一种与致病力相关的灰霉病菌基因BcCpo1及其应用

技术领域

本发明属微生物基因工程技术领域，具体涉及植物保护领域中控制真菌致病性的基因及 其编码蛋白质的应用。

背景技术

灰霉病菌(Botrytiscinerea)通常又称作灰葡萄孢，属于子囊菌门(Ascomycota)真菌，是 灰霉病的病原菌，可侵染200多种植物，包括几乎所有的蔬菜及果树。寄主从苗期、挂果期 到贮存期均可发病，而且，植株各部位均可被灰霉病菌侵染，叶部发病的典型症状表现为“V” 形病斑，花部主要表现为腐烂和调萎，果实主要表现为腐烂和脱落。病害的发生和蔓延与环 境的湿度、温度存在密切的关系，在20℃-23℃，相对湿度90％以上时发生严重。因此，灰 霉病属低温高湿型病害，在多雨季节或者保护地生产中极易发生，世界上每年因该病导致的 经济损失高达100-1000亿美元。由于寄主范围广泛，生产上危害严重，再加上相关分子研究 技术成熟，灰霉病菌已成为最重要的模式植物病原真菌之一，受到广泛研究。

灰霉病菌是典型的死体营养型病原真菌，可生成多种致病因子参与致病，主要包括细胞 壁降解酶类、角质酶、毒素、植物激素、抵抗寄主反应的酶类、小RNA及小分子物质等，这 些因子相互协作使灰霉病菌能够杀死寄主细胞，并分解死亡的寄主组织作为营养。自然条件 下，灰霉菌多以分生孢子作为侵染寄主的初侵染和再侵染来源。灰霉病菌常以菌丝体、分生 孢子或菌核附着在植物病残体上，或在土壤中越冬和越夏，成为下一生长季的初侵染来源。 当条件适宜时，菌核萌发产生菌丝体和分生孢子梗，并产生大量的分生孢子。成熟的分生孢 子能够借助风、雨水、灌概水和农事操作等进行传播。在低温高湿条件下，分生孢子萌发形 成芽管，芽管末端稍稍膨大发育成附着胞或者进一步形成侵染垫等侵染结构，主要从衰败的 花器、伤口以及坏死组织侵入。

当高浓度的灰霉病菌分生孢子侵染寄主时，发病迅速，此时主要通过芽管顶端形成的附 着胞侵入；伴随孢子浓度降低，通过芽管顶端侵入的比例降低，发病速度也相应延缓1-4天， 此时主要通过由菌丝发育成的附着胞或侵染垫侵入。灰霉病菌侵入寄主细胞后，将会直接面 临寄主组织内敌对环境的挑战，病原菌必须迅速做出调整，一方面抑制植物的防御反应，另 一方面要积极适应寄主细胞内物理、化学环境，做到这两方面，灰霉病菌才有望成功地寄生 植物。在很大程度上，灰霉病菌是通过改变自身的代谢途径，并分泌相关效应因子(如毒素) 来实现上述目标的，但参与相应过程的基因、蛋白及代谢产物及其调控的分子机制仍所知甚 少。对该领域进行深入研究，鉴定灰霉病菌用以适应寄主内环境的关键因子，不仅有助于揭 示灰霉病菌这种死体营养型病原真菌致病的分子机制，还有可能从中发现可以作为杀真菌剂 作用靶标的蛋白质，为开发防治灰霉病及其它类似病害的高效药剂奠定理论和技术基础。

Cpo1是一种粪卟啉原III氧化酶，参与催化血红素合成途径的第六步反应。该蛋白广泛 存在于动物、植物、细菌、真菌等生物，由于血红素可以作为众多蛋白的辅基参与多种生命 过程，因此，作为催化血红素合成酶类之一的Cpo1蛋白质具有重要的功能。Cpo1蛋白质在 灰霉病菌中同样存在，而且功能尚未获得鉴定，通过分析灰霉病菌Cpo1编码基因的致病功 能，评价该基因在灰霉病菌发育及致病过程的作用，有利于鉴定潜在的防治靶标，用于筛选 新型杀真菌药剂。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种控制致病性的基因及其编码的蛋白质。

本发明所提供的控制致病性基因来源于灰霉病菌，名称为BcCpo1，其DNA序列如SEQ IDNo:1所示。该DNA序列为BcCpo1基因开放阅读框，由1074个核苷酸组成，其中包含2 个外显子，分别位于SEQIDNo:1的5’端第1位至3位核苷酸之间和第58位至1074位核苷 酸之间，组成的编码区长度合计为1020个核苷酸。

本发明提供了BcCpo1基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQIDNo:2所示，该序列 由339个氨基酸组成。

来自灰霉病菌的控制致病性基因BcCpo1可应用于植物抗灰霉病基因工程领域。

对来自灰霉病菌的控制致病性基因BcCpo1所编码的蛋白质进行缺失、突变或修饰而使 其致病力发生缺陷，可作为靶标在设计和筛选抗真菌药剂中应用。

本发明证明了BcCpo1基因的缺失或突变，会导致灰霉病菌致病力显著降低，说明BcCpo1 基因是灰霉病菌引起农作物灰霉病所必需的基因。因此，筛选能够阻止该基因表达与其蛋白 质的表达、修饰及定位的化合物，可以有效控制灰霉病的发生，从而有助于开发新型杀菌剂， 即本发明所提供的BcCpo1基因的一个重要用途是：该基因的表达与其编码的蛋白质产物的 表达、修饰及定位，可以作为重要候选靶标位点，用于抗真菌药剂(特别是抗灰霉病菌药剂) 的设计和筛选。

附图说明

图1为BcCpo1蛋白质的结构域分析示意图

其中：CoproporphyrinogenIIIoxidase为粪卟啉原III氧化酶结构域；

图2为灰霉病菌BcCpo1基因的RNA干扰载体构建示意图

其中：pCpo1-Ri为干扰载体；PtrpC为构巢曲霉trpC基因的启动子；Cpo-f为BcCpo1基 因编码区的一个片段(长432bp)，按照正反两个方向先后插入两段；IT为一段内含子(长 130bp)；TtrpC为构巢曲霉trpC基因的终止子；

图3为BcCpo1基因干扰突变体中残存的BcCpo1蛋白质水平检测

其中：所用检测方法为westernblot。WT为野生型菌株B05.10，M1为BcCpo1基因干扰 突变体。所用一抗：Anti-Cpo1为人类Cpo1蛋白的一抗，Anti-Actin为酵母Actin蛋白的一抗， 用作内参；

图4为BcCpo1基因的RNA干扰突变体与野生型菌株的致病力比较照片

其中：所选择寄主为番茄，采用离体叶片接种菌饼的方法，接种3天后进行评价；

图5为BcCpo1基因的突变体与对照菌株侵染寄主所产生病斑大小的定量分析示意图

其中：接种方法同上，接种3天后对叶片病斑面积进行测量计算，换算成相对大小。** 表示在p<0.01水平上差异显著。

具体实施方式

为了更好地描述本发明，下面通过具体的实施例予以进一步的说明，下述实施例中的方 法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1BcCpo1基因的相关性分析

灰霉病菌BcCpo1基因的开放阅读框由1074个核苷酸组成，包含2个外显子，编码区 cDNA全长为1020个核苷酸，编码的蛋白质产物由339个氨基酸组成。取BcCpo1蛋白质序 列进行比对分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，发现Cpo1广泛存在于动物、植物、 真菌和细菌等细胞生物中。结构域分析发现，BcCpo1蛋白质包含一个保守的粪卟啉原III氧 化酶结构域(见图1)。

实施例2BcCpo1基因的RNA干扰

1)干扰载体的构建

采用引物Cpo1-Ri-F(5'-GGTACCCTCGAGCGGCAATTGACAAAAT-3')与Cpo1-Ri-R (5'-AGATCTAAGCTTTCAAACAACTTTGCGC-3')，以灰霉病菌菌株B05.10的基因组DNA 为模板扩增BcCpo1基因编码区432bp片段，反应体系为：10mmol/LdNTPMixture，0.5μL； 10×PCRbuffer，2.5μL；上下游引物各1μL(10μmol/mL)；模板DNA，1μL；Ex-Taq，0.2μL (5U)；ddH₂O，18.8μL；扩增程序为：94℃预变性3分钟，然后(1)94℃，变性30秒；(2) 58℃，退火30秒；(3)72℃，延伸30秒；(4)循环30次；(5)72℃延伸10分钟。将上述DNA 扩增产物按照相反方向先后克隆至pSilent1载体的XhoI、HindIII之间与KpnI、BglII之间； 然后用XbaI、EcoRI将整个干扰区域(从启动子至终止子)切割下来，亚克隆至用相同酶组 合线性化的pBHt2上，构建成干扰载体pCpo1-Ri(见图2)。

2)灰霉病菌的转化

a.农杆菌的培养

挑取含有双元载体pCpo1-Ri的根癌农杆菌菌株Agl-1单菌落，接种至含50μg/ml卡那霉素、 10μg/ml利福平的MM液体培养基(磷酸氢二钾0.205％，磷酸二氢钾0.145％，氯化钠0.015％， 七水硫酸镁0.05％，六水氯化钙0.01％，七水硫酸亚铁0.00025％，硫酸铵0.05％，葡萄糖 0.2％)中，250rpm、28℃振荡培养48h；4000rpm，离心5分钟，弃上清，IM液体培养基(磷 酸氢二钾0.205％，磷酸二氢钾0.145％，氯化钠0.015％，七水硫酸镁0.05％，六水氯化钙 0.01％，七水硫酸亚铁0.00025％，硫酸铵0.05％，葡萄糖0.2％，200μMAS，MES0.854％， 甘油0.5％)重悬，4000rpm离心5分钟，弃上清；IM培养基重悬，28℃，250rpm振荡培养6 h，进行预诱导。

b.灰霉病菌的产孢培养

选用B05.10菌株，取少量孢子涂布于PDA培养基(马铃薯20％煮烂过滤，葡萄糖2％， 琼脂1.5％)，置28℃培养8h令孢子快速萌发，然后转移至20℃培养3-5天，待菌体表面被 灰色孢子覆盖之后，用IM液体培养基刮取、收集孢子，显微镜观察，利用血球计数器调节 孢子浓度为1×10⁶/mL。

c.根癌农杆菌与灰霉病菌分生孢子共培养及转化子筛选

将在IM液体培养基中预先诱导6h的农杆菌菌液和灰霉病菌孢子液等体积混合，加入AS， 使终浓度达到500μM，混匀，然后按250～350μL/皿，均匀涂抹至铺有玻璃纸的IM培养基上， 22℃黑暗培养48h；共培养完毕后，将玻璃纸转移至含有100μg/mL潮霉素的PDA培养基上， 相同条件下继续培养。4～7天后挑取扩展的菌落到含有同样抗生素的筛选培养基上。

实施例3RNA干扰突变体中BcCpo1基因的表达水平检测

采用westernblot检测相关菌株中的BcCpo1蛋白水平。分别提取野生型与突变体菌株的 总蛋白，经SDS-PAGE电泳分离后，电转移至PVDF膜上，采用人类Cpo1蛋白的一抗进行 westernblot检测，用偶联有辣根过氧化物酶的二抗杂交后进行显色。采用酵母Actin蛋白的 一抗检测灰霉病菌相关菌株的Actin蛋白含量，作为内参。结果表明，在RNA干扰突变体中， BcCpo1蛋白的含量显著降低，其残存水平只能达到野生型菌株中的18％(见图3)。因此， BcCpo1的RNA干扰突变体可以进行后续研究，用于分析BcCpo1基因及其编码蛋白在灰霉 病菌致病中的作用。

实施例4BcCpo1基因在灰霉病菌致病性方面的作用

采用离体叶片接种法，评价BcCpo1干扰突变体的致病力变化情况。从温室培养的番茄 植株上采集成熟叶片，水平放置容器中，使用打孔器打取待测菌株菌饼，正面朝下反扣至叶 片上，20℃保湿黑暗培养，3天后评价待测菌株的致病力。实验结果显示，BcCpo1干扰突变 体基本丧失了致病能力，只能在接种点附近发现微小病斑，且不扩展。与此形成鲜明对照的 是，野生型可成功侵染番茄叶片，并迅速蔓延至大半个叶面(见图4)。对叶片病斑面积进行 测量计算，发现BcCpo1干扰突变体侵染引起的病斑面积只有野生型引起的20％左右(见图5)。 将上述发病叶片表面进行消毒，研磨后涂布至PDA平板上，培养2天后计数灰霉病菌菌落个 数。研究发现，BcCpo1干扰突变体侵染的叶片在接种三天后几乎没有活的菌体，而野生型侵 染的叶片研磨后可以获得近百个菌落。该研究结果表明，BcCpo1是一个关键的致病基因，是 灰霉病菌侵染寄主所必需的，如果该基因或其编码的蛋白质丧失活性，灰霉病菌将失去侵染 寄主引发病害的能力。