细胞毒性T细胞脱颗粒的流式细胞术检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种细胞毒性T细胞脱颗粒的流式细胞术检测方法。

背景技术

细胞毒性T细胞(CytotoxicT-lymphocyte，CTL细胞)又称杀伤性T细胞，能够特异性杀伤带抗原的靶细胞，如移植细胞、肿瘤细胞及受微生物感染的细胞等，与自然杀伤细胞(NaturalKillercell，NK细胞)构成机体抗病毒、抗肿瘤免疫的重要防线。

CTL细胞杀伤靶细胞最主要途径——细胞裂解性杀伤：与靶细胞接触后，可释放一系列细胞毒颗粒物质(脱颗粒)，从而导致靶细胞裂解。脱颗粒功能检测反映了CTL细胞杀伤活性，对于细胞毒功能学研究具有重要意义，是医学基础及临床研究中的一项重要工作。

传统的对CTL细胞脱颗粒的检测多采用荧光镜检查，其具有检测速度慢、精度较低、准确性较差等问题，使得检测结果不甚理想。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种细胞毒性T细胞脱颗粒的流式细胞术检测方法，所述的检测方法可解决现有技术检测速度慢、精度较低、准确性较差、检测结果容易受到检测者的主观因素影响等问题。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种细胞毒性T细胞脱颗粒的流式细胞术检测方法，包括：通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用激发细胞毒性T细胞脱颗粒，再用流式细胞术检测激发后与激发前细胞毒性T细胞中囊泡膜蛋白标志物CD107a的平均荧光强度的比值来评价细胞毒性T细胞的脱颗粒功能，若比值≥2.8提示脱颗粒功能正常。

细胞毒性T细胞(CytotoxicT-lymphocyte，CTL细胞)胞浆内含有高浓度以囊泡形式存在的细胞毒性颗粒。溶酶体相关膜蛋白1(CD107a)是囊泡膜蛋白的主要成分。CTL细胞和NK细胞杀伤靶细胞时，毒性颗粒将到达细胞膜并与细胞膜融合(此时CD107a分子会被转运到细胞膜表面)，引起颗粒内容物释放，最终导致靶细胞的死亡。因此，CDl07a分子是CTL细胞脱颗粒的一种敏感标志，与细胞毒活性直接相关，可反映细胞毒性细胞杀伤活性水平。此外，与颗粒胞吐有关的基因缺陷导致了CD107a转移到细胞表面的功能受损。通过检测CTL细胞表面表达的CD107a是鉴别是否存在颗粒胞吐功能缺陷的遗传性疾病的快速手段。

流式细胞术(FlowCytometry，FCM)是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数。通过自然杀伤作用或抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用激发CTL细胞脱颗粒后，再使用流式细胞术对其CD107a分子增加的幅度进行检测，可以快速、精度地评价CTL细胞的脱颗粒能力。

如上所述的检测方法，具体包括以下步骤：

1)、分离待检样本中的外周血单个核细胞及并计数调整细胞浓度；

2)、取细胞毒性T细胞天然靶细胞并计数调整细胞浓度；

3)、将步骤1)中的所述外周血单个核细胞和步骤2)中的所述细胞毒性T细胞天然靶细胞按体积比等比混合后平均分成两组，向其中一组中加入抗人CD3抗体作为实验组，另一组作为对照组；将两组孵育后离心并弃上清，得到沉淀；

4)、加入流式染色缓冲液重悬步骤3)中所述沉淀，同时加入抗CD3、CD8、CD107a的流式抗体并孵育；

5)、待孵育完成后离心，用流式染色缓冲液洗涤沉淀；

6)、洗涤后用流式染色缓冲液重悬混匀细胞并用流式细胞仪进行检测；

7)、统计CD3+CD8+D107a+的细胞中CD107a的平均荧光强度，并计算实验组与对照组的平均荧光强度的比值用以评价细胞毒性T细胞的脱颗粒功能，若比值≥2.8提示脱颗粒功能正常。

CD3(clusterofdifferentiation3，分化簇3)受体仅存在于T细胞表面，因而可用作T细胞的标志物；

CD8(clusterofdifferentiation8，分化簇8)受体表达于细胞毒性T细胞上，可作为细胞毒性T细胞的标志物；

CDl07a分子作为CTL细胞脱颗粒的敏感标志物。

步骤3)中加入的抗人CD3抗体选用购自4abio公司，目录号为FHF003-100的MouseantiHumanCD3MonoclonalAntibody,FITC或目录号为FHU003-100的Mouseanti-HumanCD3MonoclonalAntibody,Purified；

步骤4)中加入的三种抗体，CD3抗体(Anti-HumanCD3FITC100tests)购自eBioscience公司，目录号为11-0036-42，或采用购自4abio公司，目录号为FHF003-100的Mouseanti-HumanCD3MonoclonalAntibody,FITC；CD8抗体(PerCPanti-humanCD8)购自Biolegend公司，目录号为344708；CD107a抗体【Anti-HumanCD107a(LAMP-1)PE100tests】购自eBioscience公司，目录号为12-1079-42。

优选的，如上所述的检测方法，所述细胞毒性T细胞天然靶细胞为P815细胞。

P815细胞为肥大细胞瘤细胞，可通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)激发细胞毒性T细胞脱颗粒。

优选的，如上所述的检测方法，在步骤3)中，抗人CD3抗体的浓度为0.25～0.5μg/100μl。

优选的，如上所述的检测方法：

在步骤1)中，所述细胞浓度为1.8～2.2×10⁶/ml；

在步骤2)中，所述细胞浓度为1.8～2.2×10⁶/ml。

优选的，如上所述的检测方法，在步骤3)中，孵育条件为：

于37℃，5％CO₂培养箱中共孵育2.5～3.5h。

优选的，如上所述的检测方法，在步骤4)中，孵育条件为：

室温避光孵育15～25min。

优选的，如上所述的检测方法，所述流式染色缓冲液的配方为：

含有2.0％FBS和2.0mMEDTA的1×PBS溶液。

优选的，如上所述的检测方法，在步骤2)、步骤3)和步骤5)中，所述离心的转速均为1200～1600rpm，离心时间均为4～6min。

优选的，如上所述的检测方法：

在步骤4)中，CD3、CD8的抗体的浓度为0.45～1.0μg/100μl；CD107a的抗体浓度为0.06～0.125μg/100μl。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1)、本申请提供的细胞毒性T细胞脱颗粒的流式细胞术检测方法，检测快速，通量大，准确度高，且人为因素影响较小。

2)、通过对天然刺激物的选择、效靶细胞配比及孵育时间等关键技术细节进行优选限定，建立了稳定规范的技术流程。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为通过抗人CD3抗体及靶细胞P815激发的CTL细胞脱颗粒，进而通过流式细胞术进行检测的实验结果图；图A为激发前，图B为激发后。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

细胞毒性T细胞脱颗粒的流式细胞术检测方法，包括以下步骤：

S11、分离待检样本中的外周血单个核细胞及并计数调整细胞浓度；

S12、取细胞毒性T细胞天然靶细胞并计数调整细胞浓度；

S13、将步骤S11中的所述外周血单个核细胞和步骤S12中的所述细胞毒性T细胞天然靶细胞按体积比等比混合后平均分成两组，向其中一组中加入抗人CD3抗体作为实验组，另一组作为对照组；将两组孵育后离心并弃上清，得到沉淀；

S14、加入流式染色缓冲液重悬步骤S13中所述沉淀，同时加入抗CD3、CD8、D107a的流式抗体并孵育；

S15、待孵育完成后离心，用流式染色缓冲液洗涤沉淀；

S16、洗涤后用流式染色缓冲液重悬混匀细胞并用流式细胞仪进行检测；

S17、统计CD3+CD8+的细胞中CD107a的平均荧光强度，并计算实验组与对照组的平均荧光强度的比值用以评价细胞毒性T细胞的脱颗粒功能，若比值≥2.8提示脱颗粒功能正常。

实施例2

细胞毒性T细胞脱颗粒的流式细胞术检测方法，包括以下步骤：

S21、分离待检样本中的外周血单个核细胞及并计数调整细胞浓度至1.8×10⁶/ml；

S22、取细胞毒性T细胞天然靶细胞P815细胞并计数调整细胞浓度至1.8×10⁶/ml；

S23、将步骤S21中的所述外周血单个核细胞和步骤S22中的所述细胞毒性T细胞天然靶细胞按体积比等比混合后平均分成两组，向其中一组中加入抗人CD3抗体作为实验组(抗体的浓度为0.25μg/100μl)，另一组作为对照组；将两组于37℃，5％CO₂培养箱中孵育2.5h后1200rpm离心6min，弃上清，得到沉淀；

S24、加入流式染色缓冲液重悬步骤S23中所述沉淀，同时加入抗CD3、CD8、CD107a的流式抗体，室温避光孵育15min；CD3、CD8的抗体的浓度为0.45μg/100μl；CD107a的抗体浓度为0.06μg/100μl；

所述流式染色缓冲液配方为：含有2.0％FBS和2.0mMEDTA的1×PBS溶液；

S25、待孵育完成后1200rpm离心6min，用流式染色缓冲液洗涤沉淀；

S26、洗涤后用流式染色缓冲液重悬混匀细胞并用流式细胞仪进行检测；

S27、统计CD3+CD8+的细胞中CD107a的平均荧光强度，并计算实验组与对照组的平均荧光强度的比值用以评价细胞毒性T细胞的脱颗粒功能，若比值≥2.8提示脱颗粒功能正常。

实施例3

细胞毒性T细胞脱颗粒的流式细胞术检测方法，包括以下步骤：

S31、分离待检样本中的外周血单个核细胞及并计数调整细胞浓度至2.2×10⁶/ml；

S32、取细胞毒性T细胞天然靶细胞P815细胞并计数调整细胞浓度至2.2×10⁶/ml；

S33、将步骤S31中的所述外周血单个核细胞和步骤S32中的所述细胞毒性T细胞天然靶细胞按体积比等比混合后平均分成两组，向其中一组中加入抗人CD3抗体作为实验组(抗体的浓度为0.5μg/100μl)，另一组作为对照组；将两组于37℃，5％CO₂培养箱中孵育3.5h后1600rpm离心4min，弃上清，得到沉淀；

S34、加入流式染色缓冲液重悬步骤S33中所述沉淀，同时加入抗CD3、CD8、CD107a的流式抗体，室温避光孵育25min；CD3、CD8的抗体的浓度为1.0μg/100μl；CD107a的抗体浓度为0.125μg/100μl；

所述流式染色缓冲液配方为：含有2.0％FBS和2.0mMEDTA的1×PBS溶液；

S35、待孵育完成后1600rpm离心4min，用流式染色缓冲液洗涤沉淀；

S36、洗涤后用流式染色缓冲液重悬混匀细胞并用流式细胞仪进行检测；

S37、统计CD3+CD8+的细胞中CD107a的平均荧光强度，并计算实验组与对照组的平均荧光强度的比值用以评价细胞毒性T细胞的脱颗粒功能，若比值≥2.8提示脱颗粒功能正常。

实施例4

细胞毒性T细胞脱颗粒的流式细胞术检测方法，包括以下步骤：

S41、分离待检样本中的外周血单个核细胞及并计数调整细胞浓度至2.0×10⁶/ml；

S42、取细胞毒性T细胞天然靶细胞P815细胞并计数调整细胞浓度至2.0×10⁶/ml；

S43、将步骤S41中的所述外周血单个核细胞和步骤S42中的所述细胞毒性T细胞天然靶细胞按体积比等比混合后平均分成两组，向其中一组中加入抗人CD3抗体作为实验组(抗体的浓度为0.5μg/100μl)，另一组作为对照组；将两组于37℃，5％CO₂培养箱中孵育3h后1400rpm离心5min，弃上清，得到沉淀；

S44、加入流式染色缓冲液重悬步骤S43中所述沉淀，同时加入抗CD3、CD8、CD107a的流式抗体，室温避光孵育20min；CD3、CD8的抗体的浓度为0.50μg/100μl；CD107a的抗体浓度为0.0625μg/100μl；

所述流式染色缓冲液配方为：含有2.0％FBS和2.0mMEDTA的1×PBS溶液；

S45、待孵育完成后1400rpm离心5min，用流式染色缓冲液洗涤沉淀；

S46、洗涤后用流式染色缓冲液重悬混匀细胞并用流式细胞仪进行检测；

S47、统计CD3+CD8+的细胞中CD107a的平均荧光强度，并计算实验组与对照组的平均荧光强度的比值用以评价细胞毒性T细胞的脱颗粒功能，若比值≥2.8提示脱颗粒功能正常。

实施例5

细胞毒性T细胞脱颗粒的流式细胞术检测方法，包括以下步骤：

S51、EDTA或肝素钠抗凝静脉全血2ml，Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PeripheralBloodMononuclearCell，PBMC)，并计数，调整细胞浓度为2.0×10⁶/ml悬液备用；

S52、取细胞毒性T细胞天然靶细胞P815细胞并计数调整细胞浓度至2.2×10⁶/ml，悬液备用；

S53、按照效靶细胞混合体积比PBMC:P815＝1:1的比例，取P815细胞100μl和PBMC100μl，混合重悬，终体积为200μl；加入抗人CD3抗体(抗体浓度为0.25μg/100μl)于细胞混悬液中作为实验组，同时设置PBMC细胞加P815细胞但无抗CD3抗体作为对照组；

将两组于37℃，5％CO₂培养箱中孵育3.5h后1400rpm离心5min，弃上清，得到沉淀；

S54、加入100μl流式染色缓冲液(PBS添加2.0％FBS和2.0mMEDTA)重悬步骤S53中所述沉淀，同时加入抗CD3、CD8、CD107a的流式抗体，室温避光孵育20min；CD3、CD8的抗体的浓度为0.50μg/100μl；CD107a的抗体浓度为0.0625μg/100μl；

S55、待孵育完成后1400rpm离心5min，用1ml流式染色缓冲液洗涤沉淀；

S56、洗涤后用100μl流式染色缓冲液重悬混匀细胞并用流式细胞仪进行检测；

S57、统计CD3+CD8+的细胞中CD107a的平均荧光强度(meanfluorescenceintensity，MFI)，实验结果如图1所示；计算实验组与对照组的平均荧光强度的比值用以评价细胞毒性T细胞的脱颗粒功能。

表1实施例5检测结果

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。