一种海南黄花梨和越南黄花梨的分子鉴定方法和鉴定引物

技术领域

本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种海南黄花梨和越南黄花梨的分子鉴定方法 和鉴定引物。

背景技术

海南黄花梨，又名降香黄檀(DalbergiaordoriferaT.Chen)是豆科黄檀属(DalbergiaL.) 植物，为高大乔木，特产我国海南，是众所周知的最为名贵的红木种类，目前市场上每公斤 海南黄花梨木材的销售价格已经超过1万元人民币。海南黄花梨高昂的市场价格所造成的巨 大利益驱动，导致市场上大量出现走私售假的不法行为。我们通过走访红木市场和商家企业 发现，目前市场上超过90％的海南黄花梨均产于越南、价格不到海南黄花梨一半的越南黄花 梨(又名越南黄檀DalbergiatonkinensisPrain)走私到我国并冒充海南黄花梨。假冒现象如此 普遍的原因则在于，传统的木材解剖等鉴定手段原则上只能鉴定到大类，不可能鉴定到具体 的物种。例如，对于一个样品，利用传统的木材鉴定方法，可将其鉴定为黄檀类或香枝木类 木材，而不可能准确鉴定为海南黄花梨或越南黄花梨。

生物的DNA含有大量的遗传密码信息，这些遗传密码信息可以用于物种之间甚至同一 个物种不同个体之间的鉴定，广为人知的人类亲子鉴定便是其中一例。对于木材的鉴定，传 统的木材鉴定方法，包括木材解剖、物理和化学指标检测，都只能鉴定到大类，即属于某一 类型的木材，而不可能准确鉴定到具体的原生树种。相比而言，针对性地开发特殊的植物质 体DNA测序引物，测得目标物种特异的DNA序列，通过和标准样品进行DNA比对，能够 更准确地进行木材样品的原生树种鉴定。这是因为(1)质体DNA为植物所特有，在进行DNA 序列测序和比对分析的时候方便排除木材中附带的木材内生真菌DNA的影响；(2)质体DNA 在植物中的含量远远高于核DNA，对一些保存状况不甚理想的木材样品，也方便获得足够的 DNA进行样品分析；(3)植物质体DNA为环状结构，其中的每个基因仅有一个拷贝，避免 了核基因多个拷贝的存在而产生的假阳性现象。

因此，如能开发一种利用海南黄花梨与越南黄花梨质体DNA序列的差异而对二者进行 准确鉴定方法将能弥补传统鉴定方法的不足，提供一种有效的鉴定手段。

发明内容

本发明的目的是针对传统木材鉴定方法不能准确鉴定区分海南黄花梨和越南黄花梨的不 足，提供一种基于质体基因rpoC2和petD序列差异的海南黄花梨和越南黄花梨的分子鉴定方 法和鉴定引物。

本发明的海南黄花梨和越南黄花梨的分子鉴定方法，包括以下步骤：

a、对待鉴定样品进行总DNA提取；

b、PCR扩增：以步骤a提取的总DNA为模板，分别用rpoC2序列的正/反向引物和petD序 列的正/反向引物进行PCR扩增，分别得到扩增产物；所述的rpoC2序列的正向引物的碱 基序列如SEQIDNO.5所示，所述的rpoC2序列的反向引物的碱基序列如SEQIDNO.6 所示，所述的petD序列的正向引物的碱基序列如SEQIDNO.7所示，所述的petD序列的 反向引物的碱基序列如SEQIDNO.8所示；

c、序列比对：将扩增产物测序，然后将测序的rpoC2序列与SEQIDNO.1和SEQIDNO.3 进行比对，将测序的petD序列与SEQIDNO.2和SEQIDNO.4进行比对；如果rpoC2序 列与SEQIDNO.1一致、petD序列与SEQIDNO.2一致，则该待鉴定样品为海南黄花梨； 如果rpoC2序列与SEQIDNO.3一致、petD序列与SEQIDNO.4一致，则该待鉴定样品 为越南黄花梨。

优选，所述的步骤a的对待鉴定样品进行总DNA提取后，还用PEG试剂对总DNA进 行纯化并使DNA终浓度为50-200ng/μl。

优选，所述的步骤b的PCR扩增的反应体系为：含有Buffer(Mg²⁺plus)5 μl、dNTPMixture(2.5mM)2μl、正向引物(10μM)0.5μl、反向引物(10μM)0.5μl、总 DNA模板1μl和HSDNAPolymerase(2.5U/μl)0.25μl，其余由灭菌蒸馏水补 足至25μl；反应条件为：95℃3min；94℃30s，50-52℃30s，72℃1min，35个循环；72℃ 10min。

本发明还提供了海南黄花梨和越南黄花梨的鉴定引物，所述的鉴定引物包括rpoC2序列 的正/反向引物和petD序列的正/反向引物，所述的rpoC2序列的正向引物的碱基序列如SEQ IDNO.5所示，所述的rpoC2序列的反向引物的碱基序列如SEQIDNO.6所示，所述的petD 序列的正向引物的碱基序列如SEQIDNO.7所示，所述的petD序列的反向引物的碱基序列如 SEQIDNO.8所示。

本发明首次对海南黄花梨和越南黄花梨的两个质体基因rpoC2和petD进行了测序分析， 发现质体基因rpoC2和petD均在海南黄花梨和越南黄花梨之间存在显著差异。利用这种特性， 用rpoC2的正/反向引物和petD的正/反向引物分别对未知黄檀类或香枝木类木材样品的总 DNA进行PCR扩增，然后对扩增产物进行测序，将扩增到的未知样品的rpoC2序列与海南 黄花梨和越南黄花梨标准样品的rpoC2序列比对，扩增到的未知样品的petD序列与海南黄花 梨和越南黄花梨标准样品的petD序列比对，根据比对的序列一致性结果即可判断该未知样品 是海南黄花梨还是越南黄花梨。

对于DNA未降解的木材样品，本发明的方法可在10个工作日内获得其质体基因rpoC2 和petD序列，通过与标准样品进行比较，可有效鉴别待鉴定样品与海南黄花梨和越南黄花梨 标准样品的DNA相似性的支持率达到99％以上。首次解决了依靠传统木材解剖手段无法鉴 别海南黄花梨和越南黄花梨的难题，为木材市场、商家、消费者、公安机关、海关和科研机 构提供一种高效可靠的海南黄花梨和越南黄花梨鉴别方法，具有很强的应用价值。本发明的 方法还可在建立标准样品DNA信息库的基础上，用于鉴定豆科其他重要近缘经济植物原生 种类，例如观赏植物羊蹄甲属、粮油植物大豆属等。

附图说明

图1是海南黄花梨和越南黄花梨的rpoC2序列比对结果，Do-rpoC2表示海南黄花梨 (DalbergiaordoriferaT.Chen)的rpoC2序列，Dt-rpoC2表示越南黄花梨(Dalbergiatonkinensis Prain)的rpoC2序列。

图2是海南黄花梨和越南黄花梨的petD序列比对结果，Do-petD表示海南黄花梨 (DalbergiaordoriferaT.Chen)的petD序列，Dt-petD表示越南黄花梨(Dalbergiatonkinensis Prain)的petD序列。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

以下实施例中海南黄花梨或越南黄花梨木材样品的总DNA提取、纯化，PCR扩增和PCR 产物纯化步骤如下：

1、总DNA提取

(1)利用锯片将2g样品锯成碎末，装入2ml离心管，加入适量的液氮，在自动研磨机 中充分研磨成粉末状。

(2)将研磨成粉末状的样品置于50ml离心管中，采用CTAB法提取总DNA。

(3)每管加入CTAB16ml，β-巯基乙醇320μl，蛋白酶K20μl，65℃水浴12-24h。

(4)水浴结束后取出离心管，冷却至室温。

(5)加入13ml氯仿/异戊醇(体积比为24:1)，颠倒混匀后，置于-20℃冷冻处理5～10min。

(6)将离心管置于冷冻离心机上4℃、12000rpm离心15min。

(7)将离心后的上清液转移至新的50ml离心管中，重复步骤(5)、(6)。

(8)加入与上清液等体积的异丙醇，置于-20℃，冷冻处理12-24h。

(9)将离心管置于冷冻离心机上4℃、10000rpm离心10min，弃上清液。

(10)3ml体积分数70％乙醇清洗DNA沉淀，并转入2ml离心管(分2管)，4℃、10000rpm 离心10min，弃上清液，再加入体积分数70％乙醇重复清洗一次。

(11)将离心管置于真空干燥机中，50℃干燥5min，得到总DNA，加入80～120μlTE缓 冲液溶解DNA。4℃或-20℃保存。

2、总DNA纯化

(1)将还未纯化的总DNA转入1.5ml离心管中，加入等体积的PEG试剂(该PEG试 剂的浓度为质量分数20％，PEG分子量为8000)混匀。

(2)将离心管置于水浴锅中37℃处理15min。

(3)12000rpm离心5min，弃上清液。

(4)重复步骤(1)～(3)两次。

(5)加入100μl预冷的80％乙醇，混匀。12000rpm离心15min，去上清液。

(6)重复步骤(5)。

(7)将离心管置于真空干燥机中，50℃干燥5min，加入5μl纯水溶解DNA。使用 NanoDrop2000检测纯化后的DNA浓度，如果浓度低于50ng/μl，则不需再加纯水稀释DNA； 如果浓度高于200ng/μl，则加纯水稀释至200ng/μl。

3、总DNA的PCR扩增

选用大连宝生物公司(Takara)的高保真性PCR聚合酶HSDNAPolymerase， 以纯化后的总DNA为模板DNA、以单个目标基因(rpoC2或petD)的正/反向引物进行PCR 扩增。

(1)PCR反应体系如表1所示：

表1PCR反应体系

所述的扩增rpoC2的引物对为：rpoC2-Tu1F/rpoC2-Tu1R，包括正向引物rpoC2-Tu1F为： 5’-GAAGGTCATGCAGGTGGAGT-3’；反向引物rpoC2-Tu1R为：5’-CCAAAGTCGTGTGGG AAAAAGT-3’；所述的扩增petD的引物对为：petD-Tu1F/petD-Tu1R，包括正向引物petD-Tu 1：5’-TCCTTTGTATGTAAAAAGTCCCGA-3’；反向引物petD-Tu1R：5’-ATCCGGCTCGAGC AAGAATC-3’。

(2)PCR反应条件设置

PCR扩增在东胜龙PCR仪上进行，PCR程序为：95℃3分钟；94℃30秒，50-52℃30 秒，72℃1分钟，35个循环；72℃延伸10分钟，最后保持4℃。由此得到PCR产物。

4、PCR产物纯化与测序

取PCR产物进行凝胶电泳检测，将有目标条带的PCR产物样品按照前述的总DNA纯化 步骤进行纯化。纯化后样品送测序公司进行Sanger测序，在ABI3700测序仪上，测序引物用 对应基因的PCR反应的正/反向引物，对PCR产物进行双向测序。

实施例1：海南黄花梨和越南黄花梨标准样品rpoC序列和petD序列的确定

本发明前期在华南植物园科研区以及海南的多个不同地点采集了5个有花或果、可进行 植物学鉴定的海南黄花梨样品，在越南河内的多个不同地点采集了5个有花或果、可进行植 物学鉴定的越南黄花梨样品。对上述的采集鉴定好的样品按所述的方法提取总DNA、纯化， 得到各样品的可以用于PCR扩增的总DNA。选取两个质体DNA片段：rpoC2和petD作为 目标基因。设计用于扩增质体基因rpoC2的正/反向引物rpoC2-Tu1F/rpoC2-Tu1R，其序列分 别为：5’-GAAGGTCATGCAGGTGGAGT-3’/5’-CCAAAGTCGTGTGGGAAAAAGT-3’(SEQ IDNO.5/SEQIDNO.6)；设计用于扩增质体基因petD的正/反向引物petD-Tu1F/petD-Tu1R， 其序列分别为：5’-TCCTTTGTATGTAAAAAGTCCCGA-3’/5’-ATCCGGCTCGAGCAAGAAT C-3’(SEQIDNO.7/SEQIDNO.8)。将rpoC2的正/反向引物或petD的正/反向引物分别以 各样品的纯化后的总DNA为模板DNA，按前述的PCR扩增体系和反应条件进行PCR扩增， 将有目标条带的PCR产物纯化后进行测序。分析测序结果发现，同一个种内的rpoC2序列之 间或petD序列之间是完全一致的；但海南黄花梨与越南黄花梨的rpoC2序列之间存在显著差 异，海南黄花梨与越南黄花梨的petD序列之间也存在显著差异，即这种差异在海南黄花梨和 越南黄花梨之间是稳定存在的，可以依据这两个种rpoC2序列、petD序列的差异明显的区分 样品是海南黄花梨还是越南黄花梨。

为了简便描述，根据植物学特征和序列特征，每个种从上述测序的样品中选取一个标准 样品；海南黄花梨标准样品取自华南植物园科研区的有花或果、可进行植物学鉴定的活体植 株，凭证标本存于中国科学院华南植物园标本馆(IBSC)，标本号为：TUTY1063；越南黄花 梨标准样品取自越南河内的有花或果、可进行植物学鉴定的活体植株，凭证标本存于中国科 学院华南植物园标本馆(IBSC)，标本号为：TUTY2592。

扩增得到的海南黄花梨标准样品的rpoC2序列如SEQIDNO.1所示，长273bp；越南黄 花梨标准样品的rpoC2序列如SEQIDNO.3所示，长276bp；海南黄花梨标准样品的petD序 列如SEQIDNO.2所示，长279bp；越南黄花梨标准样品的petD的序列如SEQIDNO.4所示， 长285bp。

序列比对发现，越南黄花梨标准样品的rpoC2序列比海南黄花梨标准样品的rpoC2序列 在第179-180位之间插入了一个AAA的重复，而且海南黄花梨标准样品的rpoC2序列的第 209位的碱基T在越南黄花梨标准样品的rpoC2序列中对应突变为第212位的碱基A(图1)。 越南黄花梨标准样品的petD的序列比海南黄花梨标准样品的petD序列在第157-158位之间 插入了一个ATAGTT的重复(图2)。

利用海南黄花梨和越南黄花梨之间的这种差异，对于未知(海南黄花梨或越南黄花梨) 样品，只需扩增出该样品的rpoC2序列和petD序列然后测序，然后将测序结果分别与海南黄 花梨标准样品或越南黄花梨标准样品的rpoC2序列和petD序列进行DNA比对，若比对得到 该样品的rpoC2序列与SEQIDNO.1一致，petD序列与SEQIDNO.2一致，则说明该样品为 海南黄花梨；若比对得到该样品的rpoC2序列与SEQIDNO.3一致，petD序列与SEQIDNO.4 一致，则说明该样品为越南黄花梨。

实施例2：鉴定未知样品1

于广州鱼珠木材市场购得木材样品一份，样品编号TuTY1258，商家称该样品为海南黄 花梨，通过测量，该样品材色为深黄色，气干密度为0.89g/cm³，木材解剖学观察表明该木材 样品具有香枝木类木材特征，然而木材解剖特征不能区别该样品为海南黄花梨还是越南黄花 梨。因此，我们采用比较质体基因rpoC2和petD序列的方法进行鉴定。具体实施步骤如下：

先按上述方法提取并纯化该未知木材样品总DNA，然后分别用rpoC2的正/反向引物rpo C2-Tu1F/rpoC2-Tu1R：5’-GAAGGTCATGCAGGTGGAGT-3’/5’-CCAAAGTCGTGTGGGAAA AAGT-3’和petD的正/反向引物petD-Tu1F/petD-Tu1R：5’-TCCTTTGTATGTAAAAAGTCCCG A-3’/5’-ATCCGGCTCGAGCAAGAATC-3’按上述PCR反应体系和条件进行扩增，将有目标 条带的PCR产物纯化后进行测序，将测得序列结果分别与海南黄花梨标准样品的rpoC2序列 (即SEQIDNO.1)和petD序列(即SEQIDNO.2)以及越南黄花梨标准样品的rpoC2序 列(即SEQIDNO.3)和petD(即SEQIDNO.4)序列进行比对，结果表明该未知木材rp oC2和petD序列分别与海南黄花梨标准样品rpoC2和petD序列一致的支持率小于1％，而分 别与越南黄花梨标准样品rpoC2和petD序列一致的支持率大于99％。由此，精确地鉴定了 所检测的未知木材样品为越南黄花梨。

实施例3：鉴定未知样品2

于福建购得木材样品一份，样品编号TuTY1259，商家称该样品为海南黄花梨，通过测 量，该样品材色为淡黄色，气干密度为0.92g/cm³，木材解剖学观察表明该木材样品具有香枝 木类木材特征，然而木材解剖特征不能区别该样品为海南黄花梨还是越南黄花梨。因此，我 们采用比较质体基因rpoC2和petD序列的方法进行鉴定。具体实施步骤如下：

先按上述方法提取并纯化该未知木材样品总DNA，然后分别用rpoC2的正/反向引物rpo C2-Tu1F/rpoC2-Tu1R：5’-GAAGGTCATGCAGGTGGAGT-3’/5’-CCAAAGTCGTGTGGGAAA AAGT-3’和petD的正/反向引物petD-Tu1F/petD-Tu1R：5’-TCCTTTGTATGTAAAAAGTCCCG A-3’/5’-ATCCGGCTCGAGCAAGAATC-3’按上述PCR反应体系和条件进行扩增，将有目标 条带的PCR产物纯化后进行测序，将测得序列结果分别与海南黄花梨标准样品的rpoC2序列 (即SEQIDNO.1)和petD序列(即SEQIDNO.2)以及越南黄花梨标准样品的rpoC2序 列(即SEQIDNO.3)和petD(即SEQIDNO.4)序列进行比对，测序结果表明该未知木 材rpoC2和petD序列分别与越南黄花梨标准样品rpoC和petD序列一致的支持率小于1％， 而与海南黄花梨标准样品rpoC2和petD序列一致的支持率大于99％。由此，精确地鉴定了 所检测的未知木材样品为海南黄花梨。