灰飞虱抗药性基因CYP6AY3v2、降低灰飞虱抗药性的基因片段及其应用

技术领域

本发明涉及一种灰飞虱抗药性基因CYP6AY3v2、降低灰飞虱抗药性的基因片段及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

据申请人所知，灰飞虱Laodelphax striatellus(Fallén)属于半翅目，飞虱科，主要分布于从菲律宾至西伯利亚一带的亚洲稻区、以及欧洲的温带和亚热带地区。在我国，灰飞虱分布遍及各省市，以长江流域和华北稻区发生较多。灰飞虱是一种多食性的昆虫，它能够取食水稻、小麦、玉米等多种禾本科植物。灰飞虱除了利用本身的刺吸式口器吮吸寄主植物汁液外，主要危害形式是传播植物病毒病，如条纹叶枯病、黑条矮缩病及玉米粗缩病等。一般情况下，灰飞虱通过刺吸汁液伤害作物带来的损失所占比例较小，灰飞虱最重要的危害形式是种群暴发促进植物病毒病的流行。2004年在江淮地区，特别是江苏省苏北地区，灰飞虱种群暴发引起水稻条纹叶枯病流行，危害水稻面积达157万公顷，致使80％的水稻产区受害，减产30％-40％。2007年以来，灰飞虱在江苏、安徽、浙江、河南等地造成水稻黑条矮缩病暴发，酿成巨大经济损失。因此，如何通过减少灰飞虱的暴发来增加水稻产量，是目前人类需迫切解决的问题。

目前主要以化学农药来防治灰飞虱，已造成灰飞虱对常用各类杀虫剂产生了不同水平的抗性，而导致其频繁暴发。20世纪70年代有机氯杀虫剂由于环境污染、高毒性和高抗性被禁止用于防治稻飞虱。80至90年代部分有机磷杀虫剂和氨基甲酸酯类杀虫剂被应用于稻田，但效果一般、环境相容性差、选择性差。与此同时，作用机制新颖的噻嗪酮、氟虫腈和吡虫啉被相继引入稻田使用，却造成灰飞虱对噻嗪酮和吡虫啉产生极高水平的抗性，而氟虫腈因对水生生物高毒性于2009年被禁用。抗性监测表明，灰飞虱对现阶段使用的噻虫嗪、烯啶虫胺、毒死蜱、吡蚜酮和拟除虫菊酯类杀虫剂产生了从低到高水平的抗性及敏感性下降的趋势。鉴于灰飞虱抗药性发生的日益严重，因此亟需通过对灰飞虱进行抗药性监测和抗药性形成机制的研究，开发出治理技术和策略，实现灰飞虱的可持续防治。

抗药性监测是抗药性研究中的重要组成部分，建立科学、简便易行的抗性监测方法是科学开展抗药性研究工作的前提条件。目前灰飞虱抗药性监测常采用稻苗浸渍法、稻茎浸渍法和点滴法，反映药剂对灰飞虱的毒力，从而确定灰飞虱对药剂的抗性表现，但这种活体生物测定技术的灵敏度较低，很难对灰飞虱田间低频率的抗药性发生进行预测。因此，随着对灰飞虱抗药性分子机制的深入研究，灰飞虱高灵敏度的抗性分子检测技术应随之建立。

灰飞虱抗药性分子检测技术应是基于对灰飞虱抗药性分子机制的研究建立起来。目前灰飞虱对稻田常用杀虫剂的抗药性主要涉及代谢抗性和靶标抗性，代谢抗性主要是通过解毒代谢酶基因扩增或过量表达，导致解毒代谢活性显著升高，解毒代谢能力增强而对杀虫剂形成抗性。靶标抗性是由于体内杀虫剂的靶标构象发生变化，导致杀虫剂与靶标结合力下降，不能有效地杀死害虫，从而使害虫产生对杀虫剂的抗性。

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是广泛存在于动物、植物和微生物中的普遍现象，可以作为防御的机制来抵抗体内非正常的核酸。RNA干扰主要是由后转录调控和双链RNA(dsRNA)引起的，压制靶标基因的表达。最近几年，RNAi技术已成为研究基因功能和害虫治理的一种有利用价值的工具。在实际的应用中，通过导入需要沉默的基因的双链RNA(dsRNA)来特异性降解细胞内mRNA，压制靶基因的表达，产生功能表型缺失。目前RNAi可以沉默抗性相关基因，提高昆虫对杀虫剂的敏感性。因此，RNAi为昆虫抗性治理提供了理论依据和技术指导，明确了抗性机制，通过转基因技术可以从实验室向田间实现对害虫抗性的控制，有望从根本上解决这一问题。

经检索发现，专利号为201110122777.1、授权公告号为CN102220339B、名称为《灰飞虱致死基因片段》的中国发明专利，利用RNAi技术沉默Ribosomal protein L9-B基因，对灰飞虱具有明显的致死效果；应用时，先合成Ribosomal protein L9-B基因dsRNA，再通过喂食使灰飞虱死亡。

专利号为201410041114.0、授权公告号为CN103820461B、名称为《一种褐飞虱基因Nl 19243及其编码产物与应用》的中国发明专利，基于RNAi技术，沉默褐飞虱的Nl 19243基因，进而使其死亡；应用时将褐飞虱基因Nl 19243转化入水稻体内，使该转基因水稻表达Nl 19243基因的dsRNA片段，从而对褐飞虱具有极好的抗虫效果。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：克服现有技术存在的问题，提供一种灰飞虱抗药性基因CYP6AY3v2，利用该基因可获得降低灰飞虱抗药性的基因片段(即dsRNA)，并进行喂食RNAi，进而降低灰飞虱抗药性。

本发明解决其技术问题的技术方案如下：

一种灰飞虱抗药性基因CYP6AY3v2，其特征是，该基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

该基因的核苷酸序列长度为1963bp，其中，开放阅读框为从5′端第239位到第1744位碱基，编码区长度为1506bp；5′端UTR区从第1位到第238位碱基，3′端UTR区从1745位到1963位碱基。该基因的等电点是6.9，分子重量是57.69kDa。

本发明还提供：

由前文所述灰飞虱抗药性基因CYP6AY3v2编码的多肽，其特征是，该多肽的序列如SEQ ID NO.2所示。

该多肽由502个氨基酸残基组成，其中，有21个氨基酸的信号肽序列，起着转膜锚定作用，切点位于Ala21/Thr22之间；包含P450家族保守的区域特征，例如oxygen bindingmotif(螺旋I)([A/G]GX[E/D]T[T/S])，K螺旋motif(EXXRXXP)，血红素结合区(PFXXGXXXCXG)以及sequence motif(PXXFXP)；包含六个不同底物识别位点(SRS)。

本发明还提供：

一种降低灰飞虱抗药性的基因片段，其特征是，该基因片段的序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供：

前文所述降低灰飞虱抗药性的基因片段的合成方法，其特征是，包括以下步骤：

第一步、从灰飞虱材料中提取灰飞虱总RNA；所述灰飞虱材料至少包括灰飞虱卵、灰飞虱若虫、灰飞虱成虫之一；

第二步、先以灰飞虱总RNA为模板，反转录合成cDNA第一链；再以PCR合成灰飞虱cDNA模板；

第三步、采用引物ds-F和引物ds-R、以及灰飞虱cDNA模板进行PCR扩增，获得dsRNA模板并进行纯化；其中，所述引物ds-F的序列为5′端加有T7启动子序列的SEQ ID NO.5所示序列，所述引物ds-R的序列为5′端加有T7启动子序列的SEQ ID NO.6所示序列，所述T7启动子序列如SEQ ID NO.7所示；

第四步、采用纯化后的dsRNA模板，体外合成dsRNA并保存备用；所得dsRNA即为目标基因片段。

该合成方法进一步完善的技术方案如下：

优选地，第一步的具体过程为：

采用总RNA提取试剂盒从灰飞虱材料中提取灰飞虱总RNA；以琼脂糖凝胶电泳纯化灰飞虱总RNA；以核酸蛋白定量仪检测灰飞虱总RNA的浓度以及吸光度值；将灰飞虱总RNA冻存；

第二步的具体过程为：

以灰飞虱总RNA为模板，采用反转录试剂盒合成cDNA第一链；然后，采用cDNA第一链，于PCR仪中合成灰飞虱cDNA模板，具体合成条件为：37℃15min，85℃5s，12℃保持；所得灰飞虱cDNA模板冻存；

第三步的具体过程为：

采用引物ds-F和引物ds-R、以及灰飞虱cDNA模板进行PCR扩增，并获得dsRNA模板，扩增时的PCR反应条件为：94℃3min，94℃30s、68℃30s以及72℃1min 10个循环，94℃30s以及72℃1min 28个循环，72℃10min，12℃保持；电泳纯化所得dsRNA模板，并以回收试剂盒进行纯化后保存；

第四步的具体过程为：

采用纯化后的dsRNA模板，以试剂盒体外合成dsRNA，并以2～5倍反应体系的无核酸酶水溶解所得dsRNA，然后冻存备用。

更优选地，第一步中，冻存灰飞虱总RNA的温度为-80℃以下；第二步中，冻存灰飞虱cDNA模板的温度为-20℃±5℃；第三步中，纯化后保存dsRNA模板的温度为0℃-4℃或-20℃±5℃；第四步中，冻存dsRNA的温度为-80℃以下。

本发明还提供：

一种前文所述的合成方法中所用引物，其特征是，包括引物ds-F和引物ds-R，所述引物ds-F的序列为5′端加有T7启动子序列的SEQ ID NO.5所示序列，所述引物ds-R的序列为5′端加有T7启动子序列的SEQ ID NO.6所示序列，所述T7启动子序列如SEQ IDNO.7所示。

本发明还提供：

一种前文所述灰飞虱抗药性基因CYP6AY3v2的用途，其特征是，该用途为用于合成前文所述降低灰飞虱抗药性的基因片段。

本发明还提供：

一种前文所述降低灰飞虱抗药性的基因片段的用途，其特征是，该用途为用于降低灰飞虱抗药性。

该用途进一步完善的技术方案如下：

优选地，该用途为降低灰飞虱针对毒死蜱和/或溴氰菊酯的抗药性。

发明人经反复地深入实践研究发现，灰飞虱细胞色素P450基因中的基因CYP6AY3v2是导致灰飞虱具有抗药性的关键基因，一方面，通过检测基因CYP6AY3v2和/或其编码的多肽，可检测灰飞虱的抗药性，另一方面，通过以基因CYP6AY3v2为模板最终体外合成dsRNA，并进行喂食RNAi，可有效降低灰飞虱的抗药性，实现对灰飞虱的抗药性治理。

附图说明

图1是实施例1中灰飞虱CYP6AY3v2基因CDS全长电泳图，图中，1-2泳道为灰飞虱PCR电泳结果；M为DL2000 Marker。

图2是实施例2中灰飞虱毒死蜱和溴氰菊酯抗性和敏感品系中CYP6AY3v2基因半定量电泳图，图中A是毒死蜱品系，B是溴氰菊酯品系。

图3是实施例3中灰飞虱毒死蜱和溴氰菊酯抗性和敏感品系中CYP6AY3v2基因荧光定量分析，图中A是毒死蜱品系，B是溴氰菊酯品系。

图4是实施例4中灰飞虱毒死蜱和溴氰菊酯抗性和敏感品系中CYP6AY3v2基因相对拷贝分析，图中A是毒死蜱品系，B是溴氰菊酯品系。

图5是实施例5中灰飞虱的含有T7启动子的抗药性基因CYP6AY3v2序列。

图6是实施例5中灰飞虱的含有T7启动子的绿色荧光蛋白基因GFP序列。

图7是实施例5中灰飞虱抗药性基因CYP6AY3v2体外合成的dsRNA、以及绿色荧光蛋白基因GFP体外合成的dsGFP的电泳图。

图8是实施例6中喂食灰飞虱dsRNA后其基因表达量变化，图中A是毒死蜱品系，B是溴氰菊酯品系。

图9是实施例6中灰飞虱毒死蜱抗性基因CYP6AY3v2沉默后毒死蜱抗性的毒理分析，A是100ng/头浓度处理毒死蜱抗性品系，B是50ng/头浓度处理毒死蜱抗性品系，C是26ng/头浓度处理毒死蜱抗性品系。

图10是实施例6中灰飞虱溴氰菊酯抗性基因CYP6AY3v2沉默后溴氰菊酯抗性的毒理分析，A是48ng/头浓度处理溴氰菊酯抗性品系，B是24ng/头浓度处理溴氰菊酯抗性品系，C是12ng/头浓度处理溴氰菊酯抗性品系。

图11至图14分别为灰飞虱细胞色素P450基因家族引物的核苷酸序列。

具体实施方式

一、本发明的主要研究过程：

本发明利用深圳华大基因研究院测序得到的灰飞虱细胞色素P450转录组数据，通过NCBI-nr数据库同源性比对，得到转录组注释信息，P450的家族姓名由Dr.D.R.Nelson分配(University of Tennessee,Memphis,TN)。利用RT-PCR技术对细胞色素P450基因家族进行分子克隆和鉴定，在PCR扩增步骤中，细胞色素P450基因家族引物的核苷酸序列如图11至图14所示。

本发明利用RT-PCR方法，克隆鉴定灰飞虱的细胞色素P450基因。80条灰飞虱P450注释的转录本从灰飞虱的转录组数据中得到，这些转录本与NCBI的蛋白数据库比对具有相似性，并且暂时性地命名为P1-P80。

其中71条序列证实在灰飞虱中确实表达。使用NCBI BLASTX程序分析显示，这71条P450的序列与其他的昆虫种有高度的相似性。根据标准的细胞色素P450的命名法，这些P450的片段分别属于不同的家族。33条序列集中在CYP4(18)和CYP6(15)家族，剩余的序列分布在CYP18(2),CYP301(2),CYP302(1),CYP303(1),CYP304(3),CYP305(1),CYP306(2),CYP307(1),CYP314(1),CYP315(1),CYP353(2),CYP380(1),CYP404(2),CYP417(2),CYP418(3),CYP419(1),CYP425(2),CYP426(1),CYP427(5)和CYP439(1)。4条NADPH细胞色素P450降解酶同时存在于灰飞虱的P450中。大多数的P450cDNA片段编码一个基因。然而有些序列来自同一基因的不同区段，例如P36和P69属于CYP4C71v2，P47和P70属于CYP4DD1v2，P15和P52属于CYP6CS2v2，P31和P56属于CYP18A1，P33和P57属于CYP306A2v2，P63和P72属于CYP418A2v2，P4、P62、P64、P66和P77属于CYP427A1。

本发明以毒死蜱和溴氰菊酯抗药性灰飞虱、敏感性灰飞虱为研究材料，分别提取两者的总RNA，利用反转录聚合酶链式反应技术(RT-PCR)克隆得到的细胞色素P450基因家族的序列，通过半定量RT-PCR技术进行筛选，细胞色素P450基因家族引物的核苷酸序列如图11至图14所示，确定毒死蜱和溴氰菊酯抗性品系中P450基因表达量上调的基因。基于切点≥2倍的改变和P<0.05的分析方法，结果显示在毒死蜱和溴氰菊酯的抗性品系中P28(CYP6AY3v2)表达水平上调，其他基因的表达量在抗敏品系中相似或相同。

本发明根据毒死蜱和溴氰菊酯抗药性灰飞虱、敏感性灰飞虱为研究材料，分别提取两者的总RNA，反转录，利用荧光定量PCR技术证实半定量RT-PCR的分析结果，同时为证实CYP6AY3v2表达上调的原因，利用荧光定量PCR技术对CYP6AY3v2的拷贝数进行分析。分别设β-actin和钠离子通道(para)作为内参基因进行实时定量PCR分析，重复3次试验，反应完成后进行溶解曲线检验，并按照2^-△△Ct法计算基因的相对表达量，在荧光定量PCR扩增中，所用引物的核苷酸序列为：

引物CYP6AY3v2-F:5′-CGATACCATTGAGAACAGGGAGAAG-3′

引物CYP6AY3v2-R:5′-TGAAGAACACAAACGCTTGAGCAG-3′

荧光定量PCR的方法结果显示，CYP6AY3v2的表达水平在毒死蜱和溴氰菊酯的抗性品系中分别是敏感品系的7.07+和24+倍。相对于敏感品系，CYP6AY3v2在基因组水平上基因拷贝数没有变化，可以认为CYP6AY3v2为单拷贝，可见CYP6AY3v2是由基因转录水平增强而非基因组水平上拷贝扩增引起，过表达的CYP6AY3v2可能由调控区域的突变引起。

综上可知，通过细胞色素P450基因鉴定克隆和基因表达分析，表明过表达的抗药性基因CYP6AY3v2参与灰飞虱对毒死蜱和溴氰菊酯抗性的形成，使得抗药性基因CYP6AY3v2及其编码的多肽在灰飞虱的抗药性分子检测方面具有重要的应用价值。

RNA干扰是通过专一性的外源和內源的双链RNA沉默基因的现象。因此，可以利用RNAi的技术移除和沉默靶基因，成为害虫防治策略的主流手段。

本发明根据灰飞虱的抗药性基因CYP6AY3v2和绿色荧光蛋白基因GFP分别设计dsRNA引物和dsGFP引物(注：本试验所用灰飞虱的体内存在绿色荧光蛋白基因GFP)，之后，提取灰飞虱毒死蜱和溴氰菊酯抗性品系的总RNA，反转录，以灰飞虱cDNA为模板，用加过T7序列的引物，进行PCR扩增，合成dsRNA模板和dsGFP模板。在PCR扩增中，用于合成dsRNA模板的引物为引物ds-F和引物ds-R，用于合成dsGFP模板的引物为引物dsGFP-F和引物dsGFP-R；

其中，引物ds-F的核苷酸序列为：

dsCYP6AY3v2-F：5′-GCCCCTTTTCGGAAACTACTATG-3′，即SEQ ID NO.5，在其5′端加T7启动子序列；

引物ds-R的核苷酸序列为：

dsCYP6AY3v2-R：5′-TCTGTTGTGAAGCGAGCCATC-3′，即SEQ ID NO.6，在其5′端加T7启动子序列；

引物dsGFP-F的核苷酸序列为：

dsGFP-F：5′-AAGTTCAGCGTGTCCG-3′，即SEQ ID NO.8，在其5′端加T7启动子序列；

引物dsGFP-R的核苷酸序列为：

dsGFP-R：5′-GAACGGCATCAAGGTG-3′，即SEQ ID NO.9，在其5′端加T7启动子序列；

T7启动子序列：5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′，即SEQ ID NO.7。

利用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(普洛麦格(北京)生物技术有限公司)回收试剂盒对dsRNA模板和dsGFP模板进行纯化。使用T7RiboMAX^TMExpress>

人工液体饲料混合dsRNA和dsGFP连续喂食灰飞虱5龄若虫至成虫，其中，处理组喂食含dsRNA的饲料，其各基因dsRNA的浓度均为0.25μg/ul；对照组喂食不含dsRNA的饲料。每组喂食3管，进行3次独立重复实验。

采用点滴法对各组灰飞虱成虫进行毒力测定，同时取处理组的灰飞虱成虫，提取总RNA，反转录获得cDNA第一条链，用实时定量PCR检测CYP6AY3v2表达量的变化。

本发明研究中，用毒死蜱和溴氰菊酯抗性基因CYP6AY3v2的dsRNA喂食灰飞虱的五龄若虫直至成虫，以喂食无dsRNA的营养液为CK，对喂食干扰后的灰飞虱成虫进行毒理分析。在研究过程中，由于绿色荧光蛋白基因GFP在灰飞虱体内稳定表达，可以作为RNA干扰脱靶效应的报告基因。

本发明发现沉默毒死蜱和溴氰菊酯抗性相关的CYP6AY3v2基因后，可以显著地提高灰飞虱对毒死蜱和溴氰菊酯的敏感性，因此CYP6AY3v2基因是毒死蜱和溴氰菊酯抗性的关键作用基因。通过合成CYP6AY3v2基因的dsRNA进行喂食RNAi可以降低靶基因的表达量，增加灰飞虱对杀虫剂的敏感性，因此CYP6AY3v2基因双链RNA的合成在灰飞虱抗性治理方面具有重要的应用价值。

综上所述，本发明通过对灰飞虱转录组的分析，获得了灰飞虱细胞色素P450家族基因，利用RT-PCR技术克隆鉴定P450家族基因，获得灰飞虱细胞色素P450家族基因序列。通过半定量RT-PCR和荧光定量PCR技术对灰飞虱毒死蜱和溴氰菊酯抗性品系和敏感品系进行对比分析，发现CYP6AY3v2基因表达上调，利用RACE技术获得CYP6AY3v2全长基因，然后以CYP6AY3v2基因片段为模板合成相应dsRNA，并利用喂食目的片段dsRNA的方法分析CYP6AY3v2基因在RNAi沉默后灰飞虱中CYP6AY3v2mRNA的表达水平，并对抗性灰飞虱成虫进行毒力测定。以上研究结果表明，CYP6AY3v2基因的分离克隆，对于灰飞虱高灵敏度的抗性分子检测和灰飞虱的抗性治理具有重要作用。

此外，发明人注意到，现有技术利用RNAi技术抗虫的思路主要有两种：第一种是找到害虫的致死基因，然后据此设计合成dsRNA，并通过喂食直接导致害虫死亡；第二种是找到害虫的致死基因，然后据此设计转基因农作物，使农作物具备能直接导致害虫死亡的能力。然而，在当前的实际情况下，社会公众对转基因技术普遍带有很深的误解，转基因农作物很难被直接接受；同时，能通过喂食直接导致害虫死亡的dsRNA，容易被社会公众误认为该dsRNA本身带有毒性，使这种dsRNA也不容易被接受。与之相比，本发明利用RNAi技术，采用dsRNA降低灰飞虱抗药性，使灰飞虱更容易被杀虫剂杀灭，可有效避免社会公众产生类似的误解，这无疑会使后续的推广工作更加顺利。

二、本发明的具体实施例：

下面通过实施例对本发明做进一步说明，但是本发明不仅限于这些例子。

本发明所用的毒死蜱和溴氰菊酯抗性品系2009年采自江苏建湖县，分别用毒死蜱和溴氰菊酯连续筛选25代和30代获得；敏感品系2009年采自江苏建湖县，在未接触任何杀虫剂情况下室内连续饲养获得。

本发明所涉及的试剂均为市购。

下述实施例的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1.CYP6AY3v2基因的克隆和序列分析

本发明通过构建灰飞虱转录组文库进行高通量测序的方法获得转录组数据，在此基础上获得CYP6AY3v2基因片段。

(1)灰飞虱总RNA提取。

以敏感品系灰飞虱为研究材料，选取灰飞虱卵、1-5龄若虫和雌雄成虫使用TRIzol总RNA提取试剂盒(上海英骏生物技术有限公司)对其进行混合提取，操作方法参照试剂盒说明书。提取的灰飞虱总RNA使用浓度为1.0％的琼脂糖凝胶电泳，用Nanodrop100核酸蛋白定量仪对RNA的浓度以及吸光度值进行检测，确认RNA的质量和完整性，然后放入超低温冰箱中在-80℃条件下冻存。

(2)cDNA模板的制备。

以灰飞虱总RNA为模板，使用反转录试剂盒PrimeScript^TM>2O。PCR仪中完成cDNA合成：37℃15min，85℃5s，12℃保持。合成的cDNA置于-20℃保存备用。

(3)引物的设计。

本发明以转录组中CYP6AY3v2基因片段序列，利用primer premier 5.0软件设计引物，设计的引物为

CYP6AY3v2-F：5′-CCTGGGATAATGTATGGCTTAG-3′；

CYP6AY3v2-R：5′-TGATGGCTCGCTTCACAACAG-3′。

引物CYP6AY3v2-F和CYP6AY3v2-R由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

(4)PCR扩增、回收纯化及测序。

以灰飞虱的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系总体积为25μl：2.5μl 10×PCRBuffer，2.5μl MgCl₂，2μl>2O。PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min。将PCR扩增后的产物经1.5％琼脂糖电泳回收，利用AxyPrep>

(5)测序结果分析。

用基因探索者软件分析所测得的序列，并通过NCBI的BLAST程序进行同源性比对分析，用GeneDoc进行比较分析。

(6)CYP6AY3v2全长基因克隆。

以灰飞虱总RNA为模板，使用Clontech^TM>

(7)全长引物设计。

CYP6AY3v2基因的5′和3′端引物使用Primer Premier 5.0软件设计，设计的5′端引物为

5CYP6AY3v2GSP：5′-TCATTCGCCTCAATTCCCTCGTCAG-3′；

5CYP6AY3v2NGSP：5′-GTGATGAATCCAACACACGTCGTCCCAT-3′。

设计的3′端引物为

3CYP6AY3v2GSP：5′-TCCAAATGATGGGACGACGTGTGTTG-3′；

3CYP6AY3v2NGSP：5′-CAAGCGTTTGTGTTCTTCATGGCTGG-3′。

CYP6AY3v2基因CDS扩增引物分别为：

CYP6AY3v2-CDSFP：5′-TCTGGATTCTGGAGTAACGC-3′；

CYP6AY3v2-CDSRP：5′-GGTAACATTCAAAGGACGGT-3′。

(8)PCR扩增。

CYP6AY3v2基因全长克隆以灰飞虱的5′(3′)cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系总体积为25μl：2.5μl 10×LA buffer，2.5μl MgCl₂，4μl>2O。第一轮扩增程序：94℃3min，94℃30s，72℃3min>

CYP6AY3v2基因CDS克隆以灰飞虱的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系总体积为25μl：2.5μl 10×PCR Buffer，2.5μl MgCl₂，4μl>2O。PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min。

回收纯化、测序及测序结果分析同本实施例中(4)和(5)的相关步骤。

灰飞虱CYP6AY3v2基因CDS全长电泳图如图1所示。1-2泳道为灰飞虱PCR电泳结果；M为DL2000Marker。

本实施例利用RT-PCR方法，克隆鉴定灰飞虱的细胞色素P450基因。80条灰飞虱P450注释的转录本从灰飞虱的转录组数据中得到，这些转录本与NCBI的蛋白数据库比对具有相似性，并且暂时性地命名为P1-P80。其中71条序列证实在灰飞虱中确实表达。使用NCBIBLASTX程序分析显示，这71条P450的序列与其他的昆虫种有高度的相似性。

实施例2.灰飞虱毒死蜱和溴氰菊酯抗性品系和敏感品系中CYP6AY3v2基因的半定量分析

选取成虫期的毒死蜱和溴氰菊酯抗药性和敏感性灰飞虱材料，利用半定量RT-PCR分析这些材料中CYP6AY3v2基因的表达水平，从而可以快速获得CYP6AY3v2基因表达水平与毒死蜱和溴氰菊酯抗药性的关系。

(1)灰飞虱总RNA提取。

以成虫期的毒死蜱和溴氰菊酯抗药性和敏感性灰飞虱为材料，使用SV Total RNA提取试剂盒(普洛麦格(北京)生物技术有限公司)依照操作步骤提取总RNA，提取的灰飞虱总RNA使用浓度为1.0％的琼脂糖凝胶电泳，用Nanodrop100核酸蛋白定量仪对RNA的浓度以及吸光度值进行检测，确认RNA的质量和完整性，然后放入超低温冰箱中在-80℃条件下冻存。

(2)cDNA模板的制备。

以灰飞虱总RNA为模板，使用反转录试剂盒PrimeScript^TM>2O。PCR仪中完成cDNA合成：37℃15min，85℃5s，12℃保持。合成的cDNA置于-20℃保存备用。

(3)半定量RT-PCR。

利用实施例1中CYP6AY3v2基因片段鉴定引物CYP6AY3v2-F和CYP6AY3v2-R，以毒死蜱和溴氰菊酯抗药性和敏感性灰飞虱cDNA为模板进行半定量RT-PCR扩增。内参基因选用β-actin(353bp)，上游引物序列是5′-AGTGCCCATCTACGAAGGTT-3′，下游引物序列是5′-CAGTATCCATGAGACCACCTACA-3′。PCR反应体系总体积为25μl：2.5μl 10×PCR Buffer，2.5μl MgCl₂，2μl>2O。PCR反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，进行25-30个循环；72℃延伸10min；12℃保存。所得PCR产物，经1.2％琼脂糖电泳检测。半定量RT-PCR分析执行三次生物学重复，每次生物学重复进行三次操作重复。

灰飞虱毒死蜱和溴氰菊酯抗性和敏感品系中CYP6AY3v2基因半定量电泳图如图2所示，A是毒死蜱品系，B是溴氰菊酯品系，R为抗性品系，S为敏感品系。结果显示在毒死蜱和溴氰菊酯的抗性品系中P28(CYP6AY3v2)表达水平上调。

实施例3.灰飞虱毒死蜱和溴氰菊酯抗性和敏感品系中CYP6AY3v2基因荧光定量分析

选取成虫期的毒死蜱和溴氰菊酯抗药性和敏感性灰飞虱为材料，利用荧光定量PCR分析这些材料中CYP6AY3v2基因的表达水平，从而可以证实CYP6AY3v2基因表达水平与毒死蜱和溴氰菊酯抗药性的关系。

(1)荧光定量PCR。

利用实施例2中的毒死蜱和溴氰菊酯抗药性和敏感性灰飞虱cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增。CYP6AY3v2基因和内参β-actin的引物使用Beacon Designer 7软件设计，CYP6AY3v2基因引物为前文所述的引物CYP6AY3v2-F和引物CYP6AY3v2-R，内参β-actin的引物序列是：

5′-TCCGAGACATCAAGGTGAAACTG-3′和5′-TGCTTCCATACCCAAGAAAGACG-3′。

实时定量PCR(quantitative real-time PCR)试验操作在ABI 7300实时定量PCR仪上进行，其反应体系及程序参照Premix Ex TaqTM说明书进行。

(2)本实验将采用2^-△△CT方法比较CYP6AY3v2基因在毒死蜱和溴氰菊酯品系和敏感品系中的表达量差异，计算公式为：

ΔΔCt＝(Ct_目标基因-Ct_持家基因)_实验组-(Ct_目标基因-Ct_持家基因)_对照组。

每个品系设置3个生物学重复，每个生物学重复3次。数据使用SPSS 13.0软件完成(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)。数据以mean±SE表示，mRNA相对表达量的比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)和邓肯氏新复极差法测验比较目标基因在各品系中的表达量的差异。

灰飞虱毒死蜱和溴氰菊酯抗性和敏感品系中CYP6AY3v2基因荧光定量分析结果如图3所示，图中A是毒死蜱品系，B是溴氰菊酯品系。结果显示，CYP6AY3v2的表达水平在毒死蜱和溴氰菊酯的抗性品系中分别是敏感品系的7.07+和24+倍。

实施例4.灰飞虱毒死蜱和溴氰菊酯抗性和敏感品系中CYP6AY3v2基因相对拷贝分析

选取成虫期的毒死蜱和溴氰菊酯抗药性和敏感性灰飞虱为材料，利用荧光定量PCR分析这些材料中CYP6AY3v2基因的相对拷贝数，初步证实CYP6AY3v2基因表达上调的原因。

(1)基因组DNA提取。

以成虫期的毒死蜱和溴氰菊酯抗药性和敏感性灰飞虱为材料，按CTAB法提取基因组DNA，提取的灰飞虱基因组DNA使用浓度为1.0％的琼脂糖凝胶电泳，确认其大小和质量。然后放入冰箱中在-20℃条件下冻存。

(2)荧光定量PCR。

荧光定量PCR使用灰飞虱的para基因作为内参，灰飞虱的para基因是单拷贝的基因。基因拷贝数的定量PCR的扩增效率与基因转录水平的定量PCR是一致的。para基因引物序列分别是：5′-TATCCGTGCTGCGTTCGTTC-3′和5′-AATGTCAGGTTGCCGAGAGC-3′。荧光定量PCR试验操作、反应体系、程序及数据分析依据实施例3的相关步骤进行。

灰飞虱毒死蜱和溴氰菊酯抗性和敏感品系中CYP6AY3v2基因相对拷贝分析结果如图4所示，图中A是毒死蜱品系，B是溴氰菊酯品系。结果显示，相对于敏感品系，抗性品系的CYP6AY3v2在基因组水平上基因拷贝数没有变化。

实施例5.灰飞虱抗药性基因CYP6AY3v2和绿色荧光蛋白基因GFP的dsRNA的体外合成

(1)以灰飞虱毒死蜱和溴氰菊酯抗性品系为研究材料，灰飞虱总RNA提取和cDNA模板的制备依据实施例1进行操作。

(2)引物设计。

引物使用Primer Premier 5.0软件设计，抗药性基因CYP6AY3v2的dsRNA和绿色荧光蛋白GFP的dsGFP的引物的核苷酸序列为：

dsCYP6AY3v2-F：5′-GCCCCTTTTCGGAAACTACTATG-3′；

dsCYP6AY3v2-R：5′-TCTGTTGTGAAGCGAGCCATC-3′；

dsGFP-F：5′-AAGTTCAGCGTGTCCG-3′；

dsGFP-R：5′-GAACGGCATCAAGGTG-3′。

以上上下游引物序列均在5′端加T7启动子序列，T7启动子序列：5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′。

(3)合成dsRNA模板和dsGFP模板。

以灰飞虱cDNA为模板，用加过T7序列的引物，进行PCR扩增。

PCR反应体系总体积为50μl：5μl 10×PCR Buffer，4μl MgCl₂，4μl>2O。

为达到dsRNA合成需要，上述PCR体系需增加10～20倍。

PCR反应条件:94℃3min，94℃30s，68℃30s,72℃1min 10个循环，94℃30s，72℃1min 28个循环，72℃10min，12℃保持。

(4)dsRNA模板和dsGFP模板的回收纯化。

选择Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(普洛麦格(北京)生物技术有限公司)回收试剂盒对PCR电泳产物进行纯化，操作步骤依据说明书进行。回收产物4℃或-20℃保存备用。

(5)dsRNA和dsGFP的体外合成。

使用T7RiboMAX^TMExpress>

灰飞虱的含有T7启动子的抗药性基因CYP6AY3v2序列如图5所示；含有T7启动子的绿色荧光蛋白基因GFP序列如图6所示。抗药性基因CYP6AY3v2体外合成的dsRNA、以及绿色荧光蛋白基因GFP体外合成的dsGFP的电泳图如图7所示。

实施例6.灰飞虱抗药性基因CYP6AY3v2RNAi效应检测

参照褐飞虱液体饲料配方及饲养方法(Fu等，2001)，稍加改进后进行饲喂。具体步骤如下：

S1.取两端开口的玻璃管(12×3cm)，一端用细纱布封好，用吸虫器吸取2龄初若虫小心转入玻璃管，每管20头左右，用细纱布封口；

S2.在超净台中，轻轻拍打玻璃管使虫子集中到玻璃管一端，然后取下另一端的纱布，将准备好的封口膜拉成正方形，贴纸面朝外盖住玻璃管口；

S3.用移液枪吸取50μl饲料及相应浓度的dsRNA，滴在膜中央轻微吸打混合，再取一片新的封口膜，贴纸面朝下盖在滴有液体饲料的封口膜上，将饲料封于两层膜间；

S4.添加饲料后将玻璃管平放到养虫架上，玻璃管上盖一层黑布，只露出喂食饲料端，利用趋光性吸引灰飞虱到饲料端取食；

S5.每24h换一次新鲜饲料，并统计灰飞虱的死亡率。实验室温度为27℃±1℃、相对湿度70-80％、24小时连续光照。处理组喂食含dsRNA的饲料，其各基因dsRNA的浓度均为0.25μg/μl；对照组喂食不含dsRNA的饲料。每组喂食3管，进行3次独立重复实验。

(1)灰飞虱饲料配方如下表所示：

(2)毒死蜱和溴氰菊酯生物测定。

选取5龄的灰飞虱连续喂食含有dsRNA的液体人工饲料至成虫，采用点滴法对干扰过后抗性灰飞虱成虫进行毒力测定。每个浓度使用30头成虫测试，重复三次。毒死蜱品系与对照组采用100ng/头，50ng/头和26ng/头三个浓度进行毒理分析。溴氰菊酯品系与对照组采用48ng/头，24ng/头和12ng/头三个浓度进行毒理分析。处理后24h检查死亡率。本实验统计方法为Duncan test(p<0.05)，字母不同代表有显著差异。统计软件为spss13.0。

(3)实时定量PCR引物设计。

根据已知灰飞虱抗药性基因CYP6AY3v2和绿色荧光蛋白基因GFP的序列，运用BeaconDesigner 7软件设计PCR引物，以β-Actin和GAPDH为内参基因。

实时定量PCR上下游引物设计如下：

CYP6AY3v2q-F：5′-AATACGCAAACCGCCTCTCC-3′；

CYP6AY3v2q-R：5′-GTTATCCGCTCACAATTCCACAC-3′；

GFP-F：5′-TTATCCGCTCACAATTCCACAC-3′；

GFP-R：5′-ATACGCAAACCGCCTCTCC-3′；

β-Actinq-F：5′-TCCGAGACATCAAGGTGAAACTG-3′；

β-Actinq-R：5′-TGCTTCCATACCCAAGAAAGACG-3′；

GA3PDHq-F：5′-GTGTGCCAGTGCCCAATGTATC-3′；

GA3PDHq-R：5′-ATGCCCTTCAGTGGTCCTTCG-3′。

(4)实时定量PCR。

灰飞虱总RNA提取和cDNA模板的制备，依据实施例2的相关步骤进行。荧光定量PCR试验操作、反应体系、程序及数据分析依据实施例3的相关步骤进行。

喂食灰飞虱dsRNA后其基因表达量变化结果如图8所示，图中A是毒死蜱品系，B是溴氰菊酯品系。

灰飞虱毒死蜱抗性基因CYP6AY3v2沉默后毒死蜱抗性的毒理分析结果如图9所示，A是100ng/头浓度处理毒死蜱抗性品系，B是50ng/头浓度处理毒死蜱抗性品系，C是26ng/头浓度处理毒死蜱抗性品系。

灰飞虱溴氰菊酯抗性基因CYP6AY3v2沉默后溴氰菊酯抗性的毒理分析结果如图10所示，A是48ng/头浓度处理溴氰菊酯抗性品系，B是24ng/头浓度处理溴氰菊酯抗性品系，C是12ng/头浓度处理溴氰菊酯抗性品系。

结果表明，对灰飞虱的毒死蜱抗性品系：

100ng/头毒死蜱浓度处理干扰后灰飞虱的毒死蜱抗性品系结果显示，喂食dsGFP和无dsRNA的营养液的灰飞虱，毒理死亡率分别为49.21％和50.25％，喂食CYP6AY3v2基因的dsRNA的灰飞虱死亡率为87.32％。

50ng/头毒死蜱浓度处理干扰后灰飞虱的毒死蜱抗性品系结果显示，喂食dsGFP和无dsRNA的营养液的灰飞虱，毒理死亡率分别为40.34％和42.34％，而喂食CYP6AY3v2基因的dsRNA的灰飞虱死亡率为78.21％。

26ng/头毒死蜱浓度处理干扰后灰飞虱的毒死蜱抗性品系结果显示，喂食dsGFP和无dsRNA的营养液的灰飞虱，毒理死亡率分别为25.12％和22.34％，而喂食CYP6AY3v2基因的dsRNA的灰飞虱死亡率为38.21％。

对于灰飞虱的溴氰菊酯抗性品系：

48ng/头溴氰菊酯浓度处理干扰后灰飞虱的溴氰菊酯抗性品系结果显示，喂食dsGFP和无dsRNA的营养液的灰飞虱，毒理死亡率分别为70.45％和75.34％，喂食CYP6AY3v2基因的dsRNA的灰飞虱死亡率为89.43％。

24ng/头溴氰菊酯浓度处理干扰后灰飞虱的溴氰菊酯抗性品系结果显示，喂食dsGFP和无dsRNA的营养液的灰飞虱，毒理死亡率分别为53.21％和55.34％，而喂食CYP6AY3v2基因的dsRNA的灰飞虱死亡率为79.43％。

12ng/头溴氰菊酯浓度处理干扰后灰飞虱的溴氰菊酯抗性品系结果显示，喂食dsGFP和无dsRNA的营养液的灰飞虱，毒理死亡率分别为30.21％和32.76％，而喂食CYP6AY3v2基因的dsRNA的灰飞虱死亡率为45.43％。

以上结果表明，沉默毒死蜱和溴氰菊酯抗性相关的CYP6AY3v2基因后，可以显著地提高灰飞虱对毒死蜱和溴氰菊酯的敏感性。

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。