黑果枸杞遗传转化体系建立的方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物领域的遗传转化方法，特别涉及黑果枸杞遗传转化建立的方法及其应用。

背景技术

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)是茄科枸杞属的一种带刺野生灌木，株高约20～50 cm，主要分布于山西北部、宁夏、甘肃、青海、新疆、西藏等荒漠地区，呈片状丛生分布， 对盐渍化土壤具有很强的适应能力。目前对于黑果枸杞的研究主要集中在果实营养成分、药 用成分、色素和多糖提取工艺及药理分析方面，还未见有关于黑果枸杞遗传转化体系建立的 报道。

发明内容

本发明的目的是提供黑果枸杞遗传转化体系建立的方法。

本发明所提供的黑果枸杞遗传转化建立的方法，包括如下步骤：

(1)将含有目的DNA的质粒导入农杆菌得到重组农杆菌；将所述重组农杆菌在含有卡 那霉素(Kanamycin，Kan)的LB液体培养基中于28℃振荡培养24-36小时；

(2)取所述步骤(1)的菌液于含有卡那霉素的LB液体培养基中，28℃振荡培养至OD₆₀₀值为0.5-0.7，离心收集菌体；

(3)用LB液体培养基重悬所述步骤(2)收集的菌体，28℃继续振荡培养至菌液OD₆₀₀值分别为0.5、0.6和0.7，用作侵染液；

(4)用所述步骤(3)的侵染液浸泡黑果枸杞外植体10-30分钟，得到侵染后的黑果枸 杞外植体；

(5)将所述步骤(4)得到的侵染后的黑果枸杞外植体放置于共培养培养基上于黑暗中 共培养2-4天，得到共培养物；

(6)将所述步骤(5)得到的共培养物用含有500mg/L头孢霉素(Cefotaxime,Cef)的无 菌水清洗后转移至含有20mg/L卡那霉素和300mg/L头孢霉素的愈伤组织诱导及筛选培养基 上培养10-14天，得到去除农杆菌后的愈伤组织；

(7)将所述步骤(6)得到的去除农杆菌后的愈伤组织在头孢霉素浓度递减的愈伤组织 诱导及筛选培养基上培养2-3周，得到抗性愈伤组织；

(8)将所述步骤(7)得到的抗性愈伤组织转入选择和分化培养基上培养6-8周，得到 丛生芽；

(9)将所述步骤(8)得到的丛生芽在生根诱导培养基上诱导生根，即得到黑果枸杞的 抗性再生苗。

所述步骤(1)中含有卡那霉素的LB液体培养基中各成分的浓度为：卡那霉素50mg/L、 胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L和氯化钠10g/L。

所述步骤(2)中含有卡那霉素的LB液体培养基中各成分的浓度为：卡那霉素50mg/L、 胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L和氯化钠10g/L。

所述步骤(3)中所述菌液的OD₆₀₀值为0.6。

所述步骤(4)中，所述黑果枸杞外植体为黑果枸杞叶片；所述浸泡时间为20分钟。

所述步骤(5)中所述共培养培养基为：MS基本培养基，附加30g/L蔗糖、6.0g/L琼脂 粉和0.2mg/L2,4-D。

所述步骤(6)中所述愈伤组织诱导及筛选培养基为：MS基本培养基，附加30g/L蔗糖、 6.0g/L琼脂粉、0.2mg/L2,4-D、20mg/L卡那霉素和300mg/L头孢霉素。

所述步骤(8)中所述选择和分化培养基为：MS基本培养基，附加30g/L蔗糖、6.0g/L 琼脂粉、2.0mg/L6-BA、20mg/L卡那霉素和150mg/L头孢霉素。

所述步骤(9)中所述生根诱导培养基为：MS基本培养基，附加30g/L蔗糖、6.0g/L琼 脂粉和0.2mg/Lα-萘乙酸。

所述建立黑果枸杞遗传转化体系的方法在获得黑果枸杞转基因材料中的应用也属于本发 明的保护范围。

本发明所提供的黑果枸杞的遗传转化方法，操作简单易行，转化后得到的愈伤组织存活 率高，可为黑果枸杞的基因工程研究和分子育种提供材料。

附图说明

图1为质粒提取检测结果；泳道1-4：质粒pET21b；泳道M:100bpplusDNAladder。

图2为NahG基因高保真PCR结果；泳道1和2：NahG条带；泳道M:100bpDNAladder。

图3为目的基因和载体双酶切；泳道1：NahG基因双酶切；泳道2：载体pBI121双酶切； 泳道M:100bpDNAladder。

图4为利用M13F/R引物进行Trans1-T1菌液PCR的结果；泳道1和2:NahG条带；泳 道M:DL1000DNAladder。

图5为携带有NahG的GV3101菌液PCR检测结果；泳道1和2:NahG条带；泳道M:100 bpplusDNAladder。

图6为真核表达载体构建示意图。

图7为黑果枸杞叶片Kan耐性试验；其中，图7中a：A:对照，B：50mg/LKan，C:100 mg/LKan，D:200mg/LKan；图7中b：A:10mg/LKan，B:20mg/LKan，C:对照，D:30mg/L Kan，E:50mg/LKan。

图8为黑果枸杞遗传转化获得抗性再生苗的过程；A:外植体侵染后产生的愈伤组织， B:愈伤组织在筛选培养基上分化，C:分化的抗性丛生芽，D:生根的抗性再生植株。

具体实施方式

实施例1、建立黑果枸杞遗传转化体系

一、真核表达载体的构建

1、目的基因NahG的获得

(1)质粒提取

含有载体PET21b-NahG的E.coli菌株DH5α由中国人民武装警察部队后勤学院(天津市职 业与环境危害防制重点实验室)赵化冰老师惠赠。NahG基因(AY20891ND09189257-90561) 来自萘降解菌株Pseudomonassp.ND6(Zhaoetal.2005)。将DH5α(pET21b-NahG)接种至LB 液体培养基，37℃，200rpm/min振荡培养过夜，使用天根质粒小提试剂盒(TIANprepMini PlasmidKit)提取质粒，方法如下：

1.向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μL的平衡液BL，12,000rpm离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中，平衡吸附柱；

2.取1-5mL过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000rpm离心1 min，尽量吸除上清；

3.向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1(使用前加入RNaseA)，涡旋振荡器彻 底悬浮细菌沉淀；

4.向离心管中加入250μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解；

5.向离心管中加入350μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现 白色絮状沉淀，12,000rpm离心10min；

6.将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)，12,000 rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中；

7.向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW(使用前加入无水乙醇)，12,000rpm离心30-60 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中；

8.重复操作步骤7；

9.将吸附柱CP3放入收集管中,12,000rpm离心2min，将吸附柱中残余的漂洗液去除。 将吸附柱CP3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

10.将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μL洗脱缓 冲液EB，室温放置2min，12,000rpm离心2min，将质粒溶液收集到离心管中。

将提取的质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1。

(2)引物设计、合成及PCR法扩增目的基因NahG

用PrimerPremier5软件设计引物，并添加与表达载体相应的限制性内切酶酶切位点，由 生工(SangonBiotec)合成，最终引物序列如下：

NG-F5’-CGCGGATCCATGAAAAACAATAAACC-3’

NG-R5’-CCAATCTCGAGCCCTTGACGTAGCAC-3’

其中下划线部分为BamHI酶切位点，斜体部分为XhoI酶切位点。以提取的质粒载体pET21b 为模板，用高保真DNA聚合酶Pyrobest进行PCR，获取目的基因NahG，50μL反应体系如下：

PCR扩增程序：

PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测结果见图2。

用TransgenDNA胶回收试剂盒回收目的基因片段，方法如下：

1.紫外灯下切取含DNA片段的琼脂糖凝胶，放入1.5mL离心管内；

2.加入3倍凝胶体积的溶胶液GSB，55℃水浴直至凝胶完全溶化；

3.溶胶冷却至室温后转移到DNA吸附管离心柱中，静置1min；

4.12,000rpm，离心30–60s；弃流出液；

5.加入650μL漂洗液WB，12,000rpm，离心30–60s，弃流出液；

6.12,000rpm，空离心2min，去除残留WB；

7.将吸附柱开盖于超净工作台2min，使WB完全挥发；

8.加入30-50μL洗脱液TE，室温静置1min；吸附柱放入新的1.5mL离心管；

9.12,000rpm，离心2min，置于-20℃保存备用。

(3)PCR产物序列测定

测定了3个阳性单克隆，其序列完全一致，与已发表的NahG序列有2个碱基的差异， 即43位和609位(identity＝99.58％)，可以认为扩增得到的基因即为NahG。

(4)目的基因与表达载体酶切、回收与连接

将pBI121质粒与NahG(连接至pEASY-T3载体)分别用限制性内切酶BamHI和XhoI进 行双酶切，20μL酶切体系：

双酶切结果见图3。

琼脂糖凝胶电泳分离并切取所需DNA片段，用DNA胶回收试剂盒回收产物，方法同上。 将回收片段用T₄DNA连接酶连接，10μL连接体系：

3、连接产物扩增及序列测定

利用热激法将连接产物转化至50μL大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1，涂布卡那霉素抗性 选择培养基平板(LB固体培养基+50mg/LKan)。挑取阳性单菌落，接种至LB液体培养基， 37℃，200rpm/min振荡培养14h，提取质粒并测序。

菌液PCR法鉴定阳性克隆，15μL体系如下：

PCR扩增程序：

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图4。

4、热激法转化农杆菌GV3101感受态细胞

采用热激法将目的基因与表达载体的连接产物转入农杆菌GV3101菌株(购自北京华越 洋生物科技有限公司，产品目录号WaryongGT707)，方法如下：

1)将连接产物加入50μL感受态细胞，轻柔混匀，冰浴30min；

2)液氮中速冻1min，37℃水浴3min，加入500μL液体LB培养基，28℃振荡培养4h；

3)取500μL菌液涂布于卡那霉素抗性筛选培养基平板上，吹干，28℃倒置培养2-3天；

4)利用PCR法鉴定阳性克隆。

菌液PCR方法同上，琼脂糖凝胶电泳结果见图5。对阳性克隆测序，所测序列与原序列 一致。至此，完成真核表达载体的构建和携带目的基因的农杆菌(工程菌)构建，真核表达 载体示意图见图6。

二、黑果枸杞的遗传转化

1、黑果枸杞对卡那霉素的耐性试验

将黑果枸杞幼苗叶片接种至含有不同浓度卡那霉素的MS培养基上，观察叶片对卡那霉 素的耐受性。分别设置卡那霉素的浓度为：0,50,100,150,200,250和300mg/L，结果：当 卡那霉素浓度大于200mg/L时，外植体在接种3天后即出现白化现象，5天后几乎全部白化 死亡；当卡那霉素浓度为50mg/L时，外植体与对照没有明显差别；当卡那霉素浓度为100 和150mg/L时，外植体在接种两周后明显变黄，三周后半数外植体白化死亡。结果见图7a。

之后，进一步实施了黑果枸杞外植体在愈伤组织诱导培养基(MS+30g/L蔗糖+6.0g/L 琼脂粉+0.2mg/L2,4-D)上的卡那霉素耐性试验，将外植体接种在卡那霉素浓度依次为0， 10，20，30，50mg/L的愈伤组织诱导培养基上。结果表明，卡那霉素浓度为0的对照组外 植体接种10天后开始形成愈伤组织；卡那霉素浓度为10和20mg/L的外植体在接种15天时 开始出现愈伤组织，且前者愈伤组织形成率高于后者；卡那霉素浓度高于30mg/L后，外植 体变干，愈伤组织形成减少，质量差，且形成时间严重推后。因此本实验选择20mg/L卡那 霉素作为筛选压力，结果见图7b。

2、侵染试验

1)将PCR检测和测序验证为阳性的单克隆接种于含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基 (胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L；pH7.0)中，28℃振荡培养24-36h；

2)取1mL上述菌液于50mL含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L、 酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L；pH7.0)中，28℃振荡培养至OD₆₀₀值为0.5-0.7，然后4,000 rpm，4℃离心10min，收集菌体；

3)用LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L；pH7.0)重 悬菌体，28℃继续振荡培养至OD₆₀₀值分别为0.5、0.6和0.7，用作侵染液；

4)取苗龄20-25天的黑果枸杞叶片和茎段作为外植体，用上述侵染液浸泡外植体不同时 间：10、20和30min；同时用前期培养的黑果枸杞愈伤组织进行同样的侵染实验；

5)用无菌吸水纸将侵染后的叶片上多余的菌液吸干，然后将叶片放置于共培养培养基 MS₁(MS+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂粉+0.2mg/L2,4-D)上于黑暗中共培养适当时间；侵 染试验以不同外植体类型、菌液浓度、侵染时间和共培养时间4个因素进行正交设计，以获 得最佳侵染方案(见表1)。

表1.黑果枸杞侵染试验正交设计

注：G0表示转化空载体pBI121；GV表示转化重组载体pBI121-NahG

6)共培养结束后用含有500mg/L头孢霉素的无菌水清洗后，将叶片转移至愈伤组织诱 导及筛选培养基MS₂(MS+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂粉+0.2mg/L2,4-D+20mg/L卡那霉素+ 300mg/L头孢霉素)，培养10-14天，得到去除农杆菌后的愈伤组织；

7)两周后更换培养基，将培养基中头孢霉素浓度降至200mg/L，以后每10天更换一次 培养基，头孢霉素浓度依次递减；

8)一个月后将诱导出的抗性愈伤组织转入选择和分化培养基MS₃(MS+30g/L蔗糖+ 6.0g/L琼脂粉+2.0mg/L6-BA+20mg/L卡那霉素+150mg/L头孢霉素)上继续培养，每 20天更换一次培养基；

9)两个月后丛生芽在生根诱导培养基MS₄(MS+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂粉+0.2 mg/LNAA)上诱导生根，即得到黑果枸杞的抗性再生苗。

10)抗性苗PCR鉴定为阳性转基因苗

以黑果枸杞抗性再生苗基因组DNA为模板，用pBI121载体的Kan抗性基因(nptⅡ)引物 进行PCR，以检测pBI121表达载体是否整合入植株基因组；同时以载体上的35S启动子上游 引物/NahG基因下游引物(35SF/NGR)进行PCR，检测目的基因NahG是否整合入植株基因 组。

Kan抗性基因(nptⅡ)引物序列：

Kan-F:5’-TATGACTGGGCACAACAGACAA

Kan-R:5’-AGCGGCGATACCGTAAAGCAC

目的基因检测引物序列：

35SF:5’-ACCCACAGATGGTTAGAGAGG

NGR:5’-CCAATCTCGAGCCCTTGACGTAGCAC

PCR体系和程序与上文连接产物扩增与序列测定的体系和程序相同。

以上两个PCR反应结果表明，NahG基因整合入黑果枸杞基因组，得到的抗性再生苗为 转基因阳性苗。

遗传转化获得抗性再生苗的过程如图8所示。

3.黑果枸杞遗传转化体系方法的确定

由侵染实验(表1)的结果可知，对于黑果枸杞的遗传转化，用叶片作为外植体进行侵 染其效果优于茎段，而用愈伤组织直接侵染效果最差，究其原因可能是侵染后的愈伤组织吸 附菌体过多，且不易去除，使得共培养时愈伤组织被菌体污染致死。菌液浓度0.5、侵染时间 30min、共培养4天的实验组合与菌液浓度0.6、侵染时间20min、共培养2天的实验组合相 比，二者转化效率没有显著差异。因此，综合考虑实验的可操作性及时间因素，我们确立了 黑果枸杞遗传转化体系的优选方法，即：以叶片为外植体，侵染菌液OD₆₀₀为0.6，菌液浸泡 时间为20min，菌体与外植体共培养时间为2天；各时期所用培养基类型及成分分别为：

共培养培养基MS₁：MS基本培养基，附加30g/L蔗糖、6.0g/L琼脂粉和0.2mg/L2,4-D。

愈伤组织诱导及选择培养基MS₂：MS基本培养基，附加30g/L蔗糖、6.0g/L琼脂粉、 0.2mg/L2,4-D、20mg/L卡那霉素和300mg/L头孢霉素。

选择和分化培养基MS₃：MS基本培养基，附加30g/L蔗糖、6.0g/L琼脂粉、2.0mg/L6-BA、 20mg/L卡那霉素和150mg/L头孢霉素。

生根诱导培养基MS₄：MS基本培养基，附加30g/L蔗糖、6.0g/L琼脂粉和0.2mg/Lα- 萘乙酸。