一种天女木兰种子石蜡切片方法

技术领域

本发明涉及一种植物种子石蜡切片方法，特别涉及一种天女木兰种子种胚石蜡切片方法。

背景技术

天女木兰（Magnolia sieboldii K.Koch.）是木兰科的落叶小乔木，是稀有的观赏植物，为国家三级重点保护植物，也是我国东北地区唯一的野生木兰属植物。

天女木兰种子具有生活力较低，休眠期长，萌发率极低，发育不整齐等特性。大大限制了天女木兰有性生殖的成功率，从而导致林下天然更新苗严重缺乏。天女木兰育苗技术复杂，繁殖难度大，特别是用种子繁殖速度非常慢。因此，开展对天女木兰种子休眠与萌发的研究既具有学术价值，又具有一定的实际意义。胚是种子萌发的主体，种胚后熟是天女木兰种子发育不整齐的主要原因，而对天女木兰种胚萌发的研究少有报道。

石蜡切片是组织学研究的重要实验技术，基本步骤包括样品的取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、粘片、脱蜡、染色和封片等一系列特殊处理。实验步骤并不繁复，但要制出高质量的切片，每一个步骤的操作都很重要，尤其是脱水透明阶段，不同植物不同组织对药品的兼容性有很大差异，需要进行摸索和改进。而天女木兰种胚石蜡切片技术方面的相关研究报道很少。

综上所述，如果能找到天女木兰种胚石蜡切片的制备方法，为研究天女木兰种子休眠和萌发提供准确的技术支持，对揭示天女木兰种子休眠机理具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于：针对天女木兰种子种胚小，胚乳多且胚乳油脂含量高，浸蜡难等原因造成种子切片制作操作难，观察效果不佳等问题，找到一种操作简单方便的天女木兰种子种胚石蜡切片的制备方法，使制作的切片组织结构完整，清晰，易于观察。

本发明技术方案如下：

1.一种天女木兰种子石蜡切片方法，其特征在于按如下步骤进行：

（1）取材与固定

种子选取：将去除假种皮的饱满的天女木兰种子用浓度0.2%高锰酸钾溶液消毒30min，用流水冲洗干净；

样品固定：将洗净的种子用吸水纸吸干种子表面水分，剥去种皮，将种子迅速放入盛有FAA固定液的小瓶中固定，4℃冰箱放置，固定24-72h ；

（2）脱水：固定的材料依次经过65%→75%→85%→95%→100%→100%系列浓度的乙醇溶液逐级脱水，每个浓度梯度脱水时间依次2h→1.5h→1.5h→1h→30min→15min；

（3）透明：经4/5无水乙醇+1/5二甲苯→3/5无水乙醇+2/5二甲苯→2/5无水乙醇+3/5二甲苯→1/5无水乙醇+4/5二甲苯→纯二甲苯→纯二甲苯，不断增加二甲苯的体积比例，逐级透明，每级透明时间依次为1.5h→1.5h→1.5h→1.5h→40min→20min；

（4）浸蜡：将材料透明彻底的小瓶倒出1/2或2/3的二甲苯，然后将熔点为52-54℃的石蜡蜡屑放入小瓶中，一直加到二甲苯完全饱和；在40℃下浸蜡24h，之后再用混合石蜡在温箱中60℃保温浸蜡，每天换两次混合蜡液，浸蜡72-120h；混合蜡液是由熔点为58-60℃和熔点为50-52℃的石蜡按重量比1:1的比例融合而成；

（5）包埋：材料浸蜡结束后马上用镊子轻轻转移到装有液态混合石蜡的小纸盒中，调整好材料位置，再将小纸盒放在盛有冰水的盆中迅速冷却，待蜡液表面凝固后，迅速倒扣纸盒沉入水中，然后让其自然漂浮于水中，防止产生结晶；

（6）切片：根据材料在蜡块中的位置和方向，将蜡块修成小梯形，然后粘到切片机的蜡台上进行切片，切片厚度6-8μm；

（7）粘片：在洁净的载玻片上均匀涂薄层质量体积比为2%明胶，将蜡带小心地放载玻片上，用蘸有水的毛笔移动蜡带以调整位置，待蜡带展平后，将载玻片放在30-35℃水浴锅上2h，使蜡带光面紧贴载玻片；之后再将载玻片放入38℃烘箱中烘干；

（8）脱蜡：在染色缸中用纯二甲苯30℃保温脱蜡40min，之后倒掉二甲苯，晾干切片；

（9）封片：切片从染色缸中取出，待二甲苯未挥发完全之前，在材料中央滴1滴中性加拿大树胶，将盖玻片一侧放置在滴有树胶的组织切片上，慢慢放下盖玻片并将空气完全排除；封好的切片放入40℃恒温箱中干燥过夜，制成永久切片。

2.根据权利要求1所述的天女木兰种子石蜡切片方法，其特征在于：FAA固定液组成为：浓度38%甲醛、冰醋酸和浓度70%乙醇，三者体积比为1：1：18。

本发明的积极效果是：找到了一种适宜天女木兰种子石蜡切片的制备方法，使制作的切片组织结构完整，清晰，易于观察，为天女木兰种子发育、种子休眠解除过程的形态及细胞生物学观察提供切实的技术支持和保障，为进一步揭示具有种胚后熟特性的一类种子种胚发育规律、有效开展相关分子机理的研究奠定科学基础。

附图说明

图1是光学显微镜下天女木兰种子层积 0d种胚生长状态图（×100）；

图2是光学显微镜下天女木兰种子层积 35d种胚生长变化图（×100）；

图中vt:维管组织。

图3是光学显微镜下天女木兰种子层积 65d种胚生长变化图（×100）；

图4是光学显微镜下天女木兰种子层积 110d种胚生长变化图（×100）；

图5是光学显微镜下天女木兰种子层积 150d种胚生长变化图（×100）；

图中en:胚乳  pl:胚芽  cot:子叶  hyp:胚轴。

图6是光学显微镜下天女木兰发芽种子生长变化图（×100）；

图中vb:维管束。

具体实施方式

成功制备了天女木兰种子变温层积0、35、65、110、150d以及发芽种子的石蜡切片。

1．取材：2011年9月下旬收获天女木兰种子。

2．种子的预处理

（1）种子筛选：将种子浸泡于清水中72h，去除上浮的不充实种子。

（2）去假种皮：筛选后的种子用手揉搓，去除种子假种皮。

（3）种、沙消毒：用浓度0.2%的高锰酸钾溶液对种子进行30min消毒处理，对河沙进行1h消毒处理，再用流水冲洗干净。

（4）湿沙层积：将种子与含水量60%的湿沙以重量比例1:3混拌进行交替变温层积催芽高温12-14℃，低温0-5℃，每隔5d变温一次，150d。

（5）定期取样：在层积0、20、35、50、65、80、95、110、130、150d定期取样，用流水冲洗种沙混合物，去沙留种。

3．样品固定：将洗净的种子用吸水纸吸干种子表面水分，剥去种皮，将种子迅速放入盛有FAA固定液的青霉素药瓶中固定，4℃冰箱放置，固定24-72h。FAA固定液组成为：浓度38%甲醛、冰醋酸和浓度70%乙醇，三者体积比为1：1：18。

4．脱水：固定的材料依次经过65%→75%→85%→95%→100%→100%系列浓度的乙醇溶液逐级脱水，每个浓度梯度脱水时间依次2h→1.5h→1.5h→1h，100%乙醇分两次进行，第一次 30min，第二次 15min。

5．透明：经4/5无水乙醇+1/5二甲苯→3/5无水乙醇+2/5二甲苯→2/5无水乙醇+3/5二甲苯→1/5无水乙醇+4/5二甲苯→纯二甲苯→纯二甲苯，不断增加二甲苯的体积比例，逐级透明，每级透明时间为1.5h，纯二甲苯透明时间第一次40min，第二次20min。

6．浸蜡：将材料透明彻底的小瓶倒出1/2或2/3的二甲苯，然后将低熔点的石蜡蜡屑(熔点为52-54℃)放入小瓶中，一直加到二甲苯完全饱和，在40℃条件的恒温箱中浸蜡24h。然后用混合蜡液（由熔点为58-60℃和熔点为50-52℃的石蜡1:1混合）在恒温箱中60℃保温浸蜡，每天换两次混合蜡液，浸蜡72-120h。

7．包埋：材料浸蜡结束后立即用镊子轻轻转移到装有液态上述混合石蜡的小纸盒中，调整好材料位置，再将小纸盒放在盛有冰水的盆中迅速冷却，待蜡液表面凝固后，迅速倒扣纸盒沉入水中，然后让其自然漂浮于水中，防止产生结晶。

8．切片：根据材料在蜡块中的位置和方向，将蜡块修成小梯形，然后粘到切片机的蜡台上进行切片，切片厚度6-8μm。

9．粘片：在洁净的载玻片上均匀涂薄层质量体积比为2%明胶，将蜡带小心地放载玻片上，可以用蘸有水的毛笔移动蜡带以调整位置，待蜡带展平后，将载玻片放在30-35℃水浴锅上2h，使蜡带光面紧贴载玻片。之后再将载玻片放入38℃烘箱中烘干。

10．脱蜡：在染色缸中用纯二甲苯30℃保温脱蜡40min，之后倒掉二甲苯，晾干切片。

11．封片：切片从染色缸中取出，待二甲苯未挥发完全之前，在材料中央滴1滴中性加拿大树胶，将盖玻片一侧放置在滴有树胶的组织切片上，慢慢放下盖玻片并将空气完全排除。封好的切片放入40℃恒温箱中干燥过夜，制成永久切片。

12．镜检和照相：将切片置于Motic显微镜下观察并照相，将合格的切片贴上标签，以便再次观察和照相。