一种采用SSR分子标记技术鉴别谷子品种的方法及应用

技术领域

本发明涉及一种采用SSR分子标记技术鉴别谷子品种的方法及应用，属于植物品种鉴别技术领域。

背景技术

谷子属禾木科狗尾草属作物，具有生育期短、耐旱、耐瘠等生理特性，广泛分布于亚欧大陆的温带和热带，是中国黄河中上游地区主要栽培作物之一。同时，谷子营养价值极高，含有丰富的氨基酸、蛋白质、维生素以及钙、铜、铁、锌、硒、碘、镁等微量元素，营养保健作用也非常显著。多年来，品种鉴定是以形态学标记为依据的。这种方法虽然简单经济，但周期长，花费大，受季节限制，而且很多性状的表现受栽培措施及环境因子影响，从而制约了鉴定的准确性。DNA分子标记技术则具有高效、准确、不受环境条件影响、实验操作简单等优点，已广泛应用于植物品种真实性鉴定及纯度检测研究。SSR标记是近年来发展起来的建立在PCR基础上的第二代分子标记。由于SSR分子标记具有数量丰富、多态性高、遗传共显性、谱带扩增稳定、精度高、检测时间短、技术成熟等特点，已应用于作物遗传学研究。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种采用SSR分子标记技术鉴别谷子品种的方法，采用的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种采用SSR分子标记技术鉴别谷子品种的方法，该方法是提取谷子DNA，利用谷子DNA和5对SSR核心引物进行PCR扩增反应，电泳检测后根据电泳检测结果鉴别谷子品种；所述5对SSR核心引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1-10所示。

优选地，所述方法步骤如下：

1)提取谷子DNA；

2)利用步骤1)所得谷子DNA和5对SSR核心引物进行PCR扩增反应，然后进行8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染显色；所述SSR核心引物，每对包括一个正向引物和一个反向引物，5对SSR核心引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1-10所示；

3)观察步骤2)的电泳结果，统计稳定且易于分辨的差异性条带，谱带按0、1系统记录，有差异性条带时赋值为1，无差异性条带时赋值为0，根据记录结果计算遗传相似系数，鉴别谷子品种。

优选地，步骤1)所述提取谷子DNA，是取谷子幼芽，液氮冷冻后于-80℃保存备用，然后利用植物基因组试剂盒提取谷子DNA。

更优选地，所述谷子幼芽，为谷子发芽后10d-15d的幼芽。

优选地，步骤1)所述谷子，品种为大叶黄谷、紫梗刀把齐、钱串紧谷、四寸红根、红根绳子头、细皮白谷、母鸡嘴、大满谷、干尖糙、六十天还仓、缰绳头、金苗黄、磨里谷、小紫苗谷、红酒谷、黑谷、钱串子、骡子尾、鸟谷、蓬莱麦茬谷、小绳头、红苗金耙齿、竹叶红、野鸡令、红苗绳头子、大鹅脖、棒子熟、八沟道、干尖子、竹叶青、二青苗、二白谷、蒜皮白谷、玉黄谷、齐头红、黄钱串、紫杆谷、白露黄、压塌车、张纯一、黑谷、青颗谷、大黑谷、小卜谷或白毛粮谷。

优选地，步骤3)所述PCR扩增反应，包括10×PCRbuffer，25mMMgCl₂，10mMdNTP，10mM正向引物，10mM反向引物，5U/μLTaq酶，50ng/μL模板DNA和ddH₂O。

更优选地，步骤3)所述PCR扩增反应，体系总体积为25μL，其中包括10×PCRbuffer2.5μL，25mMMgCl₂3μL，10mMdNTP1.25μL，10mM正向引物1μL，10mM反向引物1μL，5U/μLTaq酶0.2μL，50ng/μL模板DNA1μL，ddH₂O16.5μL。

优选地，步骤3)所述PCR扩增反应，程序为：94℃预变性3min；94℃变性45s，50℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

优选地，所述方法具体步骤为：

1)谷子DNA的提取：取发芽后10d-15d的谷子幼芽，液氮冷冻后于-80℃保存备用，利用植物基因组试剂盒提取谷子幼芽的DNA，获得谷子DNA；

2)PCR扩增和电泳检测：利用步骤1)所得谷子DNA和5对核苷酸序列如SEQIDNO.1-10所示的SSR核心引物进行PCR扩增反应；然后对PCR产物进行8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染显色；

所述SSR核心引物，每对包括一个正向引物和一个反向引物；所述PCR扩增反应，体系总体积为25μL，其中包括10×PCRbuffer2.5μL，25mMMgCl₂3μL，10mMdNTP1.25μL，10mM正向引物1μL，10mM反向引物1μL，5U/μLTaq酶0.2μL，50ng/μL模板DNA1μL，ddH₂O16.5μL；PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性45s，50℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；

3)观察步骤2)的电泳结果，统计稳定且易于分辨的差异性条带，谱带按0、1系统记录，有差异性条带时赋值为1，无差异性条带时赋值为0，根据记录结果计算遗传相似系数，鉴别谷子品种。

以上所述任一方法在鉴别谷子品种中的应用。本发明有益效果：

1、本发明利用SSR分子标记对45个谷子品种进行鉴别，结果表明：5对谷子SSR引物共扩增出35个等位基因，平均每对引物7个等位基因；各引物的多态信息指数为0.688～0.846，平均值为0.779；通过NTsys-pc2.11进行各品种间遗传相似系数的计算，各品种间遗传相似系数在0.6571～0.9429之间，45个谷子品种的平均遗传相似系数为0.7554；选用的5对谷子引物均有良好的多态性及鉴别能来，能有效将45个谷子品种区分，为进一步鉴别大量谷子品种提供了重要途径。

2、本发明仅利用5对谷子引物就能够将谷子品种有效鉴别开，鉴别准确率高达100％，在进一步鉴别大量谷子品种方面具有很大潜力，与现有专利相比，效果更佳，更节约时间、成本等。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

以下实施例中谷子品种名称及资源库号均来自于中国作物种质信息网。

实施例1：方法的建立

1、准备谷子材料：将盖州红、鸭子嘴、大头黄、大白毛、老来变、红粘谷、刀把齐、勾根红、钱串子、大青苗、黄粘谷、红谷子、黄谷、鸭子嘴、大粒黄、红苗谷这15种谷子材料种植于温室；取发芽后10d-15d左右的谷子幼芽，液氮冷冻后放入-80℃超低温冰箱中保存备用；15种谷子品种信息如表1所示。

表115种谷子品种信息

2、谷子DNA的提取：用植物基因组试剂盒提取各种谷子材料的DNA，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度；将各材料的DNA浓度稀释至50ng/μL后，置于-20℃冰箱中备用；

3、PCR扩增反应、电泳检测：PCR反应总体积为25μL，包括10×PCRbuffer2.5μL，MgCl2(25mM)3μL，dNTP(10mM)1.25μL，正向引物(10mM)1μL，反向引物(10mM)1μL，Taq酶(5U/μL)0.2μL，模板DNA(50ng/μL)1μL，ddH2O16.5μL；PCR的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性45s，50℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；PCR扩增产物中加入6倍的Loadingbuffer4μL，取1.5μL上样，用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染显色。

4、选用4个来源于不同基因组谷子的参比种质(CS01～CS04)，对本实验中合成的130对SSR引物进行初筛，根据扩增产物多态性，选出45对在不同基因组谷子之间都有差异的引物；然后再用11个参比种质材料(FS01～FS11)对这些多态性引物进行复筛，谷子SSR复筛引物多态性信息见表2；最后选出了条带清晰、便于统计，且在不同谷子质间有良好多态性的5对引物作为SSR核心引物，谷子SSR核心引物扩增的结果参见表3。非核心引物信息见表4。

表2谷子SSR复筛引物扩增结果

表3谷子SSR核心引物扩增结果

表4非核心引物信息

5、统计分析：观察PCR产物电泳结果，Gel-Proanalyzer软件统计稳定且易于分辨的差异性条带，谱带按0、1系统记录，有此带时赋值为“1”，无此带时赋值为“0”，构建各品种相应0、1字符；记录结果利用NTsys-pc2.11计算遗传相似系数。

6、结果与分析：

6A、采用试剂盒提取的谷子DNA条带清晰明亮，无降解现象，DNA完整性好，分光光度计检测发现A_260/280比值在1.8～2.0之内，均能满足PCR的要求。

6B、在所用的130对引物中有效扩增引物有104对，占总扩增引物的77.0％；在不同基因组谷子间具有多态性的引物为45对，占有效扩增引物的43.3％。根据11个谷子品种扩增结果(表2)，SiG01～SiG05的等位基因数较高、多态性良好、PIC值均大于0.55；SiG06～SiG45的多态信息含量偏低，对参比种质材料的鉴别效果不理想，利用SiG06～SiG45不能有效鉴别谷子品种。因此，选择SiG01～SiG05作为谷子种质资源鉴别的SSR核心引物，且仅有这5对引物可以有效鉴别，其他引物鉴别效果均不理想。

6C、根据扩增结果，5对谷子SSR引物共得到22个等位基因，平均每对引物4.4个等位基因；11个谷子品种0、1字符见表5；各引物的多态信息指数为0.581～0.708，平均值为0.652，其中扩增多态性最好的引物为SiG02和SiG03；结果表明，选用的引物均有良好的多态性。

表511个谷子品种0、1字符

表611个谷子品种间的遗传相似系数

6D、根据SSR分析得到的个品种0、1字符，利用NTsys-pc2.11计算出11个谷子品种间的遗传相似系数(表6)，遗传相似系数为1，则为同一个品种，遗传相似系数不为1，则不是一个品种。各品种间遗传相似系数在0.3182～0.9091之间，FS07与FS08之间的遗传相似系数最小，FS01与FS03遗传相似系数最大，11个品种的平均遗传相似系数为0.6008；由此可以看出，这5对引物能有效区分11个谷子品种。

实施例2

本实施例提供了一种采用SSR分子标记技术鉴别谷子品种的方法，包括如下步骤：

1、准备谷子材料：将大叶黄谷、紫梗刀把齐、钱串紧谷、四寸红根、红根绳子头、细皮白谷、母鸡嘴等45种谷子材料种植于温室；取发芽后10d-12d左右的谷子幼芽，液氮冷冻后放入-80℃超低温冰箱中保存备用；45种谷子品种的信息如表7所示。

表745种谷子品种信息

2、谷子DNA的提取：用植物基因组试剂盒提取各种谷子材料的DNA，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度；将各材料的DNA浓度稀释至50ng/μL后，置于-20℃冰箱中备用；

3、SSR引物：实例1中复筛选出的5对适合谷子品种鉴定的SSR核心引物；

4、PCR扩增反应、电泳检测：PCR反应总体积为25μL，包括10×PCRbuffer2.5μL，MgCl2(25mM)3μL，dNTP(10mM)1.25μL，正向引物(10mM)1μL，反向引物(10mM)1μL，Taq酶(5U/μL)0.2μL，模板DNA(50ng/μL)1μL，ddH2O16.5μL；PCR的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性45s，50℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；PCR扩增产物中加入6倍的Loadingbuffer4μL，取1.5μL上样，用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染显色。

5、统计分析：观察PCR产物电泳结果，Gel-Proanalyzer软件统计稳定且易于分辨的差异性条带，谱带按0、1系统记录，有此带时赋值为“1”，无此带时赋值为“0”，构建各品种相应0、1字符；记录结果利用NTsys-pc2.11计算遗传相似系数；记录结果利用POPGENE32计算多态信息含量(PIC)、Shannon’s指数(I)、有效等为基因数(Ne)等遗传多样性数据。6、结果与分析：

6A、采用试剂盒提取的谷子DNA条带清晰明亮，无降解现象，DNA完整性好，分光光度计检测发现A260/280比值在1.8～2.0之内，均能满足PCR的要求；

6B、根据SSR结果，5对谷子SSR引物共得到35个等位基因，平均每对引物7个等位基因；45个谷子品种0、1字符见表8；各引物的多态信息指数为0.688～0.846，平均值为0.779，其中扩增多态性最好的引物为SiG04，见表9。所选用的核心引物多态信息指数均大于0.65，由此可以看出，这些引物均有良好的多态性且能有效鉴别45个谷子品种。

表845个谷子品种0、1字符

表9谷子品种鉴定核心引物扩增结果

6C、根据SSR分析得到的个品种0、1字符，利用NTsys-pc2.11计算出45个谷子品种间的遗传相似系数(表10)，各品种间遗传相似系数在0.6571～0.9429之间，45个谷子品种的平均遗传相似系数为0.7554；由此可以看出，选用的引物均有良好的多态性及鉴别能来，能有效将45个谷子品种区分。鉴别准确率高达100％。

表1045个谷子品种间的遗传相似系数

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。