黄芪多糖的提取方法及兽用黄芪多糖口服液的制备方法

技术领域

本发明涉及一种黄芪多糖的提取方法，同时还涉及兽用黄芪多糖口服液的制备方法，属于兽药加工技术领域。

背景技术

黄芪是常用中药之一，在临床上应用广泛，具有补气固表、托毒排脓、利尿、敛疮生肌之功效。黄芪含有多种有效成分，包括皂苷、多糖、黄酮类化合物、氨基酸及微量元素等。其中，多糖是一类大分子化合物，在黄芪的药理中发挥重要作用。传统临床中黄芪主要是以饮片或者粉碎后与其他中草药制成汤剂、丸剂等形式使用。但是常规的中药粉碎加工方法并不能破裂其纤维组织，更无法实现细胞级的破坏，因而影响黄芪中有效成分的溶出，最终导致药材利用率偏低。

众所周知，黄芪多糖口服液含有免疫增强物质，能强化机体的体液免疫功能，产生大量的免疫球蛋白和补体，并有清热解毒，调节机体代谢机能紊乱之功效，能提高动物体的免疫力，增强其抗病能力。主要用于抗病毒治疗，对鸡新城疫病、法氏囊病、喉气管炎以及猪圆环病毒病、蓝耳病、传染性胃肠炎等具有突出的防治功效。目前，黄芪多糖的提取方法主要包括水煮法、碱水/碱醇提取法、微波辅助萃取法、超声提取法和纤维素酶法等，其中应用较为广泛的是碱提法，但其缺点是提取率低、提取时间长，高温提取会引起多糖的氧化分解，破坏其高级结构。

传统的黄芪多糖提取方法如兽药质量标准汇编(2006-2011)中记载的方法，需要对原料进行多次煎煮，反复醇沉，操作工艺复杂，乙醇用量大、回收成本高，且黄芪多糖的提取率低，杂质含量高，生产周期长，成品稳定性差。公布号CN103848918A的发明专利公开了一种黄芪多糖的提取方法，包括：1)将黄芪药材用超微粉碎机粉碎至颗粒直径为10～25μm，加入黄芪粉重量2～3倍的无水乙醇，100℃水浴回流提取30～60min，3000r/min离心5min，收集药材粉末，并挥干粉末中的乙醇；2)加入黄芪粉重量6～8倍的水，在65～85℃水浴中保温、搅拌1～2h，3000r/min离心5min，分离沉淀与提取液备用；3)往上述沉淀中加入4～6倍量的水，同步骤3)操作；4)合并步骤2)、3)所得滤液，减压浓缩至原体积的1/5；5)向浓缩液中加入无水乙醇至乙醇溶度为65％～85％，搅拌10～15min，离心，取沉淀真空干燥即得。该方法能将黄芪多糖的得率提高到20％以上，同时纯度在80％以上，一定程度上解决了多糖得率与纯度不能同时保持在高水平的问题，但是仍有进一步提升的空间。

发明内容

本发明的目的是提供一种黄芪多糖的提取方法，提取效率高，多糖成分纯度高、活性好。

同时，本发明还提供一种兽用黄芪多糖口服液的制备方法。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

黄芪多糖的提取方法，包括以下步骤：

1)将黄芪超微粉碎，得到黄芪粉末；

2)采用闪式提取法，在黄芪粉末中加入浓度0.05‰～0.1‰的氧化钙水溶液，并于温度50～60℃下提取2～3min；

分离出药渣，重复提取2～3次，合并提取液；

3)提取液浓缩后澄清除杂，得到澄清液，澄清液进一步浓缩，醇沉提取，得到黄芪多糖。

步骤1)中超微粉碎采用超微粉碎机，粉碎至粉末粒度为1～10μm。

步骤2)中闪式提取采用闪式提取器，电机电压200～220V。

步骤2)中黄芪粉末与氧化钙水溶液的料液比为1g:8～10mL。浓度0.05～0.1‰的氧化钙水溶液的自然pH值为9.0～10.0。

步骤2)中重复提取2～3次能使黄芪粉末中多糖成分充分溶出，提高黄芪多糖的提取率。

步骤3)中提取液浓缩至90℃下相对密度1.05～1.08，再澄清除杂。

步骤3)中澄清除杂分两步进行，第一步采用市售ZTC(1+1)澄清剂除杂，杂质去除率在70％左右，第二步采用壳聚糖吸附除杂。经二次除杂，浓缩液中的不稳定成分如蛋白质、鞣质、蜡质等被大量去除，杂质去除率达95％以上，便于后续分离等操作。

其中，ZTC(1+1)澄清剂(购自天津正大成澄清技术有限公司)由A、B两种组分组成。使用前，先将A组分用水配成浓度1％的水溶液，配制方法为先在A组分中加入少量的水，搅成糊状，再加入需要量的水，混合均匀后静置溶胀24h，后用双层纱布过滤备用，得A组分液；B组分用1％醋酸配成浓度1％的溶液即可，配制方法同A组分，得B组分液。由于黄芪浓缩液呈碱性，使用时，先在浓缩液中加B组分液，再加A组分液。B组分液、A组分液与浓缩液的最佳用量比为4:2:100(体积比)。具体的，取浓缩液按溶液体积4％的量边搅拌边加入B组分液，可见有大块絮状沉淀生成，再按溶液体积2％的量边搅拌边加入A组分液，加完后继续搅拌若干分钟，静置冷藏(约24h)；倾出上清液并抽滤，下层药液滤除较大的沉淀后抽滤，合并滤液，备用。详细操作步骤见产品说明书。

在第二步澄清操作中，先将壳聚糖用稀酸(如1％醋酸)配成浓度1％～6％的壳聚糖溶液(即壳聚糖的稀酸溶液，如将1g壳聚糖加入到100mL 1％醋酸溶液中，搅拌均匀后静置24h)，再将第一步澄清处理的溶液与壳聚糖溶液混合，升温至40～60℃，吸附除杂(静置条件下)1～3h，分离出清液即可。第一步澄清处理的溶液与壳聚糖溶液的体积比为1:0.05～0.08。

步骤3)中澄清液浓缩至90℃下相对密度1.05～1.15。

步骤3)中醇沉提取为在浓缩液中加入乙醇(浓度95％以上)，使含醇量在75％以上，搅拌后静置，分离出沉淀，沉淀除去溶剂(包括乙醇和水)，即得。

步骤3)中浓缩均采用冷冻浓缩的方式，以最大限度地减少多糖活性的降低。

黄芪多糖口服液的制备方法，包括以下步骤：

A、黄芪多糖的提取

1)将黄芪超微粉碎，得到黄芪粉末；

2)采用闪式提取法，在黄芪粉末中加入浓度0.1～0.05‰的氧化钙水溶液，并于温度50～60℃下提取2～3min；

分离出药渣，重复提取2～3次，合并提取液；

3)提取液浓缩后澄清除杂，得到澄清液，澄清液进一步浓缩，醇沉提取，得到黄芪多糖粉末；

B、黄芪多糖口服液的配制

在黄芪多糖粉末中加入5～8倍量(质量)的水，再加入添加剂，即得。

步骤A中1)～3)步操作均同上述。

步骤B中添加剂包括抗氧剂、pH调节剂和防腐剂等。其中，抗氧剂可选自亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、维生素C等，用量为口服液质量的0.1～0.5％。pH调节剂可选自盐酸、醋酸、乳酸、氢氧化钠、磷酸氢二钠、硫酸二氢钠等，调至产品pH值范围即可(如pH 6.3～6.8)。防腐剂可选自苯甲酸钠，山梨酸钠、复合尼泊金酯钠等，用量为口服液质量的0.1～0.25％。

本发明的有益效果：

本发明采用超微粉碎与闪式提取相结合的方式提取黄芪多糖，其中超微粉碎是采用超细切割技术破碎物料，在不改变物料化学组成的基础上，改变其界面及表面物理特性，如破坏药材的细胞壁，将药材中有效成分充分溶出，达到充分提取的目的。对于中药材黄芪，超微粉碎能深度破坏黄芪细胞壁，将黄芪中有效成分多糖充分暴露，利于后续提取提纯操作。另外，本发明采用碱性氧化钙溶液作为闪式提取的提取剂，提取温度低、效率高、时间短，能最大程度地降低黄芪中多糖成分的损失。采用将超微粉碎与闪式提取相结合的方式低温提取黄芪多糖，药物提取更加充分、快速，多糖成分含量高。

本发明采用分步澄清除杂与醇沉提取相结合的方式提纯黄芪多糖，其中澄清除杂包括ZTC(1+1)澄清剂除杂与壳聚糖吸附除杂两步操作，澄清剂除杂对杂质的去除率在70％左右，配合第二步壳聚糖吸附除杂，两步操作对杂质的总去除率达95％以上，能有效去除浓缩液中蛋白质、鞣质、蜡质等不稳定成分。而醇提法能进一步去除浓缩液中少量的蛋白质、总酚等成分，达到深度提纯多糖成分的目的，且便于后续分离等操作。澄清除杂能减少后续醇沉提取中醇溶剂用量，并降低醇溶剂回收能耗，节约成本在50％以上。所得药液澄清、纯净，除杂耗时短、效率高、成本低，对药液pH值及多糖成分含量几乎无影响。

本发明采用冷冻浓缩技术收集黄芪多糖，能最大限度地减少多糖活性的降低。冷冻浓缩的原理是将溶液温度降至冰点以下，使溶液中水冻结成冰晶，将冰晶分离去除得到浓缩物。相较传统的减压浓缩(加热温度高、浓缩效率低，易引起药材化学成分的改变)或热薄膜浓缩(药材中挥发性成分易随水气挥发，且不耐热成分易分解)能有效节约能源。

本发明中黄芪多糖提取工艺简单、操作简便，提取(超微粉碎与闪式提取相结合)、提纯(分步澄清除杂与醇沉提取相结合)温度低、效率高，操作省时、省力、能耗低，原药提取充分，多糖成分纯度高、活性好。同时黄芪多糖口服液的活性高、稳定性好，能在体内快速吸收。

具体实施方式

下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1

黄芪多糖的提取方法，包括以下步骤：

1)将黄芪用超微粉碎机粉碎至粒度5～8μm，得到黄芪粉末；

2)采用闪式提取法，在黄芪粉末中加入浓度0.1‰的氧化钙水溶液(pH 9.0)，每克黄芪粉末加入8mL氧化钙水溶液，混合均匀后置于闪式提取器内，设置电机电压200V，提取温度50℃，提取时间3min；

提取完毕，分离出药渣，重复上述提取操作2次，合并提取液备用；

3)将提取液浓缩至90℃下相对密度1.06，得到浓缩液A；

取浓缩液A，分两步澄清除杂，第一步采用ZTC(1+1)澄清剂除杂，先按照溶液体积4％的量在浓缩液中加入B组分液，边加边搅拌，见到有大块絮状沉淀生成，再按照溶液体积2％的量加入A组分液，边加边搅拌，加完后继续搅拌2min，静置冷藏24h，倾出上清液并抽滤，下层药液用8层纱布滤除较大的胶质沉淀，取清液抽滤备用；

A、B组分液的配制方法为：将A组分用水配成浓度1％的水溶液，配制方法为先在A组分中加入少量的水，搅成糊状，再加入需要量的水，混合均匀后静置溶胀24h，后用双层纱布过滤备用，得A组分液；B组分用1％醋酸配成浓度1％的溶液即可，配制方法同A组分，得B组分液；

第二步澄清除杂采用壳聚糖吸附剂，先将壳聚糖用1％醋酸配成浓度1％的壳聚糖溶液，再将壳聚糖溶液与第一步澄清除杂所得清液混合(用量比为1mL清液:0.05mL壳聚糖溶液)，升温至40℃(除杂效果更好)，静置1.5h后离心，分离出清液，即为澄清液；

将澄清液浓缩至90℃下相对密度1.05，得到浓缩液B；

在浓缩液B中加入浓度95％的乙醇，使含醇量达80％，搅拌后静置12h，分离出沉淀，沉淀除去溶剂(包括乙醇和水)，即得黄芪多糖粉末。

黄芪多糖口服液的制备方法，包括以下步骤：

1)将上述黄芪多糖粉末溶于5倍量(质量)的水中，过滤备用；

2)在滤液中加入0.1％的亚硫酸氢钠和0.25％的苯甲酸钠，并用氢氧化钠调节溶液pH值为6.5，过滤，灌装，最后于100℃下灭菌30min，即得。

实施例2

黄芪多糖的提取方法，包括以下步骤：

1)将黄芪用超微粉碎机粉碎至粒度3～5μm，得到黄芪粉末；

2)采用闪式提取法，在黄芪粉末中加入浓度0.07‰的氧化钙水溶液(pH 9.5)，每克黄芪粉末加入9mL氧化钙水溶液，混合均匀后置于闪式提取器内，设置电机电压200V，提取温度55℃，提取时间2.5min；

提取完毕，分离出药渣，重复上述提取操作3次，合并提取液备用；

3)将提取液浓缩至90℃下相对密度1.07，得到浓缩液A；

取浓缩液A，分两步澄清除杂，第一步采用ZTC(1+1)澄清剂除杂，先按照溶液体积4％的量在浓缩液中加入B组分液，边加边搅拌，见到有大块絮状沉淀生成，再按照溶液体积2％的量加入A组分液，边加边搅拌，加完后继续搅拌3min，静置冷藏24h，倾出上清液并抽滤，下层药液用8层纱布滤除较大的胶质沉淀，取清液抽滤备用；

A、B组分液的配制方法同实施例1；

第二步澄清除杂采用壳聚糖吸附剂，先将壳聚糖用1％醋酸配成浓度5％的壳聚糖溶液，再将壳聚糖溶液与第一步澄清除杂所得清液混合(用量比为1mL清液:0.06mL壳聚糖溶液)，升温至50℃，静置2h后离心，分离出清液，即为澄清液；

将澄清液浓缩至90℃下相对密度1.15，得到浓缩液B；

在浓缩液B中加入浓度95％的乙醇，使含醇量达80％，搅拌后静置12h，分离出沉淀，沉淀除去溶剂(包括乙醇和水)，即得黄芪多糖粉末。

黄芪多糖口服液的制备方法，包括以下步骤：

1)将上述黄芪多糖粉末溶于7倍量(质量)的水中，过滤备用；

2)在滤液中加入0.2％的亚硫酸钠和0.2％的山梨酸钾，并用盐酸调节溶液pH值为6.5，过滤，灌装，最后于100℃下灭菌30min，即得。

实施例3

黄芪多糖的提取方法，包括以下步骤：

1)将黄芪用超微粉碎机粉碎至粒度8～10μm，得到黄芪粉末；

2)采用闪式提取法，在黄芪粉末中加入浓度0.1‰的氧化钙水溶液(pH 10.0)，每克黄芪粉末加入10mL氧化钙水溶液，混合均匀后置于闪式提取器内，设置电机电压200V，提取温度60℃，提取时间2min；

提取完毕，分离出药渣，重复上述提取操作2次，合并提取液备用；

3)将提取液浓缩至90℃下相对密度1.08，得到浓缩液A；

取浓缩液A，分两步澄清除杂，第一步采用ZTC(1+1)澄清剂除杂，先按照溶液体积4％的量在浓缩液中加入B组分液，边加边搅拌，见到有大块絮状沉淀生成，再按照溶液体积2％的量加入A组分液，边加边搅拌，加完后继续搅拌2.5min，静置冷藏24h，倾出上清液并抽滤，下层药液用8层纱布滤除较大的胶质沉淀，取清液抽滤备用；

A、B组分液的配制方法同实施例1；

第二步澄清除杂采用壳聚糖吸附剂，先将壳聚糖用1％醋酸配成浓度6％的壳聚糖溶液，再将壳聚糖溶液与第一步澄清除杂所得清液混合(用量比为1mL清液:0.07mL壳聚糖溶液)，升温至40℃，静置2h后离心，分离出清液，即为澄清液；

将澄清液浓缩至90℃下相对密度1.12，得到浓缩液B；

在浓缩液B中加入浓度95％的乙醇，使含醇量达80％，搅拌后静置12h，分离出沉淀，沉淀除去溶剂(包括乙醇和水)，即得黄芪多糖粉末。

黄芪多糖口服液的制备方法，包括以下步骤：

1)将上述黄芪多糖粉末溶于8倍量(质量)的水中，过滤备用；

2)在滤液中加入0.5％的维生素C和0.1％的复合尼泊金酯钠，并用乳酸调节溶液pH值为6.5，过滤，灌装，最后于100℃下灭菌30min，即得。

对比利1

黄芪多糖的提取操作同专利CN103848918A中实施例1。口服液制备方法同实施例1。

对比利2

黄芪多糖的提取操作基本同实施例1，区别仅在于黄芪采用一般粉碎设备粉碎，过40目筛后进行闪式提取。口服液制备方法同实施例1。

对比例3

黄芪多糖的提取操作基本同实施例1，区别仅在于用ZTC(1+1)澄清除杂后不使用壳聚糖二次除杂，清液浓缩后醇沉，除溶剂，得到黄芪多糖粉末。口服液制备方法同实施例1。

对比例4

黄芪多糖的提取操作基本同实施例1，区别仅在于不使用ZTC(1+1)澄清除杂，仅采用壳聚糖吸附除杂，澄清液浓缩后醇沉，除溶剂，得到黄芪多糖粉末。口服液制备方法同实施例1。

对比例5

黄芪多糖的提取操作基本同实施例1，区别仅在于不进行澄清除杂处理，仅采用醇沉法除杂，醇沉后除溶剂，得到黄芪多糖粉末。口服液制备方法同实施例1。

试验例

1)黄芪多糖得率测定

测定实施例1～3及对比例1～2中黄芪多糖的提取率，结果见下表1。

表1不同提取方法对应黄芪多糖的提取率

由表1可知，实施例1～3中黄芪多糖的提取率明显高于对比例1～2，表明超微粉碎与闪式提取相结合的提取方法能显著提高黄芪多糖的提取效率。

2)黄芪多糖纯度测定

测定实施例1～3及对比例3～5中黄芪多糖的纯度，结果见下表2。

表2不同除杂方法对应黄芪多糖的纯度

由表2可知，实施例1～3中黄芪多糖的纯度明显高于对比例3～5，表明分步澄清除杂与醇沉提取相结合能显著提高黄芪多糖的提取纯度。

3)口服液稳定性测试

取实施例1～3中黄芪多糖口服液，于40℃下放置6个月进行加速试验，发现均无析出、变浑现象，表明溶液的稳定性较好。