一种宽裂解谱沙门氏菌噬菌体及其抑菌应用

技术领域

本发明涉及一株噬菌体及其抑菌应用，尤其是一种宽裂解谱沙门氏菌噬菌体及其抑菌应用，属于生物工程领域。

背景技术

沙门氏菌(Salmonella)为革兰氏阴性直杆菌，是一种重要的人畜共患病原菌。国内外研究表明，由沙门氏菌引起的食源性疾病屡居前位。随着抗生素的大量和长期使用，在食品和环境中，日趋严重的耐药型沙门氏菌已影响人类感染沙门氏菌疾病的治疗，能否研究出新型的生物抑菌剂来替代化学抗生素是目前科研人员面临的一个挑战。

噬菌体是一类细菌病毒，烈性噬菌体感染细菌后，能够快速裂解细菌导致宿主菌的死亡。沙门氏菌噬菌体可以特异性感染并裂解沙门氏菌，因而具有杀菌作用。在感染模型中，噬菌体能够特异性杀死沙门氏菌，而在食品中，噬菌体能够作为抗菌剂来控制细菌污染，具有潜在的开发价值。

发明内容

本发明提供一种宽裂解谱沙门氏菌噬菌体，对沙门氏菌具有强裂解作用的噬菌体制剂，该制剂可以单独或复配使用，能够特异性的灭活多种沙门氏菌，为目前防控沙门氏菌污染提供一种安全、无毒副作用的噬菌体产品来源。

本发明还提供一种所述宽裂解谱沙门氏菌噬菌体的抑菌应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种宽裂解谱沙门氏菌噬菌体，保藏号为:CCTCC NO：M 2014145，保藏日期为2014年4月24日，该噬菌体对沙门氏菌有强的裂解作用。在本发明中，该株噬菌体从电镜形态上分析，属于肌尾噬菌体科，将其命名为沙门氏菌噬菌体STP4-a；在40-60℃和pH为4-12的条件下都能够存活；-20℃保存1年后活性稳定；噬菌体保存的保护剂为含20％甘油的培养溶液。

一种所述噬菌体在制备杀灭沙门氏菌的药物中的应用，其特征在于：将沙门氏菌噬菌体纯化后，用于抑制和杀灭沙门氏菌。

该噬菌体用于防止沙门氏菌污染和沙门氏菌过度生长，其中所述的沙门氏菌包括鼠 伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和乙型伤寒沙门氏菌。

一种所述的宽裂解谱沙门氏菌噬菌体在防治食品污染沙门氏菌方面的应用。

将噬菌体用水稀释后，作为喷洒液或淋洗液，用于对食品的生产环境或生产器具或生产设备进行喷洒消杀，用于控制沙门氏菌对所述的环境或器具或设备的污染。

所述食品是指：由粮食、肉类、蔬菜、蛋类中择一的加工制品，或由它们组合的加工制品。

一种含有所述的宽裂解谱沙门氏菌噬菌体的噬菌体制剂。该噬菌体制剂对沙门氏菌具有强裂解作用，该制剂可以单独或复配使用，能够特异性的灭活多种沙门氏菌，为目前防控沙门氏菌污染提供一种安全、无毒副作用的噬菌体产品来源。

当噬菌体以10⁹pfu/g饲料的添加量添加到鸡饲料中，可使鸡肠道内沙门氏菌的数量降低1个数量级，抑菌效果显著，对其他细菌则没有影响。

本发明的有益效果主要体现在：采用噬菌体特异性裂解沙门氏菌可以杀死具有耐药性的沙门氏菌。

附图说明

图1为噬菌体电镜照片(×40K)；

图2为噬菌体温度敏感性检测结果；

图3为噬菌体pH敏感性检测结果；

图4为噬菌体保存温度分析图；

图5为不同组小鼠肝脏组织切片图(H.E×400)；

图6为不同组小鼠脾脏组织切片图(H.E×200)；

图7为不同组小鼠肾脏组织切片图(H.E×400)；

图8为不同组小鼠胃组织切片图(H.E×200)；

图9为不同组小鼠肠组织切片图(H.E×200)；

图10为不同组小鼠心脏组织切片图(H.E×200)；

图11为不同处理组、不同饲养时间鸡肠道内沙门氏菌含量。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发 明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

本发明试验涉及的菌株：两株鼠伤寒沙门氏菌(保藏号分别为ATCC14028和ATCC13311)，甲型副伤寒沙门氏菌(保藏号为CMCC(B)50001)，肠炎沙门氏菌(保藏号为CMCC50041)，伤寒沙门氏菌(保藏号为CMCC50071)和乙型伤寒沙门氏菌(保藏号为CMCC50094)分别购于美国ATCC中心和中国普通微生物菌种保藏管理中心。

本噬菌体STP4-a保存于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉、武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2014145，分类学命名：沙门氏菌噬菌体STP4-a(Salmonella bacteriophage STP4-a)。

实施例1：噬菌体分离制备及纯化

将鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028接种至10mL营养肉汤中，过夜振荡培养，得到宿主菌液。次日取山东省青岛市不同地点的污水样品分别与宿主菌液混合培养后，离心(3318g，10min)取上清液经过微孔滤膜(0.22μm)除菌得到含有噬菌体的溶液，取该溶液0.1mL，进行10倍稀释，取稀释液各0.1mL与过夜培养的宿主菌液0.1mL混匀，加入约5mL半固体培养基，混匀后迅速倾倒入营养琼脂平板上层，摇匀平置5min，待其凝固，置于37℃恒温培养箱培养12h后观察，获得形成噬菌斑的双层平板，然后连续重复至少3次单斑穿刺进行噬菌体的纯化，将纯化后的噬菌体加入到宿主菌液中进行增殖培养，离心(7607g，20min)上清液经微孔滤膜(0.22μm)除菌后得到噬菌体原液。

半固体培养基：由19g/L营养肉汤培养基和33g/L营养琼脂培养基按照1:1的体积比配制而成。

噬菌体电镜观察

将噬菌体原液滴于石蜡板上，将铜片网置于滴液中，15min后用滤纸吸去多余液体，滴一滴磷钨酸水溶液，染色10min后吸去多余液体，在空气中干燥10-15min，在透射 电镜下观察噬菌体的形态。如图1所示，噬菌体STP4-a为蝌蚪状，头部长度为100nm，横径为80nm，具有长度约为120nm的细长尾部，属于肌尾噬菌体科。

实施例2温度及pH对噬菌体的影响

将含有900μL液体培养基的EP管放于不同温度值的水浴中预热60min，待温度稳定后，加入100μL噬菌体原液，经过60min培养后测定噬菌体效价；将900μL不同pH值的液体培养基分别加入到2mL的EP管内，置于温度为37℃的恒温培养箱中预热30min，待温度稳定后，加入100μL噬菌体原液，经过60min培养后测定噬菌体效价。

结果如图2所示，40℃条件下噬菌体的活性在30min内保持不变；在50℃条件下15min和30min时仍分别有90％和75％的活性，但经过60-80℃，15min处理后，噬菌体的活性仅保留了不到0.1％。30min处理后，噬菌体的存活数低于10pfu/mL。

结果如图3所示，STP4-a在pH为4-7的条件下，存活率为100％。pH为8-10时，噬菌体的存活率仍有90％。pH为11和12时，噬菌体的存活率分别为70％和56％。

实施例3噬菌体保存条件分析

利用不同的方法保存噬菌体①将纯化好的噬菌体溶液加入终浓度为20％的甘油后保存在4℃和-20℃条件下。②将纯化好的噬菌体溶液加入终浓度为30％的脱脂牛奶后立即用液氮冻干，保存在-80℃条件下。分别保存一年后通过测定噬菌体的效价来判断保存方法的可行性。

结果如图4所示，-20℃低温保存效果最好。4℃和-80℃低温保存噬菌体1年后，噬菌体的效价分别降低了近2个和1个数量级。

实施例4噬菌体裂解谱分析

将细菌接种到10mL液体培养基，振荡培养至对数期，各取100μL菌液加入到5mL半固体培养基中，倾倒至含有一层培养基的平板内形成双层平板，待干后，将10μL的10²至10¹⁰pfu/mL效价的噬菌体点滴至平板上，37℃倒置培养至噬菌斑出现。

结果如表1所示，以宿主菌鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028为参照，STP4-a能够同等 高效地裂解其余5株不同血清型的沙门氏菌，不同稀释浓度的噬菌体溶液都在含沙门氏菌的平板上形成了清晰透明度高的噬菌斑，显示STP4-a对不同血清型的沙门氏菌有较强的裂解效果。

表1噬菌体裂解谱分析

备注：+代表产生透明圈，即具有裂解能力，-代表不产生透明圈，即不具有裂解能力。

实施例5沙门氏菌噬菌体STP4-a的经口毒性实验

BALB/c小鼠                   北京维通利华实验动物技术有限公司。

营养琼脂培养基，北京陆桥技术有限责任公司；

营养肉汤培养基，北京陆桥技术有限责任公司。

Tanon-4200SF全自动数码凝胶化学发光图像分析系统，广州誉维生物科技仪器有限公司。

UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒，    上海生工生物工程股份有限公司；

DNase，                                 北京索莱宝科技有限公司；

RNase，                                 北京索莱宝科技有限公司；

棒状饲料，                              青岛市药品检验所。

主要试剂配制

SM缓冲液：准确称取5.8g NaCl，2g MgSO₄·7H₂O溶解于800mL双蒸水中，加50mL 1mol/L Tris-HCl(pH 7.5)，加蒸馏水至1000mL，121℃高压灭菌15min，室温保存。

1mol/L Tris-HCl(pH 7.5)溶液：准确称取121.1g Tris加蒸馏水至800mL，调节pH至7.5，添加双蒸水至1000mL，121℃高压灭菌15min，室温保存。

沙门氏菌噬菌体STP4-a的经口毒性实验

增殖噬菌体至效价为1.5×10¹⁰pfu/mL(溶剂为SM缓冲液)，置于血清瓶中于4℃冰箱中保存备用；

购买BALB/c小鼠共30只(雄鼠15只，雌鼠15只)，6-8周龄，体重16-22g，放于动物房内适应环境一周。待适应环境后，灌胃前对每只小鼠称重，并用3-5％苦味酸进行标记。本实验对小鼠进行相应一次性灌胃处理，处理分组见表2，在染毒前小鼠需禁食不禁水3-4h，禁食后染毒前需对动物进行称重，染毒后仍需继续禁食1-2h。饲养过程中，动物房的室温控制在22±3℃，相对湿度为30-70％。饲养室内宜采用人工光源(14h明+10h暗)，动物食用标准饲料，自由饮水。

表2不同分组对小鼠的处理方式

注：F、M分别代表雌鼠组、雄鼠组；1、2、3分别代表空白组、阴性对照组、噬菌体处理组。

在给动物染毒的当天应该在染毒后的30min和4h各做一次仔细的临床观察，以后每天一次，连续观察14d。

(1)体重：应在染毒后称重每只动物，隔天进行体重测定，并做好体重记录，计算体重变化；

(2)大体观察：观察应包括皮肤、被毛、眼睛和粘膜变化，也应观察呼吸、循环、植物神经和中枢神经系统的体征，肢体活动状况及行为变化；

(3)病理组织学检查：应对全部染毒动物(包括试验期间死亡或处死的动物)进行大体解剖，记录肝脏、肾脏、脾脏以及胸腺的重量，计算脏器系数(脏器系数＝脏器重量/体重×100％)；记录全部肉眼可见的病损器官(观察器官包括肝脏、肾脏、脾脏、胃、肠、心脏，于40％甲醛溶液中保存)，组织标本经取材、固定、脱水透明、浸蜡、石蜡包埋、切片、苏木精—伊红(H.E)染色法、封片(赵永强.罗非鱼片臭氧减菌化处理中自由基的产生及其对产品品质与安全性的影响:[博士学位论文].山东：中国海洋大学食品科学与工程学院,2013.)，并做病理组织学检查。

数据分析方法两组间差异检验采用t-检验，P<0.01判断为具有极显著差异，P<0.05判断为具有显著性差异，P>0.05为差异不显著。试验数据采用平均值±标准偏差()表示。

实验结果

空白组、阴性对照组、实验组各10只小鼠在灌胃期间及14天观察期内，无死亡现象，且各组小鼠皮肤、被毛、眼睛和粘膜未见异常，呼吸、循环、植物神经和中枢神经系统的体征，肢体活动状况及行为变化也无异常现象出现。表3、表4、表5分别表示各组小鼠体重、脏器重及脏器系数的统计结果。

(1)体重变化

灭活噬菌体组、噬菌体组小鼠体重在各测定时间点与SM缓冲液对照组相比，经t-检验分析皆无显著性差异(P>0.05)，说明噬菌体及其残留物对小鼠体重无显著影响，结果见表3。

表3各组小鼠体重统计结果(g,)

注：表中上标代表显著性差异结果，“，”前字母表示F2与F1及M2与M1比较结果，“，”后字母F3与F1及M3与M1比较结果，相同字母表示无显著性差异(P＞0.05)，不同字母表示具有显著性差异(P＜0.05)，“-”表示未参与比较过程。

(2)脏器重量

噬菌体组、灭活噬菌体组与SM缓冲液对照组相比，经t-检验分析，肾脏、脾脏、胸腺重量无显著性差异(P＞0.05)，说明噬菌体及其残留物对小鼠肾脏、脾脏、胸腺重量无显著影响。其中，t-检验分析发现，F2组肝脏重量显著高于F1组(P＜0.05)，说明噬菌体的残留物不会对肝脏生长产生负面影响，有可能会促进肝脏发育。结果见表4。

表4各组小鼠脏器重结果(g,)

注：表中上标代表显著性差异结果，“，”前字母表示F2与F1及M2与M1比较结果，“，”后字母F3与F1及M3与M1比较结果，相同字母表示无显著性差异(P＞0.05)，不同字母表示具有显著性差异(P＜0.05)，“-”表示未参与比较过程。

(3)脏器系数

噬菌体组、灭活噬菌体组与SM缓冲液对照组相比，经t-检验分析，肾脏、脾脏、胸腺系数无显著性差异(P＞0.05)，说明噬菌体及其残留物对小鼠肾脏、脾脏、胸腺系数无显著影响。其中，t-检验分析发现，F2组肝脏重量显著高于F1组(P＜0.05)，说明噬菌体的残留物不会对肝脏生长产生负面影响，有可能会促进肝脏发育。结果见表5。

表5各组小鼠脏器系数结果(％,)

注：表中上标代表显著性差异结果，“，”前字母表示F2与F1及M2与M1比较结果，“，”后字母F3与F1及M3与M1比较结果，相同字母表示无显著性差异(P＞0.05)，不同字母表示具有显著性差异(P＜0.05)，“-”表示未参与比较过程。

(4)病理学检查结果

a.大体解剖结果 

空白组、灭活噬菌体处理组以及噬菌体处理组的所有小鼠解剖后均未发现脏器颜色、结构等出现异常现象。于是，每组随机挑取一只小鼠制作组织病理切片进一步观察是否有异常现象。

b.组织病理学检查结果

F1、F2、F3组切片之间以及M1、M2、M3组切片之间无明显差异，图5、图6、图7、图8、图9、图10分别表示不同组的肝脏、脾脏、肾脏、胃、肠以及心脏的组织切片图。其中肝脏组织结构正常，无淤血、缺血、水肿、坏死、纤维化，被膜完整。肝小叶，中央静脉位于小叶中央，管壁完整，有肝血窦汇入。肝索，肝细胞单层排列构成，大致以中央静脉为中心向四周成放射状排列；脾脏组织结构正常，无淤血、水肿、增生；肾脏组织结构正常，无水肿、坏死、纤维化。皮质中可见肾小球，肾小球结构正常，数目正常，髓质中可见大量不同切面，密集平行排列的肾小管，无肾小体；胃组织中未见出血、坏死、糜烂或溃疡形成；肠组织粘膜下腺体排列尚整齐，肌层和外膜结构完整；心脏组织结构正常，无坏死、纤维化。心肌纤维呈红色，心肌纤维间可见少量疏松结缔组织和大量毛细血管。各组织在M1、M2、M3组切片中也可得出相同结论。由病理组织切片结果可见，各组组织切片图无显著差异，可见噬菌体STP4-a对各器官组织无明显负面影响，这与Carlton(Carlton R M,Noordman W H,Biswas B,et al.Bacteriophage P100for  control of Listeria monocytogenes in foods:Genome sequence,bioinformatic analyses,oral toxicity study,and application[J].Regulatory Toxicology and Pharmacology.2005,43(3):301-312.)、Kang(Kang H W,Kim J W,Jung T S,et al.wksl3,a New biocontrol agent for Salmonella enterica serovars enteritidis and typhimurium in foods:characterization,application,sequence analysis,and oral acute toxicity study[J].Applied and Environmental Microbiology.2013,79(6):1956-1968.)、Mccallin(Mccallin S,Alam S S,Barretto C,et al.Safety analysis of a Russian phage cocktail:from metagenomic analysis to oral application in healthy human subjects[J].Virology.2013,443(2):187-196.)的研究结果相一致，皆从动物实验方面论证了噬菌体的安全性。

本实验通过经口毒性实验进一步说明噬菌体STP4-a的安全性，数据分析发现噬菌体处理组、灭活噬菌体处理组与空白组在体重、脏器重量、脏器发育等方面相比皆没有显著性差异。并且通过大体解剖和组织切片观察未发现小鼠服用噬菌体后体内器官发生任何病变现象。从分子水平分析及经口毒性实验结果来看，噬菌体没有明显的危害作用，是一种安全的抗菌剂。

实施例6：沙门氏菌噬菌体STP4-a在蛋鸡体内的抑菌实验

将36只17日龄产蛋鸡分为3组，如表6。除A组外，其余各组每只鸡分别用灌胃法口服10⁷cfu鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028。将噬菌体与饲料混合，其浓度为10⁹pfu/g饲料，从染菌之前3天喂食含噬菌体饲料，染菌之后再连续喂养14天，在第7天和第14天每组分别处死6只鸡，取出其肠道以测定菌数。由于鸡肠道内含有大肠杆菌等优势肠道菌群，预计远远超过体内定殖沙门氏菌ATCC14028的数量，于是测定时先经过沙门氏菌增菌处理，通过测定增菌后沙门氏菌数变化情况了解噬菌体STP4-a在鸡肠道内是否具有显著作用效果。测定方法如下：将小肠组织按1(g):10(mL)浸入氯化镁孔雀绿(RV)增菌液中，无菌均质后于42℃培养24h后，将样品用无菌生理盐水进行十倍梯度稀释，选合适稀释度取100μL涂布至木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)平板上，37℃培养24h后进行沙门氏菌菌落计数。

表6实验设计

在第7天和第14天时分别对不同处理组的鸡肠道内的沙门氏菌进行计数，A组皆未检测到沙门氏菌，由此B、C组肠道内的沙门氏菌皆为口服沙门氏菌。不同处理组、不同饲养时间鸡肠道内沙门氏菌含量结果见表11，其中“**”表明噬菌体处理组与阳性对照组有极显著差异，P<0.01；立方体代表每只鸡肠道内菌数，横线代表该组6只鸡肠道内菌数的均值。

由图11可知，在第7天时，C组沙门氏菌数较B组下降了0.25log(cfu/g)，经t-检验分析，P>0.05，下降效果并不显著。到14天时，C组沙门氏菌数与B组相比下降了1个数量级，经t-检验分析，下降效果极显著(P＜0.01)，这说明噬菌体在鸡体内能够起到一定的治疗效果。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。