一种鉴别暗纹东方鲀和条纹东方鲀鱼苗的引物和方法

技术领域

本发明属于水产养殖领域，涉及一种分子生物学技术鉴定同属鱼苗方法，更具体地说， 本发明涉及利用微卫星标记对暗纹东方鲀和条纹东方鲀鱼苗进行准确鉴别。

背景技术

暗纹东方鲀(Takifugufasciatus)隶属于鲀形目(Letrodontiforms)、鲀科(Tetraodontidae)、 东方鲀属(Fugu)，俗称河鲀、气泡鱼，属于洄游性鱼类，分布于东海、黄海、渤海以及长江 中下游，是一种经济价值极高的水产品，名列长江“四大名鱼”之首，为传统美食中的典范。

条纹东方鲀(Takifuguxanthopterus)隶属于鲀形目(Letrodontiforms)、鲀科 (Tetraodontidae)、东方鲀属(Fugu)，俗称黄鳍东方鲀、花艇巴等，亦属洄游性鱼类，其与 暗纹东方鲀的栖息海区和繁殖季节相近，主要分布在东海、南海、黄海及渤海，亦进入江河 口。

暗纹东方鲀和条纹东方鲀各具特色，因生态习性差异，两者肉质迥然不同。条纹东方鲀 分布范围广，产量较高；暗纹东方鲀体型较大，生长速度较快，其口感风味和营养价值远远 高于条纹东方鲀。随着两种东方鲀的市场需求量逐日扩大，其苗种的需求量亦与日俱增，因 此鱼苗的来源和准确鉴别是两种东方鲀养殖的关键。但在形态学上，暗纹东方鲀和条纹东方 鲀的鱼苗外观体型十分相似，若无专业分类学知识，仅凭肉眼去区分极易产生混淆。因此即 使是养殖经验丰富的渔民也不能准确的去区分这两种东方鲀鱼苗，一旦混合养殖，不仅加大 了后期成鱼分类处理的工作量，还会出现种间杂交，进而导致种质混杂，品质变劣。此外， 市场上两种东方鲀的幼鱼也是常常混淆不清，由于暗纹东方鲀和条纹东方鲀市场售价差异明 显，导致有些商家为谋取经济利益，误将条纹东方鲀鱼苗充当暗纹东方鲀鱼苗出售，不仅侵 犯了消费者的利益，也极大影响了渔民和河鲀养殖企业的经济效益。因此，市场上迫切需求 一种鉴别和区分2种东方鲀的准确方法。

基因组中的微卫星DNA以孟德尔方式遗传，呈共显性表达，且同时具有分布广、遗传信 息含量高和便于PCR检测等优点，在鱼类遗传育种研究中应用微卫星标记进行物种群体遗传 结构和多样性分析、分子遗传图谱的构建、物种演化和亲缘关系等研究，能够对不同物种进 行精确的系统学的区分，精确确定物种的进化途径和分类学地位，进而对种质资源、基因库 进行有目的保护。研究表明微卫星侧翼序列在亲缘关系较近或种属间是相当保守的，因此， 鉴于目前东方鲀属鱼苗形态学鉴定的不确定性，本发明使用微卫星分子标记对2种东方鲀鱼 苗进行有效鉴别和区分。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速准确鉴别暗纹东方鲀和条纹东方鲀鱼苗的方法，以克服现有从 形态学上鉴定存在主观性强且不能有效地鉴定两种鱼苗的缺陷，并且本发明在不处死鱼苗的 基础上，只需剪去少量尾鳍或其它鱼体组织部分即可进行鉴别，具有稳定性高、操作简单重 复性好、实用性强并可快速准确鉴别等优点。

本发明的技术方案是

一种暗纹东方鲀和条纹东方鲀幼鱼的鉴别引物，命名为F-FXF147，序列如下：

F：5’-AACAAGTGCATGGCTGAGTG-3’(SEQIDNo.1)

R：5’-TTGACAGATGTGGAGCTGATG-3’(SEQIDNo.2)

本发明暗纹东方鲀和条纹东方鲀鱼苗的鉴别方法，包括下列步骤：

1)提取2种东方鲀鉴定样品DNA；

2)用上述引物对步骤1)提取的样本进行DNA扩增，获得PCR产物；

3)用2.2％琼脂糖凝胶(EB染色)电泳对PCR产物进行检测，300bp左右大小的条带为暗 纹东方鲀，600bp左右大小的条带为条纹东方鲀。

本发明的PCR扩增反应体系可采用由上海皆益生物科技有限公司提供的2×TaqPlus Mix，里面包含PCR反应体系必需成分，只需一次性加入即可，操作简单、减少实验误差。

本发明是首次基于分子生物学手段建立起对暗纹东方鲀和条纹东方鲀鱼苗进行鉴别的方 法，利用来自暗纹东方鲀合成、筛选的特异微卫星引物F-FXF147，建立了一个普通的PCR 反应就可以实现鉴别2种东方鲀鱼苗的新方法。本方法无需依赖专业的鱼类分类学知识，也 不需要具有长期从事鱼类鉴别的丰富经验，仅需取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测得到稳 定、清晰、差异明显的扩增条带，成本低，操作简单，实用性强，对东方鲀养殖生产具有一 定的指导作用。

附图说明

图1：F-FXF147引物在暗纹东方鲀和条纹东方鲀2个群体中的扩增结果。

M-Marker；1-12为条纹东方鲀；13-24为暗纹东方鲀。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步的详细描述。

实施例

1.暗纹东方鲀和条纹东方鲀鱼苗基因组DNA的提取及定量

采用上海捷瑞生物工程细胞/组织基因组DNA提取试剂盒快速提取2种东方鲀鱼苗尾鳍 (10～30mg)的基因组DNA(暗纹东方鲀和条纹东方鲀均来自于江苏中洋集团股份有限公司， 经形态学综合鉴定，确定为暗纹东方鲀和条纹东方鲀各12尾)，试剂盒提取样品DNA较之 传统方法提取样品DNA具有提取效率高、速度快、提取DAN质量高等特点。

2.微卫星位点的筛选及引物的合成

首先利用北京百泰克生物公司RNA提取试剂盒提取1中所鉴定的暗纹东方鲀鱼苗的 RNA，并交给上海晶能生物公司进行IllminaHiseq2000转录组高通量测序，采用Tophat软件 进行序列的组装和拼接，然后用SSRHunt软件预测序列中可能存在的微卫星位点，利用 Primer5.0软件设计引物，并由上海捷瑞生物公司合成其引物。

3.暗纹东方鲀和条纹东方鲀鱼苗鉴别引物的筛选

利用1中两种东方鲀尾鳍样品的DNA，采用PCR仪检验2中引物在暗纹东方鲀和条纹 东方鲀鱼苗中的扩增情况

1)PCR扩增体系

PCR扩增反应体系(20μL)如下：灭菌水(7.4μL)，2×TaqPlusMix(10μL)由上海皆益 生物科技有限公司提供，10uM正反引物(各0.8μL)由上海捷瑞生物工程有限公司提供，东 方鲀幼鱼尾鳍模板DNA(1μL)。

2)PCR扩增反应

在PCR扩增仪上于95℃预变性5min；30个循环：94℃变性30sec，52℃下退火30sec， 72℃延伸30sec；最后72℃延伸5min，4℃保存。

3)琼脂糖凝胶电泳检测

取PCR扩增反应产物5μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色并用紫外凝胶成像系统拍 照。

4)鉴别引物的确定

挑选出能在暗纹东方鲀和条纹东方鲀鱼苗中成功扩增且产物经3)检测可得出明显差别 条带的一对引物，所述的引物序列为：

F：5’-AACAAGTGCATGGCTGAGTG-3’(SEQIDNo.1)；

R：5’-TTGACAGATGTGGAGCTGATG-3’(SEQIDNo.2)。

此对引物所得产物的电泳图如图1所示，根据电泳条带与标准Marker比较：300bp左右 大小的条带为暗纹东方鲀，600bp左右大小的条带为条纹东方鲀。