对肝细胞癌患者进行肝细胞癌根治切除术预后情况分组的方法、系统以及试剂盒

技术领域

本发明属于精准医学领域，具体为涉及对拟行或已行肿瘤根治性切除术的符合米兰标准的肝细胞癌患者进行预后情况分析的方法、系统与相关产品，通过该方法、系统与相关产品的实施得到的结果可对肝细胞癌患者采取肿瘤根治性切除术后的肿瘤转移、复发风险评估与预测提供中间信息或辅助信息。

背景技术

原发性肝癌是世界范围内发病率最高的恶性肿瘤之一，每年约有100万以上的人新患此病。我国肝癌发病人数始终居于世界首位，每年约23万人死于肝癌，占全球肝癌病人死亡数的53％，位列我国恶性肿瘤病死率首位。虽然目前肝移植被认为是公认的治疗肝癌的有效手段，但由于供肝来源的短缺，肝脏肿瘤的切除手术就成为了治疗肝细胞癌更为普遍开展的治疗策略。

目前认为早期肝细胞癌患者的肿瘤根治性切除术具有较好的预后。但大部分研究显示，符合米兰标准的早期肝癌的3年内复发率可达到40％-50％。其中3年内的复发绝大多数是由于原发灶癌细胞的转移播散。以往对患者肿瘤的评估多基于大体组织病理学指标，如肿瘤直径和结节个数。这些指标未能从肿瘤的细胞生物学行为上对肿瘤和患者进行全面的评估，特别是对于处于非常早期的肝细胞癌。

近年来，随着一些肝癌生物学标志物的发现，使得人类对肝癌发生、发展的认识有了长足的进步。虽然肝细胞癌中细胞角蛋白19(CK19)或磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)的表达与患者术后肿瘤转移、复发的关系可见报道，但联合检测CK19或GPC3对肝细胞癌进行亚分类以及对患者预后进行分层尚未见公开报道。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供对符合米兰标准的拟进行或已进行肝细胞癌根治切除术的肝细胞癌患者进行预后情况分组的方法和系统。

本发明的另一个目的是提供与该方法或系统组合使用的试剂盒。

本发明的技术方案如下。

本发明所述预后包括肝细胞癌根治切除术后的肿瘤的肝内复发、肝外转移以及患者无复发生存。

一方面，本发明提供一种对符合米兰标准的拟进行或已进行肝细胞癌根治切除术的肝细胞癌患者进行预后情况分组的方法，所述方法包括：

(1)检测所述患者的肝细胞癌组织样品中细胞的CK19(细胞角蛋白19)和GPC3(磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3)表达情况，并基于表达情况给患者赋值：如为共表达CK19和GPC3的CK19+/GPC3+，赋值1分；如为表达GPC3但不表达CK19的CK19-/GPC3+或CK19和GPC3均不表达的CK19-/GPC3-，赋值0分；

(2)检测所述患者的肝细胞癌组织样品的分化情况，并基于分化情况给患者赋值：如为肿瘤低分化，赋值1分；如为肿瘤高分化或肿瘤中分化，赋值0分；

(3)检测所述患者的肝脏内肿瘤结节个数，并基于结节个数给患者赋值：如为1个肿瘤结节的单发，赋值0分；如为2-3个肿瘤结节的多发，赋值1分；和

(4)将步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)中得到的赋值进行加和，得到所述患者的总赋值，由此将总赋值为0分的患者确定为肝细胞癌根治切除术后良好预后组，将总赋值为1分的患者确定为肝细胞癌根治切除术后一般预后组，或将总赋值为2分或3分的患者确定为肝细胞癌根治切除术后差预后组。

在本发明中，所述肝细胞癌组织样品获取自所述患者的术前肝穿活检或肝细胞癌根治切除术。

优选地，步骤(1)中通过对所述肝细胞癌组织样品进行免疫组织化学染色来检测CK19和GPC3表达情况；

优选地，所述免疫组织化学染色利用分别针对CK19和GPC3的单克隆抗体进行；更优选地，所述免疫组织化学染色利用不同颜色荧光素标记的分别针对CK19和GPC3的单克隆抗体进行。CK19和GPC3的表达为阴性还 是阳性根据本领域的一般标准进行判断。

根据本申请的具体实施方式，所述免疫组织化学染色利用兔抗人CK19单克隆抗体(ab52625，Abcam公司)和小鼠抗人GPC3单克隆抗体(ab129381，Abcam公司)进行；或者所述免疫组织化学染色利用针对CK19的单克隆抗体(FITC标记，ab87014，Abcam公司)和针对GPC3的单克隆抗体(Alexa 647标记，ab199813，Abcam公司)进行。

优选地，步骤(2)中通过对所述肝细胞癌组织样品进行苏木素-伊红染色来检测分化情况。

优选地，步骤(3)中通过肝细胞癌根治切除术前的影像学结果或者肝细胞癌根治切除术中得到的切除标本的大体检查结果来确定患者肝脏内肿瘤结节个数；

其中优选地，所述影像学结果获取自增强CT或增强核磁扫描成像。

另一方面，本发明提供一种对符合米兰标准的拟进行或已进行肝细胞癌根治切除术的肝细胞癌患者进行预后情况分组的系统，所述系统包括：

(1)生物分析模块：

(1-A)CK19和GPC3表达分析模块，所述模块设置为基于所述患者的肝细胞癌组织样品中细胞的CK19和GPC3表达情况给患者赋值：如为共表达CK19和GPC3的CK19+/GPC3+，赋值1分；如为表达GPC3但不表达CK19的CK19-/GPC3+或CK19和GPC3均不表达的CK19-/GPC3-，赋值0分；

(1-B)组织病理学分化分析模块，所述模块设置为基于所述患者的肝细胞癌组织样品的分化情况给患者赋值：如为肿瘤低分化，赋值1分；如为肿瘤高分化或肿瘤中分化，赋值0分；和

(1-C)肿瘤个数分析模块，所述模块设置为基于所述患者的肝脏内肿瘤结节个数给患者赋值：如为1个肿瘤结节的单发，赋值0分；如为2-3个肿瘤结节的多发，赋值1分；

以及

(2)数据处理模块：

所述模块设置为对来自(1-A)中模块、(1-B)中模块和(1-C)中模块的赋值进行加和，得到所述患者的总赋值，并将总赋值为0分的患者确定为肝细胞癌根治切除术后良好预后组，将总赋值为1分的患者确定为肝细胞癌根治切除术后一般预后组，或将总赋值为2分或3分的患者确定为肝细胞癌根治切 除术后差预后组。

优选地，所述系统中的肝细胞癌组织样品获取自所述患者的术前肝穿活检或肝细胞癌根治切除术。

在本发明提供的系统中，优选地，(1-A)中的模块还设置为检测CK19和GPC3表达情况；

优选地，通过对所述肝细胞癌组织样品进行免疫组织化学染色来检测CK19和GPC3表达情况；

更优选地，所述免疫组织化学染色利用分别针对CK19和GPC3的单克隆抗体进行；更优选地，所述免疫组织化学染色利用不同颜色荧光素标记的分别针对CK19和GPC3的单克隆抗体进行。

根据本申请的具体实施方式，所述免疫组织化学染色利用兔抗人CK19单克隆抗体(ab52625，Abcam公司)和小鼠抗人GPC3单克隆抗体(ab129381，Abcam公司)进行；或者所述免疫组织化学染色利用针对CK19的单克隆抗体(FITC标记，ab87014，Abcam公司)和针对GPC3的单克隆抗体(Alexa 647标记，ab199813，Abcam公司)进行。

在本发明提供的系统中，优选地，(1-B)中模块还设置为检测所述分化情况；

优选地，通过对所述肝细胞癌组织样品进行苏木素-伊红染色来检测分化情况。

在本发明提供的系统中，优选地，(1-C)中模块还设置为检测所述患者的肝脏内肿瘤结节个数；

优选地，通过肝细胞癌根治切除术前的影像学结果或者肝细胞癌根治切除术前的影像学结果或术中切除标本的大体检查结果来确定患者肝脏内肿瘤结节个数；

其中优选地，所述影像学结果获取自增强CT或增强核磁扫描成像。

又一方面，本发明还提供一种本发明的方法或系统组合使用的试剂盒，所述试剂盒包括：

(A)用于检测肝细胞癌组织样品中细胞的CK19和GPC3表达情况的试剂；和

(B)用于检测肝细胞癌组织样品的分化情况的试剂。

在本发明提供的试剂盒中，优选地，(A)中的试剂包括用于对所述肝细 胞癌组织样品进行免疫组织化学染色的试剂；

优选地，所述试剂包括CK19和GPC3的单克隆抗体；更优选地，所述试剂包括不同颜色荧光素标记的分别针对CK19和GPC3的单克隆抗体。

在本发明提供的试剂盒中，优选地，(B)中的试剂包括用于对所述肝细胞癌组织样品进行苏木素-伊红染色的试剂。

具体而言，首先，本发明的方法、系统与试剂盒涉及检测患者的肝细胞癌组织样品中细胞的CK19和GPC3表达情况，并基于该表达情况对患者进行共表达CK19和GPC3的CK19+/GPC3+、表达GPC3但不表达CK19的CK19-/GPC3+、和CK19和GPC3均不表达的CK19-/GPC3-的分组。

CK19和GPC3的表达为阴性还是阳性根据本领域的一般标准进行判断。在本发明的优选实施方式中，可利用CK19和GPC3的单克隆抗体进行检测，当样品中表达CK19或GPC3的细胞≥所有细胞的5％，判断为阳性；而当表达CK19或GPC3的细胞<所有细胞的5％，判断为阴性。而利用不同颜色荧光素标记的单克隆抗体进行检测时，当观察到样品中细胞显示相应颜色，判断为阳性；当观察到样品中细胞未显示相应颜色，判断为阴性。

第二，本发明的方法、系统与试剂盒涉及患者肿瘤的病理学诊断和组织学分化。如本文所定义，按照下述标准对肿瘤进行低、中、高分化判断：

高分化：肿瘤细胞排列不超过3层的细梁状结构，或假腺样、腺泡样结构。且细胞大小较一致，核轻度异型性；

中分化：1.肿瘤细胞排列不超过3层的细梁状结构，或假腺样、腺泡样结构，细胞大小不一致，核中度异型性，无多核瘤细胞或瘤巨细胞；或者2.肿瘤细胞排列超过3层的梁状结构(粗梁状结构)或巢状结构以及实体结构，但细胞大小较一致，核中度异型性，无多核瘤细胞或瘤巨细胞；

低分化：任何组织学形态，细胞大小不一致，出现细胞和核的多形性，可出现多核瘤细胞或瘤巨细胞。

上述判断标准可参见：Bosman FT,Carneiro F,Hruban RH,Theise ND.WHO Classification of Tumours of the Digestive System.forth ed.Lyon:International Agency for Research on Cancer,2010:205-227；International Working Party.Terminology of nodular hepatocellular lesions.Hepatology.1995；22(3):983-93；和International Consensus Group for Hepatocellular Neoplasia.Pathologic diagnosis of early hepatocellular carcinoma:a report of the international consensus group for hepatocellular neoplasia.Hepatology.2009；49(2):658-64。

第三，本发明的方法、系统与试剂盒涉及患者的肿瘤结节个数的分析。所述患者符合米兰标准，因此如本文所定义，当检测到患者肝脏内肿瘤结节个数为1个，判断为肿瘤结节的单发，当检测到患者肝脏内肿瘤结节个数为2-3个，判断为肿瘤结节的多发。肿瘤结节可以通过肝细胞癌根治切除术前的影像学结果或肝细胞癌根治切除术中的大体检查结果进行判断。

示例性地，本发明提供采用所述方法、系统与试剂盒可进行以下实施过程：

可在肝细胞癌根治切除术前实施技术方案1：

1.根据影像学资料选择符合米兰标准的肝细胞癌患者进入以下分析。

2.利用术前肝穿活检获取的肝细胞癌组织进行CK19和GPC3的免疫组化染色，将肝细胞癌患者分为CK19+/GPC3+、CK19-/GPC3+和CK19-/GPC3-三种分子亚型，其中具有CK19-/GPC3+或CK19-/GPC3-表型的赋值0分，具有CK19+/GPC3+表型的赋值1分。

优选地，该免疫组织化学技术为利用CK19和GPC3单克隆抗体对肿瘤组织的连续切片进行免疫组织化学染色，以观察到表达CK19或GPC3的肿瘤细胞是否≥所有肿瘤细胞的5％为标准来判断阳性或阴性，如肿瘤细胞的二者表达均为阳性，即记录为CK19+/GPC3+；如肿瘤细胞只显示GPC3阳性，则记录为CK19-/GPC3+；如肿瘤细胞CK19和GPC3染色均无阳性表达，则记录为CK19-/GPC3-。

优选地，利用不同颜色荧光素标记的CK19和GPC3单克隆抗体进行共同染色，只要观察到肿瘤细胞同时表达CK19和GPC3，即记录为CK19+/GPC3+；如肿瘤细胞只显示GPC3阳性，则记录为CK19-/GPC3+；如肿瘤细胞CK19和GPC3染色均无阳性表达，则记录为CK19-/GPC3-。

3.利用术前肝穿获取的肿瘤组织进行HE染色，把肿瘤分为高、中和低三种分化状态，其中具有高或中分化的肿瘤赋值0分，具有低分化的肿瘤赋值1分。

4.根据术前增强CT或增强核磁影像学获取的肝脏内肿瘤结节的个数，把患者分为单发和多发(2-3个肿瘤)两种情况，其中具有单发肿瘤结节的赋值0分，具有多发肿瘤结节的赋值1分。

5.将患者肿瘤免疫表型、分化状态和单/多发三项分类指标的赋值得分相加，可以得到0、或1、或2、或3分。

6.将得分为0分的患者确定为肝切除术后低级别复发风险组(良好预后组)，将得分为1分的患者确定为肝切除术后中级别复发风险组(一般预后组)，将得分为2分或3分的患者确定为肝切除术后高级别复发风险组(差预后组)。

或者，可在肝细胞癌根治切除术后实施技术方案2：

1.根据增强核磁成像或增强CT影像学检查结果选自符合米兰标准的肝细胞癌患者进行以下分析。

2.利用肿瘤手术切除标本获取的肝细胞癌组织进行CK19和GPC3的免疫组化染色，将肝细胞癌患者分为CK19+/GPC3+、CK19-/GPC3+和CK19-/GPC3-三种分子亚型，其中具有CK19-/GPC3+和CK19-/GPC3-表型的赋值0分，具有CK19+/GPC3+表型的赋值1分。

CK19和GPC3的表达为阴性还是阳性的判断同技术方案1。

3.利用肿瘤手术切除标本获取的肿瘤组织进行HE染色，把肿瘤分为高、中和低三种分化状态，其中具有高和中分化的肿瘤赋值0分，具有低分化的肿瘤赋值1分。

4.根据肿瘤手术切除标本的大体检查或术前增强CT或增强核磁扫描成像获取的肝脏内肿瘤结节的个数，把患者分为单发和多发(2-3个肿瘤)两种情况，其中具有单发肿瘤的赋值0分，具有多发肿瘤的赋值1分。

5.将患者肿瘤免疫表型、分化状态和单/多发三项分类指标的赋值得分相加，可以得到0、或1、或2、或3分。

6.将得分为0分的患者确定为肝切除术后低级别复发风险组(良好预后组)，将得分为1分的患者确定为肝切除术后中级别复发风险组(一般预后组)，将得分为2分或3分的患者确定为肝切除术后高级别复发风险组(差预后组)

本发明证明，结合CK19或GPC3联合检测、肝细胞癌的分化状态以及肿瘤的结节个数可以对肝细胞癌患者的肿瘤切除预后进行有效分组，该分组可以对患者术后肿瘤复发与转移进行有效分层和预测提供中间结果或辅助信息。因此，本发明对于筛选适宜肝细胞癌手术切除的患者人群，提高治疗效果，节约社会资源等方面具有重要意义；同时，对肝细胞癌手术切除术后 肿瘤复发、转移风险的评估，可以使临床医生能够根据复发风险的高低实施监测及采取相应的预防措施。

对于大量肝细胞癌患者进行上述预后情况分组后，发现：良好预后组中的肝细胞癌患者，在其肿瘤根治性切除术后两年内实际复发率约为32.47％，平均无复发生存时间为61.2个月，具有对单纯肿瘤根治性切除术较好的疗效，但术后应进行密切的肿瘤监测以及早发现肿瘤转移或复发，及时采取进一步的治疗措施以提高总生存率。一般预后组中的肝细胞癌患者，在其肿瘤根治性切除术后两年内实际复发率为55.81％，平均无复发生存时间为32.6个月。而差预后组中的肝细胞癌患者，在其肿瘤根治性切除术后两年内实际复发率为91.43％，平均无复发生存时间仅为9.6个月。因此，一般预后组和差预后组中的患者，如果选择肿瘤根治性切除术，术后应该进行更密切的肿瘤检测以及早发现肿瘤转移或复发，及时采取进一步的治疗措施以提高总生存率。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1：根据本发明实施例1所有入组病例的生存曲线，其中图1A显示为四组的生存曲线，图1B显示合并为三组的生存曲线；

图2：根据本发明实施例2(技术方案1)，基于肝穿的肿瘤组织CK19和GPC3免疫分型、分化和肿瘤数目的肝细胞癌患者肿瘤根治性切除术预后分组流程图；

图3：根据本发明实施例2(技术方案1)，显示不同组中患者群的生存曲线；

图4：根据本发明实施例2(技术方案1)，显示本发明分类方法的ROC曲线，曲线下面积为0.776(95％置信区间为0.616-0.937)，其中虚线为根据米兰标准得到的参考线；

图5：根据本发明实施例3(技术方案2)，基于手术大体标本的肿瘤组织CK19和GPC3免疫分型、分化和肿瘤数目的肝细胞癌患者肿瘤根治性切除术预后分组流程图；

图6：根据本发明实施例3(技术方案2)，显示不同组中患者群的生存曲线；

图7：根据本发明实施例3(技术方案2)，显示本发明分类方法的ROC曲线，曲线下面积为0.788(95％置信区间为0.649-0.927)，其中虚线为根据米兰标准得到的参考线。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

实施例1通过鉴定预测HCC患者中的无复发生存的风险因子而建立本发明的分组方法

1.患者和方法

患者和组织样本

收集2007年1月至2010年11月期间首都医科大学附属北京佑安医院和解放军304医院的肝细胞癌手术切除的病例346例。此研究符合赫尔辛基宣言并经当地伦理委员会批准，受检者均签署知情同意书。所有病例术前未经化疗、放射治疗或介入治疗。手术切除的其他入组标准包括：(1)原发瘤灶、卫星灶和多发灶可以被根治性切除，(2)肝功能为Child–Pugh分级的A或B，(3)切除后剩余肝脏足够维持生理机能且无手术禁忌证。其中198例符合上述入组标准及米兰标准，用于本研究的预后分析。

包括在预后分析中的HCC的临床、组织学数据(n＝198)总结在表1中：分类变量和连续变量间的比较分别用卡方检验或Student T检验。无复发生存时间指从手术当日起到第一次远处或局部复发或最后一次随访时间。患者在肿瘤复发之前发生死亡时间被认为数据删失。Kaplan-Meier方法用于绘制生存曲线，曲线之间的差异用log-rank检验。

所有组织样本首先经过10％的甲醛固定，然后切取的肿瘤组织按脱水、透明、浸蜡、包埋程序处理，4μm连续切片，并进行苏木素-伊红(HE)染色。所有的HCC的诊断和组织学分级是基于既定的组织学标准，由2位副主任医师级别以上的病理学医生利用双盲法进行评估。

表1.研究中包括的所有患者的基线临床特征

HBV，乙型肝炎；HCV，丙型肝炎；CK，细胞角蛋白；GPC3，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3

2.单因素分析：

根据患者的临床和病理学检查，将包括患者性别、年龄、是否有肝硬化、肉眼瘤栓、镜下瘤栓、组织学分级、CK19/GPC3表达模式、肿瘤结节数目的8个因子用于单因素分析，结果发现，上述八个因子中有5个即肉眼瘤栓(P<0.01)、镜下血管瘤栓(P<0.01)、组织学低分化(P<0.01)、CK19+/GPC3+免疫表型(P<0.01)和肿瘤结节数目为2或3(P<0.01)与患者的肿瘤无复发生存时间密切相关。结果见下表2。

表2.针对肿瘤复发的单因素分析

CK，细胞角蛋白；GPC3，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3

3.多因素COX回归分析：

将上述5个因子纳入多因素分析。结果显示，CK19+/GPC3+免疫表型[风险比(HR)＝1.782,95％置信区间(CI)＝1.137–2.793,P＝0.012]、肿瘤低分化(HR＝1.969,95％CI＝1.292–3.001,P＝0.002)和肿瘤结节数目为2或3 (HR＝2.173，95％CI＝1.328-3.557，P＝0.002)是患者肿瘤无复发生存时间的独立预测因素。结果见下表3。

表3.肿瘤复发的预测因素分析

4.用于预测HCC患者的无复发生存的多因素风险积分模型：

根据COX回归中预后相关因子的β系数设定因子的风险得分。每一变量中的参考变量赋值为0分，并将具有最低β系数的变量的项赋值为1分。以此为基础将其它变量标准化，所得数值四舍五入取整数作为风险得分。把每一病例中各个风险因子的权重得分相加得到每一病例总的风险得分。根据上述原则，本案例中，一个肿瘤得分为0，二或三个肿瘤得分为1；高或中分化的肿瘤得分为0，差分化的肿瘤得分为1；CK19-/GPC3+或CK19-/GPC3-HCC得分为0，CK19+/GPC3+HCC得分为1。结果见下表4。

表4.多变量Cox回归分析和基于β系数的得分

HCC，肝细胞癌；HR：风险比；CI：置信区间；CK，细胞角蛋白；GPC3，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3

根据上述积分系统，所有入组病例被分为四组(得分：0，1，2，3分)。绘制四组的生存曲线，结果见图1，其中图1A显示得分为2和3的生存曲线明显重叠(P＞0.05)，进行合并得到图1B。因此最终所有入组病例被分为三组，良好预后组(O分)，一般预后组(1分)和差预后组(2-3分)。生存分析显示，良好预后组、一般预后组和差预后组两年内的平均无复发生存期分别为61.2个月、32.6个月和9.6个月，实际复发率分别为32.47％(25/77)、55.81％(48/86)和91.43％(32/35)。Log-rank发现三组之间的RFS具有统计学意义(P＜0.01)。结果见下表5。

表5.基于手术切除样本对符合米兰标准的HCC患者的生存分析

HCC，肝细胞癌；RFS：无复发生存；CI：置信区间

5.对模型预测能力的评估

模型的预测能力由ROC曲线下面的面积(AUC)来进行评估。当 AUC<0.5提示模型的预测能力不可以接受。同时，Akaike信息准则(Akaike information criterion，AIC)被用于比较各因素之间的预测能力，AIC值最小的模型相对最优。本模型中，AUC值为0.715(95％CI：0.645-0.786),P＝0.000，该模型相对应的AIC值为1067.707，在所有风险因子中为最低。提示该模型与其他单因素风险因子相比，具有最佳的预测能力。结果见下表6。

表6.多因素评分和其他要素的AIC和AUC

CI：置信区间；CK，细胞角蛋白；GPC3，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3

实施例2在肝细胞癌根治切除术前基于肝脏穿刺活检对符合米兰标准的肝细胞癌患者进行预后情况分组(技术方案1)

从北京海淀区某三级甲等医院收集符合米兰标准的肝细胞癌患者的肿瘤手术切除病例35例，所有患者均在肝细胞癌根治切除术前曾进行肝脏穿刺活检，并且从病理科数据库获得患者肿瘤分化程度和CK19、GPC3免疫组化染色结果，从医学影像科获得患者影像学信息。

采用本发明提供的方法、系统与试剂盒对符合米兰标准的肝细胞癌患者进行预后情况分组，结果见下表7。

具体实施过程见图2。

由该院医生电话随访获得各组中患者术后生存信息。基于表7中每一入组病例的免疫表型、肿瘤分化和单/多发的分类及得分，采用实施例1中方法计算每一患者手术切除术后转移和复发风险累计得分，并根据结果绘制各组中患者的生存曲线和ROC曲线，结果分别见图3和图4(将根据米兰标准得到的对角线作为参考线)。

结果显示，三组中患者群的总的切除术后复发率为45.71％(16/35)，而被分到肝细胞癌根治切除术后良好预后组中患者群的术后实际复发率为23.53％(4/17)，被分到肝细胞癌根治切除术后一般预后组中患者群的术后实际复发率为50％(6/12)，被分到肝细胞癌根治切除术后差预后组中患者群的术后实际复发率为100％(6/6)。因此证明本发明的方法、系统与试剂盒可以通过对肝细胞癌患者进行预后情况分组，对患者术后肿瘤复发与转移进行有效分层和预测提供中间结果或辅助信息，有助于更有效地在切除术前对患者术后的转移和复发风险进行分层。

实施例3在肝细胞癌根治切除术后基于手术切除术后大体标本对符合米兰标准的肝细胞癌患者进行预后情况分组(技术方案2)

从北京海淀区某三级甲等医院收集符合米兰标准的肝细胞癌患者的肿瘤手术切除病例47例。从病理科数据库获得患者肿瘤分化程度和CK19、GPC3免疫组化染色结果，患者影像学信息从医学影像科获得并结合手书大体标本检查最终确定。

采用本发明提供的方法、系统与试剂盒对符合米兰标准的肝细胞癌患者进行预后情况分组，结果见下表8。

具体实施过程见图5。

由该院医生电话随访获得各组中患者术后生存信息。基于表8中每一入组病例的免疫表型、肿瘤分化和单/多发的分类及得分，采用实施例1中方法计算每一患者手术切除术后转移和复发风险累计得分，并根据结果绘制该队列中患者的生存曲线和ROC曲线，结果分别见图6和图7(将根据米兰标准得到的对角线作为参考线)。

结果显示，三组中患者群的总的切除术后复发率为40.42％(19/47)，而被分到肝细胞癌根治切除术后良好预后组中患者群的术后切除术后复发率为17.39％(4/23)，被分到肝细胞癌根治切除术后一般预后组中患者群的术后实际复发率为46.67％(7/15)，被分到肝细胞癌根治切除术后差预后组中患者群的术后实际复发率为88.89％(8/9)。因此证明本发明的方法、系统与试剂盒可以通过对肝细胞癌患者进行预后情况分组，对患者术后肿瘤复发与转移提供中间结果或辅助信息，有助于更有效地在切除术后对患者术后的转移和复发风险进行分层。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。