总RNA。 RNA浓度通过NanoDrop 1000光谱仪定量(NanoDrop Technologies, Waltham, MA)。从福尔马林固定石蜡包埋标本（FFPE）中抽提RNA使用Qiagen RNAeasy FFPE试剂盒。简要操作步骤如下：用手术刀将FFPE标本从载玻片上刮下， 并用二甲苯脱蜡，离心去除二甲苯后，加入100%乙醇去除残留二甲苯。 经全速离心和空气干燥后， FFPE标本通过的蛋白酶K分别在55℃ 消化15分钟， 80℃消化15分钟。经过gDNA离心柱去除基因组DNA后，样本再经过RNeasy柱，洗涤两遍后用无核酸酶水洗脱。

miRNA芯片检测

本发明使用人miRNA芯片(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)比较了94份血浆标本和13份FFPE标本. 此芯片包含Sanger 数据库V12.0 851种人类miRNA。 将样本总RNA通过Cy3标记，并与芯片杂交，经洗涤后芯片通过G2505C((Agilent Technologies, Santa Clara, CA)扫描仪进行扫描。 标记和杂交过程都按照agilent miRNA芯片系统标准操作进行。 芯片图像信息通过扫描软件Rev. 5.0 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)进行分析，转化为强度信息。 通过背景去除，芯片信号导出到GeneSpring GX10软件(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)进行标准化再进行进一步分析。

三.        实验结果

对94例接受干扰素治疗的HBV病人进行了miRNA表达谱检测。 

本发明区分不同初始病毒学应答的策略如图1所示。一共66例信息充分的病例入组为训练组，通过将miRNA表达谱经训练后模型在28例的测试病例中进行验证。两组病人的基本临床水平相似（表1）， 两组的初始应答率分别为45.5% 和 35.7% (p 值 0.4948, Fisher’s exact test)。

表1.病人的临床基本数据。

注： ^a括号中为百分数. ^b Fisher’s exact test. ^c非配对t检验. ^d 只统计了基因型B与C. 

实施例2：统计分析及预测模型的建立

一.        试验方法：

特征值排序：本发明使用weka软件包中OneR方法对miRNA进行排序。OneR方法通过比较特征值的频率表和疗效的相互关系对各个特征进行打分。

支持向量机(SVM)

支持向量机（SVM）是由统计学习算法演化而来，是目前很多复杂的二元分类算法中最有效的方法之一。 本研究使用R软件来训练和测试SVM分类模型。

本发明使用了留一交叉检验法来评价预测模型的表现。在此方法中，每个数据依次被去除作为其他数据的测试数据，通过多次检测来训练预测引擎。最后的总预测准确度的计算方法如下：

TP为真阳性, TN为真阴性, FP假阳性，FN 假阴性

特征值递增分析法（IFS）

mRMR分析之后得到了每个特征值对于预测相关度的评分。下一步为了选取最优的特征值数量，我们使用了IFS方法。通过使用不同数量的特征值，我们建立了不同的NNA预测模型。 留一法交叉检验进一步对不同的预测模型进行测试评价。通过计算每个模型的总体预测准确度，得到了IFS曲线，当IFS曲线达到最高时就获得了最优的特征值数量。

其他分析

使用单因素和多因素logistic回归分析来评价已知的疗效相关因素和miRNA预测模型的优势比。miRNA靶基因的预测使用了miRanda, RNAhybrid 和 TargetScan网上预测服务。

二.            结果

寻找干扰素治疗效果相关miRNA谱

本发明首先在66例HBV病人中对治疗前miRNA表达谱与疗效相关性进行打分，OneR法评价得到与疗效最相关的评分（表2）。

接着，本发明使用支持向量机（SVM）进行预测，留一法交叉验证进一步验证预测表现。为了确定纳入预测引擎的最优的MiRNA数量，IFS曲线分析评价了不同特征数量的预测准确度（图3）。 最高的预测准确度在11个miRNA纳入计算是达到最高（表2）。十一个miRNA组成的模型得到总体预测准确率为74.2%。

表2. 所选miRNA的Maxrel得分和fisher 检验结果。

实施例3 对28例接受了普通干扰素治疗样本的预测

本发明进一步测试了这11个miRNA的预测模型是否能在一个28例病人组成的测试集中有效区分初始病毒学应答。 如表1所示，测试集和训练集的基本临床数据是相似的，只是测试集病人接受了普通干扰素治疗。由于不同干扰素制备会引起体内有效药物浓度的差异，这有可能会影响预测的表现。尽管如此，在训练集中我们仍然得到了71.4%的总体预测准确率。

miRNA预测模型与已知疗效相关因素的比较

本发明进一步进行了单因素和多因素Logistic回归分析来评价miRNA模型是否是与疗效相关的独立预测因子。

单因素回归分析显示， miRNA模型的优势比达到7.35（p=2.12 E-05）,是一个显著的独立相关因素。此分析也发现ALT是一个显著的因素（优势比1.47， p=0.002），而女性（p=0.127），HBVDNA(<5×107 与 ≥5×107相比, p=0.078)和基因型（B型 与C型相比, p=0.290）都没有获得显著性。进一步多因素回归显示miRNA与ALT都是与疗效独立相关的因素，优势比分别为1.37， 6.62 （p=0.029，p=2.00E-04.表3, 图3A) 

表3. 与病毒学应答相关因素的单变量和多变量Logistic回归分析。

^a 此分析在整个队列中进行分析 (n=94).

    本发明进一步将miRNA预测模型与ALT水平这两个因素合并，使用logistic回归模型建立分类图。如图三B所示， 将两个因素合并后， 预测敏感度由68.2%提高到71.7%， 特异度由77.3%提高到81.6%， 总准确率由73.4%提高到77.3%。 因此，利用血浆miRNA谱结合病人临床信息（ALT）能显著提高预测的准确率。

SEQUENCE LISTING

<110>  上海市公共卫生临床中心

<120>  一种预测干扰素治疗慢性乙型肝炎疗效的血浆miRNA谱及检测试剂盒

<130>  1016

<160>  11    

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  22

<212>  RNA

<213>  Artificial

<400>  1

ugagguagua gguuguauag uu                                              22

<210>  2

<211>  22

<212>  RNA

<213>  Artificial

<400>  2

uguaaacauc cucgacugga ag                                              22

<210>  3

<211>  19

<212>  RNA

<213>  Artificial

<400>  3

uggauuuuug gaucaggga                                                  19

<210>  4

<211>  21

<212>  RNA

<213>  Artificial

<400>  4

uaaagugcug acagugcaga u                                               21

<210>  5

<211>  24

<212>  RNA

<213>  Artificial

<400>  5

uggggagcug aggcucuggg ggug                                            24

<210>  6

<211>  21

<212>  RNA

<213>  Artificial

<400>  6

caucccuugc augguggagg g                                               21

<210>  7

<211>  17

<212>  RNA

<213>  Artificial

<400>  7

ucgccuccuc cucuccc                                                    17

<210>  8

<211>  22

<212>  RNA

<213>  Artificial

<400>  8

gguccagagg ggagauaggu uc                                              22

<210>  9

<211>  22

<212>  RNA

<213>  Artificial

<400>  9

ugagguagua gauuguauag uu                                              22

<210>  10

<211>  22

<212>  RNA

<213>  Artificial

<400>  10

aagcugccag uugaagaacu gu                                              22

<210>  11

<211>  25

<212>  RNA

<213>  Artificial

<400>  11

agggaucgcg ggcggguggc ggccu                                           25