一种注射用总蟾毒内酯固体脂质纳米粒给药系统及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种总蟾毒内酯纳米制剂，具体是注射用总蟾毒内酯固体脂质纳米粒给药系统及其制备方法，属于药物制剂领域。

背景技术

总蟾毒内酯类化合物是一类在C-17β位连接有α-吡喃酮环(αpyrone)的C-24甾体或其苷，是一类脂溶性化合物，为传统中药干蟾皮发挥抗癌活性的主要药效成分。总蟾毒内酯主要含有蟾毒配基(resibufogenin)、华蟾酥毒基(cinobufagin)、蟾毒灵(bufalin)、蟾毒它灵(Bufotalin)、日蟾毒它灵-3-半辛二酸酯(Gamabufotalin-3-hydrogen Suberate)、蟾蜍灵-3-丁二酰精氨酸酯、华蟾毒精-3-丁二酰精氨酸酯等内酯类成分。研究表明，总蟾毒内脂具有明显的抗肿瘤作用，而且还能将肿瘤细胞转化为正常细胞(诱导肿瘤细胞分化)、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞新生血管形成、降低肿瘤转移等作用。目前，临床上已有类似总蟾毒内脂类注射剂且已广泛应用于中晚期肿瘤和慢性乙型肝炎病人。但在临床应用过程中常出现静脉输注不畅、输液部位红肿、静脉内疼痛等血管刺激性不良反应。

而固体脂质纳米粒(lipid Solid nanoparticles，SLN)是20世纪90年代初发展起来的新一代亚微粒给药系统，粒径在10～1000nm，以固态天然或合成的类脂如卵磷脂、三酰甘油等为载体，将药物包裹 或夹嵌于类脂核中制成的固体胶粒给药系统，以毒性低、生物相容性好、生物可降解的固态天然或合成的类脂为载体，将药物吸附或包裹于脂质膜中制成的新一代纳米粒给药系统。因其在制备时使用的载体材料在室温下是固体，使得其既具有聚合物纳米球和纳米囊的物理稳定性高、药物泄露少、具有缓释性和靶向性、可以灭菌等特点，又兼有减小药物刺激性、毒性小、易于大规模生产等优点，是一种极有发展前景的新型给药系统。目前实验室多采用微乳法、溶剂蒸发法、沉淀法以及注射法等方法来制备SLN。

发明内容：

本发明要解决的技术问题之一，是提供一种其中纳米粒粒径小于1000nm的注射用总蟾毒内脂固体脂质纳米粒。

本发明的目的在于研制和提供一种性质稳定并且可以采用工业化生产的注射用总蟾毒内脂固体脂质纳米粒及其固体制剂，本发明将总蟾毒内脂包裹于类脂核中，增加了总蟾毒内脂的溶解度，减小了它的刺激性，可达到靶向、控释等效果，并且物理化学性质稳定。

本发明的目的是提供注射用总蟾毒内脂固体脂质纳米粒及其固体制剂的制备方法。本发明的制备方法灵活多样，均可以采用常规的方法和工艺设备，可进行工业化大生产。本发明所述的固体脂质纳米粒，含有下列单位为重量份的成分：

总蟾毒内脂0.01～10份

脂质材料0.1～50份

脂溶性乳化剂0.1～50份

水溶性乳化剂0.1～40份

抗氧化剂0.0005～10份

糖0.001～50份

其余为注射用水组成加至适量

优选后，本发明所述的固体脂质纳米粒，含有下列单位为重量份的成分：

总蟾毒内脂0.01～5份

脂质材料0.1～30份

脂溶性乳化剂0.1～30份

水溶性乳化剂0.1～20份

抗氧化剂0.0025～5份

糖0.01～30份

其余为注射用水组成加至适量

经过进一步优化后，本发明的注射用总蟾毒内脂固体脂质纳米粒包括以下重量份的组分：

总蟾毒内脂0.1～2份

脂质材料0.5～20份

脂溶性乳化剂0.5～15份

水溶性乳化剂0.5～10份

抗氧化剂0.002～2.5份

糖0.1～25份

其余为注射用水组成加至适量

本发明所说的总蟾毒内脂是一类在C-17β位连接有α-吡喃酮环(αpyrone)的C-24甾体或其苷，是一类脂溶性化合物。它是蟾皮的乙醇提取物，其提取工艺照专利《具有抗肿瘤作用的总蟾毒内酯提取物、其制备方法及用途》(专利号：200610167378.6)进行，提取液经浓缩分离后得总蟾毒内酯提取物。

本发明所说的脂质材料是指在SLN中作为载体材料、与生理相容性好、且室温下呈固态的类脂材料，如三酸甘油酯、混合甘油酯、脂肪酸、类固醇、蜡、磷脂等。为使本发明注射用总蟾毒内脂固体脂质纳米粒对总蟾毒内脂等有效成分具有较高的包封率及载药量，且考虑到其应用到临床时，需适应不同使用途径，特别是经血管，如静脉注射时能减少局部刺激及全身的副反应，以提高安全性，故本发明优选适于静脉制剂的硬脂酸和三硬脂酸甘油酯，经文献调研发现原用于口服制剂的山榆酸甘油酯较多的被用于总蟾毒内脂SLN的制备，故本发明对其制成的SLN进行了注射用药安全性的考察，发现其安全性、综合性均较佳。因此，本发明脂质材料更优选山榆酸甘油酯。

而本发明所说的乳化剂是具有乳化、稳定、分散作用的药物辅剂。本发明乳化剂由脂溶性乳化剂及水溶性乳化剂组成。其中，脂溶性乳化剂有磷脂类、胆酸盐类、脱氧胆酸盐类、短链醇类，其中磷脂类包括卵磷脂、卵黄磷脂及其混合物；胆酸盐类包括胆酸盐、甘胆酸钠、牛黄胆酸钠及其混合物；脱氧胆酸盐类包括自脱氧胆酸钠、去氧牛黄胆酸钠及其混合物；短链醇类包括丁醇、丁酸、甘油、异丙醇。本发明脂溶性乳化剂选用氢化大豆卵磷脂和卵磷脂。水溶性乳化剂选自泊 洛沙姆(Poloxamer)系列和土温(Tween)系列。泊洛沙姆包括泊洛沙姆108、182、188、407、908；聚山梨醇酷优选吐温一80、85、65、60、40。为更好地适应于注射用药，本发明乳化剂更优选氢化大豆卵磷脂和泊洛沙姆188的组合。

本发明为注射用总蟾毒内脂固体脂质纳米粒，因此还加入了注射剂常用的添加剂，如等渗剂：甘油、葡萄糖等；抗氧剂：维生素E、C及亚硫酸氢钠等。本发明抗氧剂更优选亚硫酸氢钠，等渗剂优选葡萄糖。

本发明要解决的另一技术问题是提供上述注射用总蟾毒内脂固体脂质纳米粒的制备方法。可以通过以下方法进行制备：

方法一：乳化—沉淀法制备，称取一定量总蟾毒内脂、脂质材料、脂溶性乳化剂溶于一定量与水不混溶的有机溶剂(如正己烷、氯仿等)中，加入到水溶性乳化剂、抗氧化剂及葡糖糖形成的均匀水相中进行乳化，然后蒸去有机溶剂，即可得到固体脂质纳米粒分散体系；

方法二：微乳法制备，将脂质材料和脂溶性乳化剂熔融，加入总蟾毒内脂、水溶性乳化剂、抗氧化剂、葡糖糖和注射用水制成外观透明、热力学稳定的O/W型微乳，然后在搅拌条件下将微乳分散于冷水中即可制成固体脂质纳米粒分散体系；

方法三：热高压乳匀法制备，即将脂质材料、总蟾毒内脂及脂溶性乳化剂溶解或均匀分散于熔融液中，然后将该熔融液在高速搅拌的条件下分散于温度相近的含水溶性乳化剂、抗氧化剂及葡糖糖的混合溶液中形成初乳，初乳该熔融温度和100～2000Pa下经高压乳匀3次 冷却结晶后，即得；

方法四：冷高压乳匀法制备，即将脂质材料、脂溶性乳化剂与总蟾毒内脂共融并充分混合后，在液氮等介质中迅速冷却，经机械搅拌研磨，得到的固体脂质纳米粒微粒在高速搅拌下混入冷的含水溶性乳化剂、抗氧化剂及葡糖糖的混合溶液中得到初乳，再于室温下以更高压力通过高压乳匀机3个循环以上就得到固体脂质纳米粒分散体系；

方法五：超声法制备，称取一定量的总蟾毒内脂，脂质材料及脂溶性乳化剂于一定量的有机溶剂中，在旋转蒸发仪上减压蒸干成膜，加入一定量含水溶性乳化剂、抗氧化剂及葡糖糖的混合水溶液，超声即得固体脂质纳米粒分散体系。

上述制备方法中所提到的有机溶剂可以选自氯仿、乙醇、乙醚、甲醇、乙酸乙酷、丙酮、二氯甲烷。

为延长总蟾毒内脂固体脂质纳米粒的血液循环时间，提高它的生物利用度，降低毒副作用，可以将总蟾毒内脂固体脂质纳米粒修饰成隐形固体脂质纳米粒A，隐形材料可以选用非离子表面活性剂聚乙二醇(PEG)、泊洛沙姆(Poloxamer)、聚山梨酷80(Tween80)。

本发明为注射用固体脂质纳米粒，其中注射方式可以是静脉注射、静脉滴注、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射。根据需要，还可以在总蟾毒内脂SLN中加入各种添加剂，如等渗剂：甘油、葡萄糖等；抗氧剂：维生素E、C及亚硫酸氢钠等。

为方便保存和运输，本发明可通过冷冻干燥等干燥方法将水分散体系制成干粉针。

本发明以脂质为载体材料，以乳化剂为稳定剂，采用熔融法和高压均质相结合的方法，使药物包载于脂质纳米粒中。本发明采用高压匀化则有利于工业化生产。

本发明的注射用总蟾毒内脂固体脂质纳米粒具有以下优点：

1.该固体脂质纳米粒毒性低，保证了用药安全，提高了肌体的耐受性；

2.该固体脂质纳米粒将总蟾毒内脂包裹在类脂核中，增加了药物的水溶性和稳定性，可实现靶向、控释效果，提高了药物的生物利用度。

3.该固体脂质纳米粒可经表面修饰，提高药物的治疗效果。

4.该固体脂质纳米粒可喷雾干燥或冷冻干燥制成固体成品，延长存放时间、运输便捷，延长了产品的有效期，提高了产品的质量。

5.该固体脂质纳米粒制备工艺成熟。产品质量稳定，偏于工业化生产。

对本发明的总蟾毒内脂固体脂质纳米粒的粒径和包封率等指标的评价实验如下：

(1)摄总蟾毒内脂固体脂质纳米粒的透射电镜(TEM)照片

将本发明总蟾毒内脂纳米粒混悬液适当稀释，滴加在覆盖碳膜的铜网上，用2.0％磷钨酸钠负染色液染色，用JEM-2010透射电子显微镜拍摄透射电镜照片。

(2)测定总蟾毒内脂固体脂质纳米粒的粒径大小及分布

将纳米粒混悬液适当稀释，用Zetasizer 3000Hs激光粒度分析测 定仪测定纳米粒的大小及其分布范围。

(3)测定总蟾毒内脂固体脂质纳米粒的包封率

以sephadex葡萄糖凝胶柱层析方法分离总蟾毒内脂固体脂质纳米粒和游离药物，测定其包封率。吸取l ml纳米粒混悬液上柱，以蒸馏水为洗脱介质进行洗脱。收集带有乳光部分的洗脱液，定量吸取该部分洗脱液，加甲醇溶解纳米粒；另取l ml纳米粒混悬液，加甲醇溶解。用HPLC分别测定两样品中的总蟾毒内脂的含量，根据包封率公式计算包封率：

EE(％)＝(C₀－C)/C₀×100％

其中：EE代表包封率；C₀和C分别代表上清液中纳米粒混悬液中的总药量和未被包裹的游离药物含量。

所测的总蟾毒内脂固体脂质纳米粒的粒径小于1000nm，优选粒径小于500nm，包封率大于80％。

总蟾毒内脂是脂溶性化合物，在水中溶解度小，本发明将其制成固体脂质纳米粒。不仅增加了药物的溶解度，提高了药物的生物利用度，还可以减少总蟾毒内脂的血管刺激性，增加患者的耐受性，且还可以起到控释、靶向的效果，提高药物的治疗指数，减少用药剂量和毒副作用。

本发明制得的固体脂质纳米粒对药物有保护作用，较好地解决了脂质体、微乳中药物泄漏的问题。

本发明制得的固体脂质纳米粒可以用于各种注射用药，适应不同的治疗要求。

具体实施方式：

下面再以实施例方式对本发明作进一步说明，但不以此作为对本发明的限制。

实施例1～10本实例主要就热高压乳匀法进行说明。将表1中所规定的组分按下列步骤进行制备，得不同实施例的蟾毒内脂固体脂质纳米粒。

(1)将总蟾毒内脂提取物、脂质材料及脂溶性乳化剂在表2所示温度下加热至熔融，以溶解或分散于脂质中制得熔融物作为油相；

(2)将水溶性乳化剂、抗氧化剂、葡萄糖分散于100ml注射用水中，形成均匀的水相；

(3)将(1)所得的油相和(2)所得的水相在表2所示温度及转速下混合、搅拌至形成均匀的初乳；

(4)将(3)中制得的初乳转移至乳匀机中，在高压乳匀机中进行匀质，迅速冷却至室温及以下，即可制得总蟾毒内脂固体脂质纳米粒。

表1

a为泊洛沙姆188，c为土温80。对照为不含药物的空白脂质纳米粒。

表2

实施例11

取上述实施例1～10中所述制得的总蟾毒内脂固体脂质纳米粒进行理化性质研究。

取总蟾毒内脂固体脂质纳米粒混悬液适量，加水稀释，然后滴加在覆盖碳膜的铜网上，用2.0％磷钨酸钠负染色液染色，在透射电子显微镜下观察纳米粒形态并拍摄照片。

结果，电镜下观察纳米粒呈类球形实体粒子，且粒径均匀，无聚集黏连现象。

实施例12

取上述实施例1～10中的总蟾毒内脂固体脂质纳米粒测定包封率及载药量。

以sephadex葡萄糖凝胶柱层析方法分离总蟾毒内脂固体脂质纳米粒和游离药物，测定其包封率。吸取l ml纳米粒混悬液上柱，以蒸馏水为洗脱介质进行洗脱。收集带有乳光部分的洗脱液，定量吸取该部分洗脱液，加甲醇溶解纳米粒；另取l ml纳米粒混悬液，加甲醇溶解。采用HPLC测定包封率及载药量。

实施例11～12中测得总蟾毒内脂固体脂质纳米粒的粒径、包封率及载药量如下表所示：

表3

以上实施例是以100ml规格的总蟾毒内脂固体脂质纳米粒进行说明的。

实施例13稳定性试验 

称取0.5g总蟾毒内脂提取物、3.6g山榆酸甘油脂、4g注射用大豆磷脂混合均匀，80℃加热使溶解，作为油相。将3g泊洛沙姆188、0.3g亚硫酸氢钠、12g葡萄糖加入注射用水100ml，搅拌溶解，加热至80℃作为水相。将上述油相与水相混合后，在80℃及1200r/min转速下混合、搅拌至形成均匀的初乳；将初乳转移至乳匀机中，在高压乳匀机中匀质3次，迅速冷却至室温及以下，即可制得总蟾毒内脂固体脂质纳米粒。

以上述制得的样品为例，对注射用总蟾毒内脂SLN混悬液放置于室温和4℃冰箱内，观察24h，1个月，3个月，6个月时其外观的变化。观察3500r/min离心15min混悬液是否出现分层或出现沉淀。

结果，4冰箱内的样品未出现分层及沉淀现象，4个月时室温放置的样品有少量沉淀。

实施例14总蟾毒内脂固体脂质纳米粒的刺激性和溶血性试验

称取0.5g总蟾毒内脂提取物、3.6g山榆酸甘油脂、4g注射用大豆磷脂混合均匀，80℃加热使溶解，作为油相。将3g泊洛沙姆188、0.3g亚硫酸氢钠、12g葡萄糖加入注射用水100ml，搅拌溶解，加热至80℃作为水相。将上述油相与水相混合后，在80℃及1200r/min转速下混合、搅拌至形成均匀的初乳；将初乳转移至乳匀机中，在高压乳匀机中匀质3次，迅速冷却至室温及以下，即可制得总蟾毒内脂固体脂质纳米粒。

取上述制得的总蟾毒内脂SLN注射液适量，注入家兔股四头肌，放血处死后，观察注射部位肌肉组织变化情况。配制2％的兔红细胞混悬液，加入样品，观察其对红细胞的影响。

结果，总蟾毒内脂固体脂质纳米粒的家土鸡肉刺激性反应在2级以内。溶血试验表明在观察时间内无溶血凝聚现象，说明总蟾毒内脂固体脂质纳米粒适宜注射给药。

参考专利： 

CN 200610167378.6 。