一种忍冬叶中咖啡酰奎宁酸类提取物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种忍冬叶中咖啡酰奎宁酸类提取物及其制备方法和用途，属于天然产物化 学技术领域。

背景技术

忍冬(Lonicera japonica Thunb.)为忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬属(Lonicera)多年生 常绿缠绕藤本植物，是我国传统中药，具有清热解毒、抗菌消炎等多种药用功效。忍冬药用 部位在历史上经历了茎叶-茎叶花-花的变迁历程。目前，忍冬不同药用部位在《药典》中区 分开来，金银花(Jinyinhua，Lonicera japonica flos)，本品为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica  Thunb.的干燥花蕾或带初开的花。夏初花开放前采收，干燥”。忍冬藤(Rendongteng，Lonicera  japonica caulis)，本品为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥茎枝。秋、冬二季采 割，晒干”。忍冬花因其产量有限，常供不应求。而忍冬叶与花同株，为了保证花蕾的正常 生长，忍冬需多次修剪整形，每年可得大量的叶，而这些忍冬叶为忍冬传统的废弃部分，一 直被视为非药用部位而长期未得到利用，浪费现象十分严重。

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起 的主要侵害鸡和火鸡等禽类的一种急性、高度接触性传染病，被国际兽医局列为对动物危害 最大的A类传染病。尽管国内对ND采取了密集的预防措施，但是缺乏有效的防治药物，其发 病率一直居高不下，仍是目前影响养鸡业健康发展的主要传染病之一。

目前，国内、外关于忍冬及其提取物的药用报道主要是关于艾滋病防治、抗癌、抗炎和 止痛等方面，未见有关于忍冬叶中咖啡酰奎宁酸类提取物用于防治新城疫病毒的报道。鉴于 当前新城疫病毒疾病的发生和流行速度已经超过疫苗的研制速度，以及农业部2012年发文的 禁止将人类使用的抗病毒药物，如金刚烷胺、金刚乙胺、阿昔洛韦、利巴韦林等应用到家畜 药物中，以保障家畜产品安全；因此，将天然植物提取物开发成适合于新城疫病毒防治的药 物势在必行。

发明内容

针对上述现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种忍冬叶中咖啡酰奎宁酸类提取 物及其制备方法。

本发明的另一目的是提供该咖啡酸奎宁酸提取物在制备抗新城疫病毒药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种忍冬叶中咖啡酰奎宁酸类提取物，所述提取物中咖啡酰奎宁酸的重量百分含量为 65-76％。

本发明的忍冬叶中咖啡酰奎宁酸类提取物的制备方法，步骤如下：

(1)取忍冬叶，用8-10倍量(g/ml)的乙醇溶液回流提取，滤过，合并滤液，减压浓缩 至相对密度为1.0-1.1(50℃测)，得初提液；

(2)将步骤(1)制备的初提液，加入等体积的蒸馏水制成悬浮液，将悬浮液用正丁醇 进行萃取，正丁醇相减压浓缩至相对密度为1.2-1.3(50℃测)，得正丁醇萃取物；

(3)将步骤(2)制备的正丁醇萃取物采用聚酰胺填料进行富集分离，洗脱溶剂为乙醇- 水，乙醇、水的体积比为10:90～20:80；

(4)合并步骤(3)洗脱后的溶液，浓缩，得浸膏，即为咖啡酰奎宁酸类提取物。

经检测，该方法制备的提取物中，咖啡酰奎宁酸类化合物的重量百分含量为65-76％，所 述咖啡酰奎宁酸类化合物主要包括绿原酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、 4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、隐绿原酸和新绿原酸。

本发明还提供了该忍冬叶中咖啡酰奎宁酸类提取物在制备抗新城疫病毒的药物中的应 用。

本发明还提供一种抗新城疫病毒的药物制剂，该药物制剂以含有药学有效量的忍冬叶中 咖啡酰奎宁酸类提取物为有效成分。

该药物制剂可以进一步与药用辅料混合，以常规方法制成胶囊剂、片剂、颗粒剂、粉剂 或注射剂；给药形式为口服给药或注射给药。

所述的药用辅料为甘露糖醇、淀粉、甜菊苷、山梨糖醇、纤维素衍生物、硬脂酸镁、聚 乙二醇或注射用溶剂中的一种或几种；

所述纤维素衍生物为结晶纤维素、羟丙基纤维素或羧甲基纤维素钠；

所述注射用溶剂为水、乙醇或甘油。

本发明的有益效果：

(1)本发明的咖啡酰奎宁酸类提取物制备方法能耗低、污染小、工艺简单、适合进行工 业化生产。

(2)本发明制备方法得到的咖啡酰奎宁酸类提取物中，咖啡酰奎宁酸的重量百分含量为 65-76％，可直接入药，无需进一步纯化。

(3)试验证明本发明的咖啡酰奎宁酸类提取物具有较强的抗新城疫病毒的活性，具有潜 在的开发应用价值。

具体实施方式

结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明， 并不对其内容进行限定。

实施例1：忍冬叶中咖啡酰奎宁酸类提取物的制备

(1)取干燥后的忍冬叶100克，用800mL乙醇溶液回流提取，滤过，合并滤液，减压浓 缩至相对密度为1.1(50℃测)，得初提液；

(2)将步骤(1)制备的初提液，加入等体积的蒸馏水制成悬浮液，将悬浮液用正丁醇 进行萃取，正丁醇相减压浓缩至相对密度为1.3(50℃测)，得正丁醇萃取物；

(3)将步骤(2)制备的正丁醇萃取物采用聚酰胺填料进行富集分离，洗脱溶剂为乙醇- 水，乙醇、水的体积比为10:90～20:80。

(4)合并步骤(3)洗脱后的溶液，减压浓缩至相对密度为1.3(50℃测)，得浸膏，即 为咖啡酰奎宁酸类提取物。

该提取物的特征：提取物呈淡黄色，采用紫外可见分光光度法对提取物进行检测，对照 品为绿原酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、隐绿 原酸和新绿原酸，检测波长325nm。提取物中咖啡酰奎宁酸类化合物的重量百分含量为72.5％ 主要包括绿原酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、 隐绿原酸和新绿原酸。

实施例2：抗新城疫病毒的药物制剂的制备

药物组方：忍冬叶中咖啡酰奎宁酸类提取物80份，黄芪多糖10份，甘露糖醇20份，聚 乙二醇15份。

忍冬叶中咖啡酰奎宁酸类提取物的制备方法同实施例1。

将上述药物组方按常规方法制备成颗粒剂。

实施例3：忍冬叶中咖啡酰奎宁酸类提取物抗新城疫病毒鸡胚试验

一、对鸡胚的毒性试验

(1)试验药物：本发明实施例1制备的咖啡酰奎宁酸类提取物，用PBS配成200、100、 50和25mg/mL；

(2)试验方法：将制备的药品在生物安全柜中采用绒毛尿囊腔接种法接种11日龄SPF鸡 胚，接种量0.2mL/胚，每个浓度接胚5枚鸡胚，接种后石蜡封口，放于37℃温箱中孵育，每 天翻肧2次，观察鸡胚生长情况并记录鸡胚死亡情况，弃去24h内的死胚，连续观察5d。将24 h后死去的鸡胚放入4℃冰箱，次日无菌收集尿囊液3000r/min离心15min，取各鸡胚尿囊液进 行血凝试验。5d后将所有鸡胚放入4℃冰箱过夜，次日进行血凝试验。

血凝试验的方法为：

①取96孔V型血凝板，每孔加入25μL新配制的PBS；

②吸取尿囊液25μL于第1孔中，充分混匀后从第1孔吸25μL于第2孔，以此类推倍 比稀释，至第10孔；第11、12孔分别加入阴性尿囊液对照、和阳性病毒对照；

③每孔加入25μL鸡红细胞悬浮液(1％)；

④震荡摇匀后，放入37℃温箱中孵育15min，对照孔红细胞将成明显的钮扣状沉到孔 底。

⑤结果判定：将板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴状流淌。完全血凝(不流淌)的病毒最高 稀释倍数代表一个血凝单位(HAU)。

(3)试验结果

不同浓度的忍冬叶中咖啡酰奎宁酸类提取物对鸡胚的毒性试验结果见表1。

表1 不同浓度的咖啡酰奎宁酸类提取物接种鸡胚的鸡胚死亡数量(5枚/组)

由表1可以看出，100mg/mL及以下浓度的忍冬叶中咖啡酰奎宁酸类提取物对鸡胚是安全 的，说明忍冬叶中咖啡酰奎宁酸类提取物的毒性较低，安全性比较高。

二、抗新城疫病毒鸡胚试验

(1)试验药物：本发明实施例1制备的咖啡酰奎宁酸类提取物，用PBS分别配成10、2、 0.4、0.08和0.016mg/mL。

(2)试验方法：分别将不同部位、不同浓度的药品1mL与等量新城疫病毒株(100 EID50/0.1mL)混匀，同时设生理盐水对照和接种0.1mL/胚的病毒对照，室温下感作1h，接 种方法和鸡胚观察方法同鸡胚毒性试验相同。

(3)试验结果：

不同浓度的忍冬叶中咖啡酰奎宁酸类提取物抗新城疫病毒试验鸡胚死亡情况及血凝性试 验结果见表2。

表2不同浓度的咖啡酰奎宁酸类提取物抗新城疫病毒鸡胚试验结果(5枚/组)

结果显示10、2、0.4、0.08和0.016mg/mL的和新城疫病毒后，5天鸡胚活胚率分别为100％、 100％、0、0和0，HA平均滴度分别为0、0、7.5、7.3和7.6，说明咖啡酰奎宁酸类提取物完全 杀灭或抑制病毒的最低浓度为2mg/mL，0.4mg/mL浓度也能延长鸡胚存活时间，咖啡酰奎宁 酸类提取物在鸡胚中具有比较好的抗新城疫病毒作用。

实施例4：忍冬叶中咖啡酰奎宁酸类提取物抗新城疫病毒细胞试验

(1)试验药物：本发明实施例1制备的咖啡酰奎宁酸类提取物，用PBS分别配成752、376、 188、94、47和24μg/mL。

(2)病毒制备：选用新城疫病毒(NDVJN株，新增殖后存在-30℃)：将新城疫病毒测 定细胞半数感染量(TCID50)，为10⁸TCID50/0.1mL。用PBS稀释至10TCID50/0.1mL，再 稀释5倍，成2TCID50/0.1mL，同样的方法再稀释10倍，成0.2TCID50/0.1mL。与药物等体 积混合感作后，接入96孔板中，其终浓度为1TCID50/0.1mL或0.1TCID50/0.1mL。

(3)CEF细胞的制备：按常规方法制备。

(4)抗病毒活性细胞试验方法：采用CPE抑制实验进行评价。将CEF细胞接种于96孔培 养板中，37℃培养，使之长满单层。将倍比稀释的测试药品分别与1TCID50/0.1mL的新城疫 病毒等体积混合，37℃避光感作60min，每个稀释度接种4孔，200μL/孔，病毒对照100μL/ 孔。37℃温箱内继续培养120h，观察记录细胞病变(CPE)，将接种细胞冻融2次后，进行 HA试验测定其血凝性，HA测定方法与鸡胚血球凝集实验方法类似。

(5)试验结果：

不同浓度的忍冬叶中咖啡酰奎宁酸类提取物的抗新城疫病毒细胞试验结果见表3。

表3 不同浓度的咖啡酰奎宁酸类提取物抗新城疫病毒细胞试验结果

由表3可以看出188μg/mL以上的咖啡酰奎宁酸类提取物抗病毒后，细胞HA效价均下降到 6以下，具有抗病毒能力。

实施例5：治疗鸡新城疫病毒的效果实验

1.材料和方法

1.1实验动物：5周龄SPF鸡，购自济南斯帕法斯家禽有限公司。

1.2药物：实施例1制备的忍冬叶中咖啡酰奎宁酸类提取物；实施例2制备的抗新城疫病毒 的药物制剂；扶正解毒散(阜南诺伟康生物科技有限公司生产)。

1.3实验方法：

将鸡分成试验组I、试验组II、对照组、病毒对照组和空白对照组，每组20只，试验组I、 试验组II、对照组、病毒对照组的鸡只进行攻毒处理，毒株选自新城疫病毒(NDVJN株，新 增殖后存在-30℃)，购自中国兽药监察所；空白对照组不做处理。

攻毒12小时后，试验组I给药实施例1制备的忍冬叶中咖啡酰奎宁酸类提取物，给药浓度 为40mg/kg，给药途径为口服，给药次数为2次/天，连续用药5天；

试验组II给药实施例2制备的抗新城疫病毒的药物制剂，给药浓度为40mg/kg，给药途径 为口服，给药次数为2次/天，连续用药5天；

对照组给药扶正解毒散，按说明书给药，连续用药5天；

病毒对照组和空白对照组不给药。

1.4评价指标：

成活率和体重增重指标：试验期间，每天观察鸡的精神、食欲和活动情况，在试验开始 和结束时进行称重，计算增重率和成活率。

2.实验结果：

2.1对鸡体重增重的影响

试验期间不同处理后的鸡只体重增重情况见表4。

表4 不同处理后的鸡只体重增重情况

2.2对鸡成活率的影响

试验期间不同处理后的鸡只成活率见表5。

表5 不同处理后的鸡只成活率

由表4和表5可以看出，本发明实施例1制备的忍冬叶中咖啡酰奎宁酸类提取物和实施例2 制备的抗新城疫病毒的药物制剂，与对比药物相比，可以显著提高鸡只感染新城疫病毒后的 成活率，并对鸡只体重的增长效果显著。