一种鸡新城疫、禽流感抗原抗体复合物灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于生物新医药领域，涉及一种鸡新城疫、禽流感抗原抗体复合物疫苗及其制备方法。

技术背景

新城疫(Newcastle Disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)引起的鸡和多种禽类的急性高度接触性的传染病，具有很高的发病率和病死率。禽流感(Avian Influenza，AI)是由A型流感病毒引起的，发生于各种家禽和野鸟的急性传染病。引起禽流感的A型流感病毒叫做禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)，该病已呈全球性分布，许多国家和地区都有该病发生的报道，全球性的禽流感大流行已出现多次，给养禽业带来了沉重的打击。

目前，防治ND与AI的主要手段为疫苗免疫，并辅助抗生素和抗病毒药物治疗。但缺点是人工接种劳动强度大并且家禽对免疫接种的应激反应大，因此研究和应用二联疫苗和多联疫苗已经成为兽用疫苗产业发展的必然趋势。

禽流感病毒容易发生变异，因此不能使用弱毒活疫苗。灭活疫苗主要刺激机体产生体液免疫，动物机体受到抗原物质的刺激后，由B淋巴细胞转化为浆细胞产生能与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白，即特异性抗体。而鸡的法氏囊是B淋巴细胞发生和分化重要场所，而雏鸡的法氏囊发育尚不完全，发生和分化B淋巴细胞的能力有限，因此现有的多联灭活疫苗对于雏鸡的免疫效率不高。而采用高免的特异性卵黄抗体，可使雏鸡获得被动免疫，是雏鸡度过禽流感免疫空白期的有效手段。因此，研制出一种既能提供被动免疫，又能提供主动免疫的新型禽流感抗原抗体复合物二联或多联疫苗意义重大。

抗原抗体复合物疫苗已经被国内外学者关注，并进行了相关研究。目前，鸡新城疫和传染性法氏囊病等禽病的复合物疫苗研究已经取得一定成果。何宏轩(专利号：ZL200810226023.9)制备了一种禽流感抗原抗体复合物，但其使用的种毒为禽流感H5N1亚型病毒，且免疫效果与常规疫苗差异并不显著。孙瑞芹在《禽流感病毒抗原-抗体复合物的制备及其免疫原性》(孙瑞芹等，中国生物制品学杂志，2009年第22卷第6期第588页)一文中公开了以H5亚型禽流感病毒 的HA蛋白为抗原，其病毒的高免卵黄为抗体，将抗原与抗体按不同比例混合，制备禽流感病毒抗原抗体复合物疫苗的方法，其抗体水平与攻毒保护力与H5亚型禽流感油乳剂灭活疫苗相比无明显提高。原因是其卵黄抗体效价不高，剂量不够，不足以提供坚强的被动免疫。另外在疫苗中添加卵黄抗体直接增加疫苗生产成本，肉鸡经济价值不高，昂贵的疫苗难以被接收。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能适用于所有鸡群的，特别是对雏鸡和病鸡均安全有效而且能缩短疫苗免疫空白期，增强疫苗保护力，降低疫苗生产成本的鸡新城疫、禽流感抗原抗体复合物灭活疫苗及其制备方法。

为了能够实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的制备方法包括以下步骤：

1)制备禽流感抗原：将非免鸡胚清洗消毒，经过孵化后，在其尿囊腔接种H9N2亚型HP株禽流感病毒，然后继续孵化，在无菌条件下收获鸡胚液，并进行纯化浓缩得到新的鸡胚液，并且新的鸡胚液满足禽流感病毒含量≥10^8.7EID₅₀/0.1mL，接着将新得到的鸡胚液用甲醛灭活；

2)制备新城疫抗原与禽流感卵黄抗体：先用H9N2亚型HP株禽流感病毒灭活疫苗免疫种鸡，检测鸡胚H9N2亚型抗体水平，选择出效价达到9log2以上的高免蛋；然后将选出的禽流感病毒高免蛋进行清洗消毒，并进行孵化；在经孵化至9～10日龄时，尿囊腔内接种新城疫病毒LaSota株，接着孵化，分别在无菌条件下收获鸡胚液和卵黄液，并进行纯化浓缩，得到新的鸡胚液和卵黄液，并且新得到的鸡胚液满足新城疫病毒含量≥10^8.9EID₅₀/0.1mL，卵黄液满足卵黄抗体HI值≥9log2，接着将新得到的鸡胚液和卵黄液用甲醛灭活；

3)乳化：将已灭活的新城疫抗原、禽流感抗原以及禽流感卵黄抗体半成品分别进行乳化，调节新城疫、禽流感抗原乳化剂的HLB值为3～6得到油相，再令水相：油相等于1:3；调节卵黄抗体乳化剂的HLB值为6～10得到油相，再令水相：油相等于1:1.5；

4)混合：将乳化后的新城疫抗原、禽流感抗原和卵黄抗体按1.5～3:1.5～3:1比例混匀，得到产品。

所述步骤1)中非免鸡胚清洗消毒后孵化所需的温度为37℃，并且需孵化9～10日龄；接种过H9N2亚型HP株禽流感病毒的鸡胚继续孵化所需的温度为37℃，并且孵化所需时间为24～96h。

所述步骤2)中经清洗消毒后的禽流感高免蛋孵化所需的温度为37℃，并且需孵化9～10日龄。

所述步骤2)中接种新城疫病毒LaSota株后的鸡胚孵化所需的温度为37℃，并且孵化所需时间为60～96h。

本发明利用一种鸡新城疫、禽流感抗原抗体复合物疫苗的制备方法制得新型鸡新城疫、禽流感抗原抗体复合物灭活疫苗。

本发明采用以上技术方案，利用H9N2亚型HP株禽流感病毒高免鸡胚生产卵黄抗体，生产出的卵黄抗体效价高，剂量足，适用于所有鸡群，特别是对雏鸡和病鸡同样安全高效；通过调节乳化剂的HLB值，即卵黄抗体乳化剂的HLB值6～10，新城疫、禽流感抗原乳化剂的HLB值3～6，使得乳化后的卵黄抗体亲水性高于新城疫抗原和禽流感抗原，达到抗体优先被机体吸收发挥作用，延缓了抗原释放，缩短了疫苗的免疫空白期，提高疫苗免疫保护力；利用禽流感高免鸡胚制备新城疫病毒，使得鸡胚得到最大利用，大大降低了抗原抗体复合物疫苗的生产成本；本发明对对卵黄抗体进行纯化浓缩，再用甲醛灭活，得到的卵黄抗体不仅纯度高，而且安全性好。

具体实施方式

本发明的制备方法，其包括以下步骤：

1)制备禽流感抗原：将非免鸡胚清洗消毒，经过孵化后，在其尿囊腔接种H9N2亚型HP株禽流感病毒，然后继续孵化，在无菌条件下收获鸡胚液，并进行纯化浓缩得到新的鸡胚液，并且新的鸡胚液满足禽流感病毒含量≥10^8.7EID₅₀/0.1mL，接着将新得到的鸡胚液用甲醛进行灭活；

2)制备新城疫灭活抗原与禽流感灭活卵黄抗体：先用H9N2亚型HP株禽流感病毒灭活疫苗免疫鸡的种鸡，检测鸡胚禽流感抗体水平，选择出效价达到9log2以上的高免蛋；然后将选出的禽流感病毒高免蛋进行清洗消毒，并进行孵化；在经孵化后的高免蛋尿囊腔内接种新城疫病毒LaSota株接着孵化，分别在 无菌条件下收获鸡胚液和卵黄液，并进行纯化浓缩，得到新的鸡胚液和卵黄液，并且新得到的鸡胚液满足新城疫病毒含量≥10^8.9EID₅₀/0.1mL，卵黄液满足卵黄抗体HI值≥9log2，接着将新得到的鸡胚液和卵黄液用甲醛灭活；

3)乳化：将已灭活的新城疫抗原、禽流感抗原以及禽流感卵黄抗体半成品分别进行乳化，调节新城疫、禽流感抗原乳化剂的HLB值为3～6得到油相，再另水相：油相等于1:3；调节卵黄抗体乳化剂的HLB值为6～10得到油相，再另水相：油相等于1:1.5；

4)混合：将乳化后的新城疫抗原、禽流感抗原和卵黄抗体按1.5～3:1.5～3:1比例混匀，得到产品。

所述步骤1)中非免鸡胚清洗消毒后孵化所需的温度为37℃，并且需孵化9～10日龄；接种过H9N2亚型HP株禽流感病毒的鸡胚继续孵化所需的温度为37℃，并且孵化所需时间为24～96h。

所述步骤2)中经清洗消毒后的禽流感高免蛋孵化所需的温度为37℃，并且需孵化9～10日龄。

所述步骤2)中接种新城疫病毒LaSota株后的鸡胚孵化所需的温度为37℃，并且孵化所需时间为60～96h。

本发明利用一种鸡新城疫、禽流感抗原抗体复合物疫苗的制备方法制得新型鸡新城疫、禽流感抗原抗体复合物灭活疫苗。

实施例1

1、禽流感高免鸡胚的制备：

(1)种鸡的免疫程序：所述抗体为用H9N2亚型禽流感HP株灭活疫苗免疫后得到的卵黄抗体。首先，用2倍免疫剂量的灭活苗对鸡胚进行基础免疫；7～10d后，用2～5倍免疫剂量对鸡胚进行加强免疫；10d后，再用2～5倍免疫剂量对鸡胚进行维持免疫。

(2)高免鸡胚的收获：在维持免疫后每隔3d检测一次HI，当HI值在9log2以上时收集鸡胚用于制备卵黄抗体和新城疫抗原。

2、新城疫抗原的制备：

(1)消毒：将收集的禽流感高免鸡胚用0.1％的新洁尔灭溶液清洗消毒，放入孵化器中37℃孵育至9～10日龄；

(2)接种：取生产用种毒NDV LaSota株，用灭菌生理盐水稀释至10^-2～10^-4，接种到37℃孵育至9～10日龄的禽流感高免鸡胚的尿囊腔内，每胚0.1mL，接着置于37℃孵化器后孵化60～96h；

(3)观察与收获：弃去60h前死亡的鸡胚，之后每4～6h照蛋观察一次，及时收集60h后死亡且病痕明显的鸡胚，冷藏保存，直至96h全部取出，置于2～8℃冷却12～24h，无菌条件下收取鸡胚液，以若干鸡胚为一组，装于无菌容器，每组抽样进行无菌检验和血凝试验，弃去污染或HA值低于1:128的胚液，注明收获日期、毒种代次等； 

表1：H9N2HP株高免鸡胚生产新城疫抗原效价情况表

从上表可以看出，本发明采用H9N2HP株高免鸡胚生产新城疫抗原的方法是可行的，产出的抗原病毒含量与非免鸡胚相比无明显差异。

3、禽流感高免卵黄抗体的收获：

(1)卵黄液的收集：卵黄液与新城疫抗原的收集同步进行；取已收获了新城疫抗原的鸡胚，用无菌的7号注射器针头吸取卵黄液(或将蛋壳打碎挑取出卵黄囊)，装于灭菌容器，并留样进行无菌检验，取无菌检验合格的卵黄液混合，测定其HI值；

(2)卵黄抗体的提取：将卵黄与灭菌蒸馏水以1:5的比例混合，充分搅拌混匀，用盐酸调节pH至5.0～5.4，静置4～6h后，4000～6000r/min低温离心，得到的上清液即为卵黄抗体粗提物；

(3)卵黄抗体的纯化与浓缩：用分子截留量为100KD的膜包，对卵黄抗体粗提物进行超滤浓缩。浓缩后测定HI值，应≥9log2。

表2三次试验卵黄抗体效价(卵黄抗体的提取与纯化方法均相同)

从表2可以看出，本发明使用H9N2高免鸡胚同步生产新城疫抗原和卵黄抗体，与单独使用使用非免鸡胚制备卵黄抗体的方法所得到的抗体HI值无明显差异，证明本发明的方法有效可行，且能大幅度降低生产成本。

4、禽流感H9N2亚型抗原的制备

(1)接种：取生产用种毒，用灭菌生理盐水稀释至10^-4～10^-5，接种到9～10日龄低免鸡胚内，每胚接种0.1mL，置于孵化器37℃孵化24～96h，

(2)观察：弃去24h前死亡的鸡胚，接着每隔6h照蛋一次，及时取出24h后死亡的鸡胚冷藏保存，直至96h，取出所有鸡胚，置于2～8℃冷却12～24h；

(3)收获：取出冷藏的鸡胚，无菌条件下收取鸡胚液，以若干鸡胚为一组，装于无菌容器，每组抽样进行无菌检验和血凝试验，弃去污染或HA值低于1:128的胚液，灭活前2～8℃保存，注明收获日期、毒种代次等； 

5、新城疫抗原和禽流感H9N2亚型抗原的浓缩

无菌条件下，用装有80目过滤网的无菌漏斗过滤鸡胚液，除去尿囊液残渣和其他粗颗粒杂质，再过5000转/分离心除去较小杂质，然后通过超滤浓缩3倍，新城疫抗原选用分子截留量为10KD的膜包和禽流感抗原选用分子截留量为300KD的膜包，浓缩后新城疫病毒含量≥10^8.9EID₅₀/0.1mL和禽流感病毒含量≥10^8.7EID₅₀/0.1mL，将浓缩后的抗原2～8℃保存；

6、禽流感H9N2亚型卵黄抗体、新城疫抗原和禽流感H9N2亚型抗原的灭活

将卵黄抗体和两种抗原液分别置于灭菌灭活罐，加入10％甲醛溶液，调整卵黄抗体灭活的甲醛终浓度至0.05％，25℃灭活(以瓶内温度达到25℃开始计时)20～24h，调整新城疫抗原灭活的甲醛终浓度至0.1％，37℃灭活16h，禽流感抗原灭活方法同新城疫；

7、乳化

将已灭活的新城疫抗原、禽流感抗原以及禽流感卵黄抗体半成品分别进行乳化，调节乳化剂的HLB值，新城疫、禽流感抗原乳化剂的HLB值3～6，水相： 油相等于1:3；卵黄抗体乳化剂的HLB值6～10，水相：油相等于1:1.5，最后将已乳化的新城疫抗原、禽流感抗原和禽流感卵黄抗体按照2:2:1比例混匀。 

8、免疫效果评价

1、物理性状 

外观乳白色乳剂

剂型油包水型。吸取少量疫苗滴于冷水中，呈油滴状不扩散。

稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000转/分钟离心15分钟，管底析出的水相应≤0.5ml

粘度28cP

2、无菌检验 

根据《中华人民共和国兽用生物制品规程》进行检验，均无菌生长。

3、安全检验 

取1～3周龄SPF雏鸡10只，每只肌肉注射或皮下注射0.5～1mL，观察14d，未出现因注射疫苗而引发的局部或全身不良反应。

表3本发明制备的3组疫苗成品安全检验结果

4、效力检测 

(1)将本专利产品接种7日龄SPF雏鸡，7d、14d、21d后采血检测抗体水平，以商品化的鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗(新流二联灭活疫苗)作对照试验。从表4中可以看出商品化的新流二联灭活疫苗对7日龄雏鸡的免疫效果较差，而本专利产品对7日龄雏鸡的免疫效果较好，达到合格水平。

表4本专利产品接种7日龄SPF雏鸡后的抗体水平

(2)将本专利产品接种10日龄SPF雏鸡，免疫后7d、14d、21d采血检测抗体水平，结果如表5所示，商品化的新流二联灭活疫苗对10日龄雏鸡的免疫效果较差，而本专利产品对10日龄雏鸡的免疫效果同样达到合格水平。

表5本专利产品接种10日龄SPF雏鸡后的抗体水平

(3)将本专利产品接种30日龄SPF雏鸡，免疫后7d、14d、21d采血检测抗体水平，结果如表6所示，商品化的新流二联灭活疫苗和本专利产品对30日龄雏鸡的免疫效果均达到合格水平。

表6本专利产品接种30日龄SPF雏鸡后的抗体水平

5、甲醛和硫柳汞残留量测定

根据《中华人民共和国兽用生物制品规程》检验本专利产品的甲醛和硫柳汞残留量，结果显示：甲醛溶液残留量0.08％，硫柳汞残留量0.005％。可以得出本专利产品比较安全。

实施例2：

1、禽流感高免鸡胚的制备：

(1)鸡胚的免疫程序：所述抗体为用HP株灭活疫苗免疫后得到的卵黄抗体。首先，用2倍免疫剂量的H9N2亚型HP株灭活苗对种鸡进行基础免疫；7～10d后，用2～5倍免疫剂量对种鸡进行加强免疫；10d后，再用2～5倍免疫剂量对种鸡进行维持免疫。

(2)高免鸡胚的收获：在维持免疫后每隔3d检测一次HI，当HI值在9log2以上时收集鸡胚用于制备卵黄抗体和新城疫抗原。

2、新城疫抗原的制备：

(1)消毒：将收集的禽流感高免鸡胚用0.1％的新洁尔灭溶液清洗消毒，放入孵化器中37℃孵育至9～10日龄；

(2)接种：取生产用种毒NDV LaSota株，用灭菌生理盐水稀释至10^-2～10^-4，接种到37℃孵育至9～10日龄的禽流感高免鸡胚的尿囊腔内，每胚0.1mL，接着置于37℃孵化器后孵化60～96h；

(3)观察与收获：弃去已经接种NDV LaSota株并孵化后60h前死亡的鸡胚，之后每4～6h照蛋观察一次，及时收集60h后死亡且病痕明显的鸡胚，冷藏保存，直至96h全部取出，置于2～8℃冷却12～24h，无菌条件下收取鸡胚液，以若干鸡胚为一组，装于无菌容器，每组抽样进行无菌检验和血凝试验，弃去污染或HA值低于1:128的胚液，注明收获日期、毒种代次等； 

表1：H9N2HP株高免鸡胚生产新城疫抗原效价情况表

从上表可以看出，本发明采用H9N2HP株高免鸡胚生产新城疫抗原的方法是可行的，产出的抗原病毒含量与非免鸡胚相比无明显差异。

3、禽流感高免卵黄抗体的收获：

(1)卵黄液的收集：卵黄液与新城疫抗原的收集同步进行；取已收获了新城疫抗原的鸡胚，用无菌的7号注射器针头吸取卵黄液(或将蛋壳打碎挑取出卵黄囊)，装于灭菌容器，并留样进行无菌检验，取无菌检验合格的卵黄液混合，测定其HI值；

(2)卵黄抗体的提取：将卵黄与灭菌蒸馏水以1:5的比例混合，充分搅拌混匀，用盐酸调节pH至5.0～5.4，静置4～6h后，4000～6000r/min低温离心，得到的上清液即为卵黄抗体粗提物；

(3)卵黄抗体的纯化与浓缩：用分子截留量为100KD的膜包，对卵黄抗体粗提物进行超滤浓缩。浓缩后测定HI值，应≥9log2。

表2三次试验卵黄抗体效价(卵黄抗体的提取与纯化方法均相同)

从表2可以看出，本发明使用H9N2高免鸡胚同步生产新城疫抗原和卵黄抗体，与单独使用使用非免鸡胚制备卵黄抗体的方法所得到的抗体HI值无明显差异，证明本发明的方法有效可行，且能大幅度降低生产成本。

4、禽流感H9N2亚型抗原的制备

(1)接种：取生产用种毒，用灭菌生理盐水稀释至10^-4～10^-5，接种到9～10日龄低免鸡胚内，每胚接种0.1mL，置于孵化器37℃孵化24～96h，

(2)观察：弃去接种禽流感H9N2亚型HP株后24h前死亡的鸡胚，接着每隔6h照蛋一次，及时取出24h后死亡的鸡胚冷藏保存，直至96h，取出所有鸡胚，置于2～8℃冷却12～24h；

(3)收获：取出冷藏的鸡胚，无菌条件下收取鸡胚液，以若干鸡胚为一组，装于无菌容器，每组抽样进行无菌检验和血凝试验，弃去污染或HA值低于1:128的胚液，灭活前2～8℃保存，注明收获日期、毒种代次等； 

5、新城疫抗原和禽流感H9N2亚型抗原的浓缩

无菌条件下，用装有80目过滤网的无菌漏斗过滤鸡胚液，除去尿囊液残渣和其他粗颗粒杂质，再过5000转/分离心除去较小杂质，然后通过超滤浓缩3倍，新城疫抗原选用分子截留量为10KD的膜包和禽流感抗原选用分子截留量为300KD的膜包，浓缩后新城疫病毒含量≥10^8.9EID₅₀/0.1mL和禽流感病毒含量≥10^8.7EID₅₀/0.1mL，将浓缩后的抗原2～8℃保存；

6、禽流感H9N2亚型卵黄抗体、新城疫抗原和禽流感H9N2亚型抗原的灭活

将卵黄抗体和两种抗原液分别置于灭菌灭活罐，加入10％甲醛溶液，调整卵黄抗体灭活的甲醛终浓度至0.05％，25℃灭活(以瓶内温度达到25℃开始计时)20～24h，调整新城疫抗原灭活的甲醛终浓度至0.1％，37℃灭活16h，禽流感抗原灭活方法同新城疫；

7、乳化

将已灭活的新城疫抗原、禽流感抗原以及禽流感卵黄抗体半成品分别进行乳化，调节乳化剂的HLB值，新城疫、禽流感抗原乳化剂的HLB值3～6，水相：油相等于1:3；卵黄抗体乳化剂的HLB值6～10，水相：油相等于1:1.5，最后将三者按照1.5:1.5:1比例混匀。

8、免疫效果评价

1、物理性状 

外观乳白色乳剂

剂型油包水型。吸取少量疫苗滴于冷水中，呈油滴状不扩散。

稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000转/分钟离心15分钟，管底析出的水相应≤0.5ml

粘度28cP

2、无菌检验 

根据《中华人民共和国兽用生物制品规程》进行检验，均无菌生长。

3、安全检验 

取1～3周龄SPF雏鸡10只，每只肌肉注射或皮下注射0.5～1mL，观察14d，未出现因注射疫苗而引发的局部或全身不良反应。

表3本发明制备的3组疫苗成品安全检验结果

4、效力检测 

(1)将本专利产品接种7日龄SPF雏鸡，7d、14d、21d后采血检测抗体水平，以商品化的鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗(新流二联灭活疫苗)作对照试验。从表4中可以看出商品化的新流二联灭活疫苗对7日龄雏鸡的免疫效果较差，而本专利产品对7日龄雏鸡的免疫效果较好，达到合格水平。

表4本专利产品接种7日龄SPF雏鸡后的抗体水平

(2)将本专利产品接种10日龄SPF雏鸡，免疫后7d、14d、21d采血检测抗体水平，结果如表5所示，商品化的新流二联灭活疫苗对10日龄雏鸡的免疫效果较差，而本专利产品对10日龄雏鸡的免疫效果同样达到合格水平。

表5本专利产品接种10日龄SPF雏鸡后的抗体水平

(3)将本专利产品接种30日龄SPF雏鸡，免疫后7d、14d、21d采血检测抗体水平，结果如表6所示，商品化的新流二联灭活疫苗和本专利产品对30日龄雏鸡的免疫效果均达到合格水平。

表6本专利产品接种30日龄SPF雏鸡后的抗体水平

5、甲醛和硫柳汞残留量测定

根据《中华人民共和国兽用生物制品规程》检验本专利产品的甲醛和硫柳汞残留量，结果显示：甲醛溶液残留量0.08％，硫柳汞残留量0.007％。可以得出本专利产品比较安全。

实施例3：

1、禽流感高免鸡胚的制备：

(1)鸡胚的免疫程序：所述抗体为用HP株灭活疫苗免疫后得到的卵黄抗体。首先，用2倍免疫剂量的H9N2亚型HP株灭活苗对种鸡进行基础免疫；7～10d后，用2～5倍免疫剂量对种鸡进行加强免疫；10d后，再用2～5倍免疫剂量对种鸡进行维持免疫。

(2)高免鸡胚的收获：在维持免疫后每隔3d检测一次HI，当HI值在9log2以上时收集鸡胚用于制备卵黄抗体和新城疫抗原。

2、新城疫抗原的制备：

(1)消毒：将收集的禽流感高免鸡胚用0.1％的新洁尔灭溶液清洗消毒，放入孵化器中37℃孵育至9～10日龄；

(2)接种：取生产用种毒NDV LaSota株，用灭菌生理盐水稀释至10^-2～10^-4，接种到37℃孵育至9～10日龄的禽流感高免鸡胚的尿囊腔内，每胚0.1mL，接着置于37℃孵化器后孵化60～96h；

(3)观察与收获：弃去已经接种NDV LaSota株并孵化后60h前死亡的鸡胚，之后每4～6h照蛋观察一次，及时收集60h后死亡且病痕明显的鸡胚，冷藏保存，直至96h全部取出，置于2～8℃冷却12～24h，无菌条件下收取鸡胚液，以若干鸡胚为一组，装于无菌容器，每组抽样进行无菌检验和血凝试验，弃去污染或HA值低于1:128的胚液，注明收获日期、毒种代次等； 

表1：H9N2HP株高免鸡胚生产新城疫抗原效价情况表

从上表可以看出，本发明采用H9N2HP株高免鸡胚生产新城疫抗原的方法是可行的，产出的抗原病毒含量与非免鸡胚相比无明显差异。

3、禽流感高免卵黄抗体的收获：

(1)卵黄液的收集：卵黄液与新城疫抗原的收集同步进行；取已收获了新城疫抗原的鸡胚，用无菌的7号注射器针头吸取卵黄液(或将蛋壳打碎挑取出卵 黄囊)，装于灭菌容器，并留样进行无菌检验，取无菌检验合格的卵黄液混合，测定其HI值；

(2)卵黄抗体的提取：将卵黄与灭菌蒸馏水以1:5的比例混合，充分搅拌混匀，用盐酸调节pH至5.0～5.4，静置4～6h后，4000～6000r/min低温离心，得到的上清液即为卵黄抗体粗提物；

(3)卵黄抗体的纯化与浓缩：用分子截留量为100KD的膜包，对卵黄抗体粗提物进行超滤浓缩。浓缩后测定HI值，应≥9log2。

表2三次试验卵黄抗体效价(卵黄抗体的提取与纯化方法均相同)

从表2可以看出，本发明使用H9N2高免鸡胚同步生产新城疫抗原和卵黄抗体，与单独使用使用非免鸡胚制备卵黄抗体的方法所得到的抗体HI值无明显差异，证明本发明的方法有效可行，且能大幅度降低生产成本。

4、禽流感H9N2亚型抗原的制备

(1)接种：取生产用种毒，用灭菌生理盐水稀释至10^-4～10^-5，接种到9～10日龄低免鸡胚内，每胚接种0.1mL，置于孵化器37℃孵化24～96h，

(2)观察：弃去接种禽流感H9N2亚型HP株后24h前死亡的鸡胚，接着每隔6h照蛋一次，及时取出24h后死亡的鸡胚冷藏保存，直至96h，取出所有鸡胚，置于2～8℃冷却12～24h；

(3)收获：取出冷藏的鸡胚，无菌条件下收取鸡胚液，以若干鸡胚为一组，装于无菌容器，每组抽样进行无菌检验和血凝试验，弃去污染或HA值低于1:128的胚液，灭活前2～8℃保存，注明收获日期、毒种代次等； 

5、新城疫抗原和禽流感H9N2亚型抗原的浓缩

无菌条件下，用装有80目过滤网的无菌漏斗过滤鸡胚液，除去尿囊液残渣和其他粗颗粒杂质，再过5000转/分离心除去较小杂质，然后通过超滤浓缩3倍，新城疫抗原选用分子截留量为10KD的膜包和禽流感抗原选用分子截留量为300KD的膜包，浓缩后新城疫病毒含量≥10^8.9EID₅₀/0.1mL和禽流感病毒含量 ≥10^8.7EID₅₀/0.1mL，将浓缩后的抗原2～8℃保存；

6、禽流感H9N2亚型卵黄抗体、新城疫抗原和禽流感H9N2亚型抗原的灭活

将卵黄抗体和两种抗原液分别置于灭菌灭活罐，加入10％甲醛溶液，调整卵黄抗体灭活的甲醛终浓度至0.05％，25℃灭活(以瓶内温度达到25℃开始计时)20～24h，调整新城疫抗原灭活的甲醛终浓度至0.1％，37℃灭活16h，禽流感抗原灭活方法同新城疫；

7、乳化

将已灭活的新城疫抗原、禽流感抗原以及禽流感卵黄抗体半成品分别进行乳化，调节乳化剂的HLB值，新城疫、禽流感抗原乳化剂的HLB值3～6，水相：油相等于1:3；卵黄抗体乳化剂的HLB值6～10，水相：油相等于1:1.5，最后将三者按照3:3:1比例混匀。

8、免疫效果评价

1、物理性状 

外观乳白色乳剂

剂型油包水型。吸取少量疫苗滴于冷水中，呈油滴状不扩散。

稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000转/分钟离心15分钟，管底析出的水相应≤0.5ml

粘度28cP

2、无菌检验 

根据《中华人民共和国兽用生物制品规程》进行检验，均无菌生长。

3、安全检验 

取1～3周龄SPF雏鸡10只，每只肌肉注射或皮下注射0.5～1mL，观察14d，未出现因注射疫苗而引发的局部或全身不良反应。

表3本发明制备的3组疫苗成品安全检验结果

4、效力检测 

(1)将本专利产品接种7日龄SPF雏鸡，7d、14d、21d后采血检测抗体水平，以商品化的鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗(新流二联灭活疫苗)作对照试验。从表4中可以看出商品化的新流二联灭活疫苗对7日龄雏鸡的免疫效果较差，而本专利产品对7日龄雏鸡的免疫效果较好，达到合格水平。

表4本专利产品接种7日龄SPF雏鸡后的抗体水平

(2)将本专利产品接种10日龄SPF雏鸡，免疫后7d、14d、21d采血检测抗体水平，结果如表5所示，商品化的新流二联灭活疫苗对10日龄雏鸡的免疫效果较差，而本专利产品对10日龄雏鸡的免疫效果同样达到合格水平。

表5本专利产品接种10日龄SPF雏鸡后的抗体水平

(3)将本专利产品接种30日龄SPF雏鸡，免疫后7d、14d、21d采血检测 抗体水平，结果如表6所示，商品化的新流二联灭活疫苗和本专利产品对30日龄雏鸡的免疫效果均达到合格水平。

表6本专利产品接种30日龄SPF雏鸡后的抗体水平

5、甲醛和硫柳汞残留量测定

根据《中华人民共和国兽用生物制品规程》检验本专利产品的甲醛和硫柳汞残留量，结果显示：甲醛溶液残留量0.06％，硫柳汞残留量0.004％。可以得出本专利产品比较安全。