亲和层析纯化抗肿瘤坏死因子α单克隆抗体的方法

技术领域

本发明属于蛋白纯化领域，具体涉及一种亲和层析纯化抗肿瘤坏死因子α单克隆抗体的 方法。

背景技术

单克隆抗体在体内造影、体外诊断、人和动物的治疗以及工业上的应用范围越来越广， 特别在医药领域，美国FDA已批准几十种单克隆抗体药物，约有200多种单克隆抗体药物在 临床试验中。2012年，全球销售额前10位的药物中有6个是抗体药物，且前3位是以肿瘤 坏死因子α(TNFα)为靶点的抗体药物，其中包括阿达木单抗(adalimumab，商品名Humira)。

人肿瘤坏死因子-α(hTNFα)是由三个17kDa蛋白质亚基组成的同源三聚体，是由单核 细胞和巨噬细胞分泌的炎性细胞因子，在多种细胞反应如坏死和凋亡中作为信号传递物起作 用，参与炎性疾病、自身免疫病、细菌感染、癌症和退形性病变。对hTNF-α具有高度选择 性和反应性的单克隆抗体能够对上述疾病具有较好的治疗作用。

单克隆抗体生产过程中的细胞培养阶段会引入多种杂质，需要进行有效地纯化过程以得 到目标抗体。单克隆抗体目前广泛采用三步纯化策略：粗纯(样品捕获)、中度纯化、精细纯 化。这三步每步承担着不同作用，样品捕获阶段，样品中大量杂质被有效去除，如杂蛋白和 核酸、内毒素和病毒，在初步纯化阶段，样品通过分离、浓缩和对目标产品进行稳定化处理， 在精细纯化阶段，为达到较高的纯度以及高质量的样品必须去除任何残留的微量杂质。其中 样品捕获阶段目前主流采用蛋白A亲和层析法，已知蛋白A可与多种哺乳动物的IgG相结合， 基质上的蛋白A配体能与抗体的Fc区形成可逆的特异性结合，竞争洗脱使用特异性或非特 异性配体洗脱条件，在上样过程中，目标抗体被结合，并以纯化或者浓缩的形式被收集，同 时部分杂质也会被去除。蛋白A亲和层析用于抗体捕获，一步工艺即可去除细胞发酵液中大 部分杂质，达到90％以上的纯度。

亲和层析填料(ProteinA)的抗体动态载量(DynamicBindingCapacity，DBC)跟上样的 保留时间(ResidentTime，RT)正相关，保留时间长，载量高。随着抗体生产工艺规模的扩 大，细胞培养收获的上清液在亲和层析中的上样过程，成为最耗工时的部分，这是因为，为 了提高产能，现有技术均倾向于追求高动态载量来提高亲和层析填料的利用率，强调增加保 留时间的重要性，多采用低速恒速上样，这不可避免地增加了上样时间，延长了工艺周期。 对于稳定性差的细胞发酵液来说，必然会影响产品质量或增加后续纯化的生物污染风险。另 外蛋白A亲和层析填料价格昂贵，占抗体纯化工艺总成本的大部分，因此有必要对亲和层析 工艺进行研究以提高层析填料的效价比以及提高抗体的纯化效率，使工艺更适合大批量抗体 的纯化及制备，使生产的抗体更有市场竞争力。

发明内容

本发明提供了一种亲和层析纯化抗肿瘤坏死因子α单克隆抗体的方法，该方法采用蛋白 A为层析填料，上样阶段采用变速上样模式，能够充分利用填料的动态载量，提高平均上样 速度，减少整体上样时长，回收率和产品纯度均可达到90％以上，从而提高了整体工艺效率， 节约成本，适合工业大批量生产抗肿瘤坏死因子α单克隆抗体。

本发明提供的亲和层析纯化抗肿瘤坏死因子α单克隆抗体的方法，其特征在于，亲和层 析填料为蛋白A填料，上样过程采用变速上样的模式。蛋白A填料选用了GE公司生产的 MabSelect^TM树脂，同性能的蛋白A填料还有上海博格隆生物科技有限公司生产的BGL ProteinA树脂。

装填MabSelect^TM树脂蛋白A填料的层析柱可以采用柱体积小至几毫升的层析柱进行小 规模纯化，也可放大用于几升或几百升更大柱体积的层析柱用于大规模抗体纯化。本发明采 用2-10ml柱体积的层析柱进行研究。

本发明所述的抗体为人源化的抗肿瘤坏死因子α单克隆抗体。实验采用的抗体是用重组 人TNFα来免疫BALB/c鼠获得的鼠单克隆抗体，通过基因改造制成的人源化抗人TNFαIgG1 单克隆抗体，由悬浮培养于无菌培养基中的哺乳动物细胞(中国仓鼠卵巢CHO)所生产，其 与TNFα的两个主要结合区域为Tyr141+Tyr142和Lys90+Arg131。该抗体的制造方法已公开 在中国专利CN101111521中，其重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列分别为该专 利序列表中的SEQIDNO:36和SEQIDNO:39。

本发明的方法首先要测定填料在不同保留时间下的动态载量(DBC)。采用下表层析条件， 分别测定1.2min、2.4min、4min、6min、8min保留时间下的动态裁量，以上述保留时间上 样至层析柱，直至UV280达到10％背景穿透，结束上样。

测得上述各保留时间的动态载量结果如下：

以保留时间(t)作为横坐标，动态载量(DBC)作为纵坐标做散点图，添加截距为0的 3项式与散点最为接近的趋势线图(附图1)，并获得与其相应的三次方程y＝0.2532x³－ 3.9502x²+19.05x。

不同保留时间下的动态载量结果也显示，随着保留时间的增加，动态载量也随之增加。 在1.2-4min保留时间范围内随着保留时间的延长，MabSelect^TM动态载量有较明显的升高，4 min以上保留时间条件下MabSelect^TM的动态载量进入平台期，差别不大。

根据体积流速的公式Q＝CV/t，保留时间t与体积流速Q为反比关系，即保留时间越长， 体积流速越慢。我们选择设置3个不同的保留时间段即三种流速，高速保留时间段(t_A)为 1.2-2.2min、中速保留时间段(t_B)为2.5-4.5min、恒速保留时间段(t_C)为6min，并把t_A、 t_B及t_C保留时间段分别平均分成10个保留时间点，如表1所示：

表1变速上样不同保留时间段选择

将上述t_A、t_B及t_C各时间点代入三次方程y＝0.2532x³－3.9502x²+19.05x中，计算出高 速、中速、恒速三阶段各个保留时间下的动态载量DBC_A、DBC_B、DBC_C，结果如下：

由附图1可知，保留时间在4-8分钟时间段的曲线出现了向下弯曲的形状，因此导致此 范围内计算出的动态载量略低于实际测定值。但是通过该三次方程仍然可以计算测量范围内 的任何一个保留时间下的理论动态载量仍可作为工艺参考。

针对抗体纯化的特定条件(柱体积和待纯化细胞培养上清抗体表达量)，根据不同保留时 间下的流速组合计算出该工艺对应的变速上样组合表。

首先，根据体积流速的公式：Q＝CV/t计算可得到不同保留时间下的体积流速(其中Q 为体积速度，CV为柱体积，t为保留时间)：

根据公式T_L＝(CV*DBC)/Titer/Q计算得到不同保留时间下满载所需的上样时间(其中： T_L为满载上样时间，DBC为不同时间下的动态载量，Titer为细胞培养上清抗体表达量，Q为 不同保留时间下的体积流速)：

根据公式：

T_L(AnBnC)＝[CV*DBC_(An)]/Titer/Q_(An)+[CV*(DBC_(Bn)-DBC_(An))]/Titer/Q_(Bn)+[CV*(DBC _(C)-DBC_(Bn))]/Titer/Q_(C)可计算得到变速上样不同保留时间阶段组合条件下所需的总时间。

其中：

T_L(AnBnC)为分别在t_(An)、t_(Bn)、t_(C)三阶段保留时间组合下的变速上样总时间；

CV为柱体积；

DBC_(An)、DBC_(Bn)、DBC_(C)为分别在t_(An)、t_(Bn)、t_(C)三个保留时间下的动态载量；

Titer为细胞培养上清液抗体表达量；

Q_(An)、Q_(Bn)、Q_(C)为分别在t_(An)、t_(Bn)、t_(C)三个保留时间下的体积流速。

不同上样速度组合下的上样总时间如下表所示：

计算所得表中最小值MIN[T_L(A1B1C)，T_L(A2B1C)……T_L(AnBnC)]，所对应的t_(An)、t_(Bn)、t _(C)三个保留时间组合为总上样时间最短的变速上样组合。

以上述计算方法为依据，设计得出本发明的变速上样模式先后包括采用的柱保留时间为 1.2-2.2分钟的快速上样阶段，采用的柱保留时间为2.5-4.5分钟的中速上样阶段，和采用的柱 保留时间为6分钟的恒速上样阶段，实际实验操作印证所包含的变速上样组合均能够大幅减 少上样时长；优选的变速上样模式为先后包含快速、中速两个阶段，其中快速上样阶段采用 的柱保留时间为1.2‐1.5分钟，中速上样阶段采用的柱保留时间为2.5‐3.1分钟；最优选的变 速上样过程为先后采用柱保留时间为1.2分钟的快速上样阶段和采用柱保留时间为2.7min的 中速上样阶段。

本发明提供了一种亲和层析纯化抗肿瘤坏死因子α单克隆抗体的方法，该方法采用蛋白 A为层析填料，蛋白A填料选用了GE公司生产的MabSelect^TM树脂，上样模式采用变速上样 方式，先后采用高速、中速、恒速三阶段或高速、中速两阶段对应的不同保留时间的体积流 速上样，结果发现，对相同量的抗体细胞培养上清液进行亲和层析，总上样时长相比恒速上 样能够缩短一半，而回收率和产品纯度相当，因此本发明的变速上样模式能够节省整个亲和 层析工艺时间，提高了纯化效率，节约了成本，适合工业大规模纯化抗体。

下面结合具体实施方式的实施例及说明书附图做进一步说明。

说明书附图

附图1GEMabSelect^TM填料理论动态载量趋势图

具体实施方式

实施例1

纯化条件：

层析柱：PP10/35(10mm×35mm)，填料：GEMabSelect^TM，柱体积：2.7ml

样品：重组人源化抗肿瘤坏死因子α单克隆抗体细胞培养上清液 抗体含量：0.86g/L

平衡液：10mMNaPi，pH7.2

淋洗液1：10mMNaPi，pH7.2

淋洗液2：10mMNaPi，0.4MNaCl，pH7.2

淋洗液3：10mMNaPi，pH7.2

洗脱液：0.1MGlycine，pH3.3

操作方法：先用5倍柱体积的平衡液对层析柱平衡，然后(按照上样方案进行)上样；上样 结束后依次用3倍柱体积的淋洗液1、5倍柱体积淋洗液2、3倍柱体积淋洗液3对层析柱进 行淋洗；再用5倍柱体积的洗脱液进行洗脱，洗脱过程收集280nm波长下大于20mAu的吸 收值的部分样品；洗脱结束后，再用3个柱体积平衡液冲洗层析柱。

上样方案：

根据公式Q＝CV/t计算得到表1所示高速(Q_A)、中速(Q_B)、恒速(Q_C)三个保留时 间阶段不同保留时间点下的体积流速。其中CV为柱体积2.7ml，t为保留时间，计算结果如 下：

不同保留时间下的体积流速(ml/min)

根据上述变速上样总时长T_L(AnBnC)的计算方法，细胞培养澄清液(浓度0.86g/L)在 PP10/35规格MabSelect^TM柱(2.7ml)的变速上样组合及相应上样总时长如下表所示：

根据以上的变速上样组合表可见，重组人源化抗肿瘤坏死因子α单克隆抗体(浓度0.86 g/L)在PP10/35规格的MabSelect^TM柱上样至满载的最短时间为50.2min，即使用“T1＝1.2min， T2＝2.7min，T3＝6min”的保留时间组合。

按层析填料满载80％的上样量，变速上样保留时间点组合“t_A＝1.2min，t_B＝2.7min，t_C＝6 min”设计变速上样的试验方案，计算得各阶段的上样条件如下表所示：

由于恒速t_C阶段的上样量为负值，实验中执行高速t_A+中速t_B两阶段上样。

由于4min保留时间以后填料的载量处于平台期，几乎不再增加，即采用4min保留时间 下的流速上样为效率最高的恒速上样方案，因此，以保留时间为4分钟，上样量与变速上样 方案一致即67.3ml，进行恒速上样对照试验，与上述“t_A＝1.2min，t_B＝2.7min”变速上样方案 进行工艺比较。通过UV分光光度法在280nm计算关于洗脱样品的回收(使用1cm光程对于 1mg/mL溶液1.59的消光系数)，通过AHPLC测定确定样品的抗体含量，执行 SEC-HPLC对纯度评估。

实验结果：

上表结果显示，本实施例的变速上样模式使上样时长比恒速上样缩短了一半以上，从而 使整体工艺时间缩短一半左右，但回收率相当，产品纯度也相当，纯化效果基本一致。

实施例2

纯化条件：

层析柱：Tricorn10/100(10mm×100mm)，填料：GEMabSelect^TM，柱体积：7ml

样品：重组人源化抗肿瘤坏死因子α单克隆抗体细胞培养上清液 抗体含量：0.62g/L

平衡液：10mMNaPi，pH7.2

淋洗液1：10mMNaPi，pH7.2

淋洗液2：10mMNaPi，0.4MNaCl，pH7.2

淋洗液3：10mMNaPi，pH7.2

洗脱液：0.1MGlycine，pH3.3

操作方法：先用5倍柱体积的平衡液对层析柱平衡，然后(按照上样方案进行)上样；上样 结束后依次用3倍柱体积的淋洗液1、5倍柱体积淋洗液2、3倍柱体积淋洗液3对层析柱进 行淋洗；再用5倍柱体积的洗脱液进行洗脱，洗脱过程收集280nm波长下大于20mAu的吸 收值的部分样品；洗脱结束后，再用3个柱体积平衡液冲洗层析柱。

上样方案：

根据公式Q＝CV/t计算得到表1所示高速(Q_A)、中速(Q_B)、恒速(Q_C)三个保留时 间阶段不同保留时间点下的体积流速。其中CV为柱体积7ml，t为保留时间，计算结果如下：

不同保留时间下的体积流速(ml/min)

根据上述变速上样总时长T_L(AnBnC)的计算方法，细胞培养上清液(浓度0.62g/L)在 Tricorn10/100规格MabSelect^TM柱(7ml)的变速上样组合及相应上样总时长如下表所示：

Tricorn10/100规格MabSelect^TM柱变速上样组合表

由上表可知，重组人源化抗肿瘤坏死因子α单克隆抗体细胞培养上清液(浓度0.62g/L) 在Tricorn10/100规格的MabSelect^TM柱上样至满载的最短时间为69.6min，即使用“t_A＝1.2min， t_B＝2.7min，t_C＝6min”的保留时间组合。

以满载80％的上样量进行测试，设计“t_A＝1.2min，t_B＝2.7min，t_C＝6min”变速上样的试 验方案，各阶段的上样条件如下：

Tricorn10/100规格MabSelect柱变速上样实验方案

由于恒速t_C阶段的上样量为负值，实验中执行高速t_A+中速t_B两阶段上样。

以保留时间为4分钟，上样量241.9ml，进行恒速上样对照试验，与上述“t_A＝1.2min， t_B＝2.7min”变速上样方案进行工艺比较。通过UV分光光度法在280nm计算关于洗脱样品的 回收(使用1cm光程对于1mg/mL溶液1.59的消光系数)，通过AHPLC测定确定 样品的抗体含量，执行SEC-HPLC对纯度评估。

实验结果：

上表结果显示，本实施例通过公式推导设计的最优变速上样方案通过实际实验证明，该 变速上样模式使上样时长比恒速上样缩短了一半以上，从而大大缩短了整体工艺时间，但回 收率相当，产品纯度也相当，纯化效果基本一致。

实施例3

纯化条件及操作方法(同实施例2)

上样方案：

选取实施例2中Tricorn10/100规格MabSelect^TM柱变速上样组合表中上样时长为89.4的 上样组合，即“t₁＝2.1min，t₂＝4.1min，t₃＝6min”进行试验。

以满载80％的上样量进行测试，设计“t₁＝2.1min，t₂＝4.1min，t₃＝6min”变速上样的试验 方案，各阶段的上样条件如下：

由于t₃阶段的上样量为负值，实验中执行t₁+t₂两阶段上样。

同时，以“t＝4min保留时间，上样量＝242.1ml为条件”进行恒速上样对照试验，与上述 “t₁＝2.1min，t₂＝4.1min”上样方案进行工艺比较。通过UV分光光度法在280nm计算关于洗脱 样品的回收(使用1cm光程对于1mg/mL溶液1.59的消光系数)，通过AHPLC测 定确定样品的抗体含量，执行SEC-HPLC对纯度评估。

实验结果：

实际实验结果表明，“t₁＝2.1min，t₂＝4.1min”的变速上样方案，上样时长比“t＝4min”恒 速上样减少接近一半，从而大大缩短了整体工艺时间，但回收率相当，产品纯度也相当，纯 化效果基本一致。