应用于免疫检测和免疫诊断领域的免疫磁珠的制备方法

技术领域

本发明涉及免疫学中的免疫检测和免疫诊断领域，具体涉及一种可应用于免 疫检测和免疫诊断的免疫磁珠的制备方法。

背景技术

免疫检测和免疫诊断是利用免疫学的理论和技术，通过抗原和抗体的特异性结 合，定性或者定量地测定免疫分子，进而分析得到其临床意义的一种方法。随着相 关技术的不断改进，免疫检测和免疫诊断正朝着更加灵敏、操作更简单、可实现多 项联合检测的方向发展。而不断进步的关键，则是用于免疫分析的纳米材料的发展。

目前应用于免疫分析领域的纳米材料有胶体金、量子点、荧光蛋白及磁性纳米 粒子等。以磁性纳米粒子为载体结合免疫配体形成的免疫磁珠，因具有分离速度快、 可重复性好等特点，近年来逐步得到了越来越多的应用。免疫磁珠应用于免疫分析 领域，主要依靠免疫磁珠分离技术来实现免疫检测和免疫诊断。其中，免疫磁珠上 的抗体与待检测物中的抗原产生特异性结合，在外加磁场的作用下，免疫磁珠与其 结合的抗原被从待检测物中分离出来，从而实现了免疫标志物的筛选。在该项技术 中，关键之处在于免疫磁珠的制备，即磁性纳米粒子的制备和磁性纳米粒子与抗体 的结合。一方面，磁性纳米粒子首先需要保证一定的饱和磁化强度，以实现最终免 疫磁珠的磁性分离；另一方面，磁性纳米粒子表面应携带一定量的有机基团，如羧 基、氨基、羟基等，方便与抗体的结合。四氧化三铁纳米粒子由于制备简单、稳定 性好、易于修饰等特点，已经成为免疫分析领域首选的磁性纳米粒子。目前，有多 种制备四氧化三铁纳米粒子的方法，其中不乏一些可实现规模化制备的方法。在这 些制备方法当中，有机基团一般也同时被引入到纳米粒子的表面。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种应用于免疫 检测和免疫诊断领域的免疫磁珠的制备方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：应用于免疫检测和免疫诊断领域 的免疫磁珠的制备方法，其特征在于，该方法是利用颗粒粒径为5～8nm的磁性纳 米粒子与抗体通过化学结合的方式制备免疫磁珠。

所述的方法具体包括以下步骤：

(1)称取有机铁盐和无机铁盐，分别溶于去离子水中，以200～500rpm/min 的速度搅拌使其充分溶解，然后将两份溶液混合，继续以200～500rpm/min的速度 搅拌，使其充分混匀，所述的有机铁盐和无机铁盐的添加量为使Fe²⁺和Fe³⁺的摩尔 比1:1～4；

(2)称取抗坏血酸，使其与Fe³⁺离子的摩尔比为1:3～9，加入步骤(1)得到 的混合溶液中，继续以200～500rpm/min的速度搅拌；调节得到的混合溶液的pH 值至9～12，继续以200～500rpm/min的速度搅拌5～30min；

(3)将步骤(2)得到的混合溶液转移至水热反应釜中，以150～230℃的温 度保温4～15h；

(4)将步骤(3)得到的溶液转移至透析袋中，透析1～2天，随后冷冻干燥， 即可得到目标四氧化三铁磁性纳米粒子；

(5)将步骤(4)制得的磁性纳米粒子溶于MEST活化缓冲溶液中，加入活 化剂，室温下放置20～60min；其中磁性纳米粒子在MEST活化缓冲溶液中的浓度 为1～5mg/300～100μL，活化剂的加入量为与磁性纳米粒子的质量比为2～5:1；

(6)以硼砂和硼酸为原料，配置硼酸盐缓冲溶液，使其pH范围维持在7～10；

(7)将步骤(5)得到的磁性纳米粒子及抗体加入步骤(6)配置的硼酸盐缓 冲溶液中，室温下放置2～5h，使得磁性纳米粒子表面的羧基与抗体上的氨基充分 反应，得到偶联抗体的磁性纳米粒子，即免疫磁珠；

(8)将步骤(7)得到的免疫磁珠加入溶有一定量的BSA的硼酸盐缓冲溶液 中，室温下放置20～60min，对免疫磁珠表面没有参与偶联的羧基进行封闭；

(9)用硼酸盐缓冲溶液对步骤(8)得到的免疫磁珠洗涤若干次后，即获得临 床可应用的免疫磁珠。

所述的有机铁盐包括且不限于柠檬酸铁、乙酰丙酮铁、右旋糖酐铁或葡萄糖酸 亚铁。

所述的无机铁盐包括且不限于硫酸亚铁、硫酸铁、氯化亚铁或氯化铁。

步骤(2)采用0.4～5M的氢氧化钠溶液调节混合溶液的pH浓度。

步骤(5)所述的MEST活化缓冲溶液的浓度为0.005～0.02M，pH范围在4～6。

步骤(5)所述的活化剂为碳二亚胺、二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、 马来酰亚胺、丁二酰亚胺、4-二甲氨基吡啶、N,N-二甲基甲酰胺中的一种或几种。

步骤(6)所述的硼酸盐缓冲溶液中硼砂与硼酸的质量比为3～6:1。

步骤(8)溶有一定量的BSA的硼酸盐缓冲溶液中，BSA的质量百分含量为 1％～5％。

与现有技术相比，本发明具有以下特点：

1.通过简单的操作即可得到小尺寸(5～8nm)、大小均匀的磁性纳米粒子。

2.磁性纳米粒子表面携带大量羧基基团，可较好地实现与抗体的偶联。

3.偶联方法快速、简单，所用原料成本低，适用于大范围推广。

附图说明

图1为四氧化三铁磁性纳米粒子的透射电镜图片；

图2为免疫磁珠的透射电镜图片。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

一种可应用于免疫检测和免疫诊断的免疫磁珠的制备方法，具体包括如下步 骤：

(1)称取摩尔比为2:1的柠檬酸铁和硫酸亚铁，分别溶于20mL去离子水中， 以400rpm/min的速度搅拌使其充分溶解。

(2)将步骤(1)制得的两份溶液混合，继续以400rpm/min的速度搅拌，使 其充分混匀。

(3)称取0.1g抗坏血酸，加入步骤(2)得到的混合溶液中，使其与Fe³⁺离 子的摩尔比为1:6，继续以400rpm/min的速度搅拌。

(4)向步骤(3)得到的混合溶液中滴加浓度为0.4M的氢氧化钠溶液，调节 该混合溶液的pH值至10，继续以400rpm/min的速度搅拌10min。

(5)将步骤(4)得到的混合溶液转移至水热反应釜中，以200℃的温度保 温10h。

(6)将步骤(5)得到的溶液转移至透析袋中，透析2天，随后冷冻干燥，即 可得到目标四氧化三铁磁性纳米粒子。

(7)将1mg步骤(6)制得的磁性纳米粒子溶于300μL的MEST活化缓冲 溶液中，按照与磁性纳米粒子的质量比为3:1加入活化剂，活化剂由质量比为2:1 的碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺组成，室温下放置20min。

(8)取摩尔比为3:1的硼砂和硼酸配置硼酸盐缓冲溶液，调节其pH至9。

(9)加入步骤(7)得到的磁性纳米粒子及0.15mg抗β-hCG抗体，室温下放 置3h得到偶联抗体的磁性纳米粒子，即免疫磁珠。

(10)将步骤(9)得到的免疫磁珠加入溶有1％的BSA的硼酸盐缓冲溶液中， 室温下放置20min。

(11)用硼酸盐缓冲溶液对步骤(10)得到的免疫磁珠洗涤4次后，即获得临 床可应用的免疫磁珠。

所得四氧化三铁磁性纳米粒子的透射电镜图如图1所示，偶联抗体的免疫磁珠 的透射电镜图如图2所示。可以看出制得的磁性纳米粒子平均尺寸为5～8nm，且 粒径分布均匀。偶联后的磁性纳米粒子周边出现衬度较低的絮状物，应为大分子的 抗体。

实施例2

一种可应用于免疫检测和免疫诊断的免疫磁珠的制备方法，具体包括如下步 骤：

(1)称取一定比例的乙酰丙酮铁和氯化亚铁，分别溶于10mL去离子水中， 以200rpm/min的速度搅拌使其充分溶解；

(2)将步骤(1)制得的两份溶液混合，使Fe²⁺和Fe³⁺的摩尔比1:1，继续以 200rpm/min的速度搅拌，使其充分混匀；

(3)称取一定量的抗坏血酸，使其与Fe³⁺离子的摩尔比为1:3，加入步骤(2) 得到的混合溶液中，继续以200rpm/min的速度搅拌；

(4)采用0.4M的氢氧化钠溶液调节步骤(3)得到的混合溶液的pH值至9， 继续以200rpm/min的速度搅拌5min；

(5)将步骤(4)得到的混合溶液转移至水热反应釜中，以150℃的温度保 温4h；

(6)将步骤(5)得到的溶液转移至透析袋中，透析1～2天，随后冷冻干燥， 即可得到目标四氧化三铁磁性纳米粒子。

(7)将2mg步骤(6)制得的磁性纳米粒子溶于500μL的MEST活化缓冲 溶液中，加入5mg碳二亚胺和2.5mg马来酰亚胺，室温下放置30min。

(8)取摩尔比为4:1的硼砂和硼酸配置硼酸盐缓冲溶液，调节其pH至10。

(9)加入步骤(7)得到的磁性纳米粒子及0.2mg甲胚蛋白，室温下放置4h 得到偶联抗体的磁性纳米粒子，即免疫磁珠。

(10)将步骤(9)得到的免疫磁珠加入溶有2％的BSA的硼酸盐缓冲溶液中， 室温下放置30min。

(11)用硼酸盐缓冲溶液对步骤(10)得到的免疫磁珠洗涤4次后，即获得临 床可应用的免疫磁珠。

实施例3

一种可应用于免疫检测和免疫诊断的免疫磁珠的制备方法，具体包括如下步 骤：

(1)称取一定比例的葡萄糖酸亚铁和硫酸铁，分别溶于25mL去离子水中， 以500rpm/min的速度搅拌使其充分溶解；

(2)将步骤(1)制得的两份溶液混合，使Fe²⁺和Fe³⁺的摩尔比1:4，继续以 500rpm/min的速度搅拌，使其充分混匀；

(3)称取一定量的抗坏血酸，使其与Fe³⁺离子的摩尔比为1:9，加入步骤(2) 得到的混合溶液中，继续以500rpm/min的速度搅拌；

(4)采用5M的氢氧化钠溶液调节步骤(3)得到的混合溶液的pH值至12， 继续以500rpm/min的速度搅拌30min；

(5)将步骤(4)得到的混合溶液转移至水热反应釜中，以230℃的温度保 温15h；

(6)将步骤(5)得到的溶液转移至透析袋中，透析1～2天，随后冷冻干燥， 即可得到目标四氧化三铁磁性纳米粒子。

(7)将2mg步骤(6)制得的磁性纳米粒子溶于700μL的MEST活化缓冲 溶液中，加入5mg二环己基碳二亚胺和2.5mgN,N-二甲基甲酰胺，室温下放置40 min。MEST活化缓冲溶液的浓度为0.005M，pH范围在4～6。

(8)取摩尔比为5:1的硼砂和硼酸配置硼酸盐缓冲溶液，调节其pH至9。

(9)加入步骤(7)得到的磁性纳米粒子及0.2mgCD3E抗体，室温下放置3h 得到偶联抗体的磁性纳米粒子，即免疫磁珠。

(10)将步骤(9)得到的免疫磁珠加入溶有1％的BSA的硼酸盐缓冲溶液中， 室温下放置40min。

(11)用硼酸盐缓冲溶液对步骤(10)得到的免疫磁珠洗涤4次后，即获得临 床可应用的免疫磁珠。

实施例4

一种可应用于免疫检测和免疫诊断的免疫磁珠的制备方法，具体包括如下步 骤：

(1)称取一定比例的葡萄糖酸亚铁和硫酸铁，分别溶于25mL去离子水中， 以300rpm/min的速度搅拌使其充分溶解；

(2)将步骤(1)制得的两份溶液混合，使Fe²⁺和Fe³⁺的摩尔比1:3，继续以 300rpm/min的速度搅拌，使其充分混匀；

(3)称取一定量的抗坏血酸，使其与Fe³⁺离子的摩尔比为1:6，加入步骤(2) 得到的混合溶液中，继续以300rpm/min的速度搅拌；

(4)采用5M的氢氧化钠溶液调节步骤(3)得到的混合溶液的pH值至10， 继续以300rpm/min的速度搅拌30min；

(5)将步骤(4)得到的混合溶液转移至水热反应釜中，以230℃的温度保 温4h；

(6)将步骤(5)得到的溶液转移至透析袋中，透析1～2天，随后冷冻干燥， 即可得到目标四氧化三铁磁性纳米粒子。

(7)将5mg步骤(6)制得的磁性纳米粒子溶于1000μL的MEST活化缓 冲溶液中，加入5mg二环己基碳二亚胺和5mgN,N-二甲基甲酰胺，室温下放置 60min。MEST活化缓冲溶液的浓度为0.02M，pH范围在4～6。

(8)取摩尔比为6:1的硼砂和硼酸配置硼酸盐缓冲溶液，调节其pH至9。

(9)加入步骤(7)得到的磁性纳米粒子及0.2mgCD3E抗体，室温下放置3h 得到偶联抗体的磁性纳米粒子，即免疫磁珠。

(10)将步骤(9)得到的免疫磁珠加入溶有5％的BSA的硼酸盐缓冲溶液中， 室温下放置40min。

(11)用硼酸盐缓冲溶液对步骤(10)得到的免疫磁珠洗涤4次后，即获得临 床可应用的免疫磁珠。