一种利用UPLC‑TUV快速检测桑椹花青素及黄酮的方法

技术领域

本发明属于桑椹花青素及黄酮的检测技术领域，具体涉及一种利用UPLC-TUV快速检测桑椹花青素及黄酮的方法。

背景技术

桑葚为桑树成熟时的果实，含多种营养和药用成分，作为传统中药，具有补血滋阴，生津润燥，用于治疗眩晕耳鸣，心悸失眠，须发早白，津伤口渴，内热消渴，血虚便秘等。现代植物化学研究证实桑椹含有生物碱、黄酮、多酚、多糖等多种活性成分，具有降血糖、抗氧化、抗肿瘤等药理作用。

桑椹中含有极为丰富的花青素及黄酮类成分，花青素及黄酮都属于多羟基类化合物，因而具有良好的生物活性。研究发现，大多深色水果都含有丰富的花青素及黄酮类成分，具有包括抗炎、抗肿瘤、降血糖、抗辐射、抗菌抗病毒、保护肝脏等药理活性。因此，花青素和黄酮的研究越来越受到关注。

目前对植物花青素及黄酮的定性定量检测方法大多为高效液相色谱法，但此方法耗时相对较长且对特定的几类矢车菊素类花青素达不到有效分离。与传统的HPLC相比，UPLC使用小颗粒填料、极低系统体积及快速检测手段等全新技术，提高了分离能力，缩短了分析时间，重现性好，也降低了溶剂使用成本。

目前未见利用超高液相色谱法对桑椹花青素和多种黄酮进行同时分离并快速检测的报道。本发明利用UPLC-TUV对桑椹进行分析，7min内完成分离并检测，耗时短，分离效果佳。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用UPLC-TUV快速检测桑椹花青素及黄酮的方法，本方法可同时分离检测桑椹花青素及黄酮，且快速，灵敏，分离度高，重复性好。

为实现上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

一种利用UPLC-TUV快速检测桑椹中花青素及黄酮的方法，采用如下色谱条件：

色谱柱：C18色谱柱，其规格为1～2.1mm×50～100mm，1.7μm～2.7μm；

流动相：流动相包括流动相A和流动相B，按质量分数计，所述流动相A为0.1～1％的磷酸溶液，所述流动相B为含0.1～1％磷酸，30-50％乙腈的溶液；

梯度模式：0-3min，流动相中含有质量分数为20-27％的流动相B；3-6.5min，流动相中含有质量分数为27-84％B；6.5-7min，流动相中含有质量分数为84-20％B；

流速：0.15～0.19mL/min；

检测波长：520nm和358nm；

柱温：30～40℃。

优选的，所述色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱，其规格为1mm×100mm，1.7μm。

优选的，按质量分数计，所述流动相A为0.2％磷酸溶液，所述流动相B为含0.2％磷酸，40％乙腈的溶液。

优选的，所述流速为0.17mL/min，所述柱温为40℃。

所述的方法，通过以下步骤实现：

(1)样品溶液准备：将桑椹烘干至恒重，粉碎至小于60目，以粉末与乙醇的质量体积比(g/mL)为1:10将粉末与质量分数为38％的乙醇混合，然后在温度为60℃，功率500W条件下将混合物超声萃取两次，15min/次，分别将每次的混合液4000×g常温离心15min，合并上清液，将上清液过0.22μm PVDF膜，备供试样品溶液用；

(2)标准品溶液准备：分别取矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-芸香苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷、芦丁、异槲皮素、桑色素、槲皮素、山奈酚标准品用母液稀释分别配制成标品溶液，在温度为4℃条件下保存，所述母液为含0.2％磷酸，40％乙腈的溶液；

(3)取相同体积的供试标品和样品溶液，按照所述的条件进行UPLC-TUV分析。

本发明的有益效果在于：本发明公开了一种利用UPLC-TUV快速检测桑椹中花青素及黄酮的方法，通过一定流速及比例梯度洗脱的方式，本方法可同时分离检测桑椹花青素及黄酮，且快速，灵敏，分离度高，重复性好。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1表示花青素和黄酮混合标准品及药桑椹样品的UPLC色谱重叠图，其中a表示花青素，b黄酮。

具体实施方式

下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

1.仪器与试剂

1.1仪器

DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱，上海齐欣科学仪器有限公司；FA2004B电子天平，上海精天电子仪器有限公司；GX-03 150g功能粉碎机，浙江高鑫工贸有限公司；KQ-500DV数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；CT15RE冷冻离心机，日本Hitachi公司；Milli-Q system，美国Millipore公司；Acquity UPLC I-Class system，美国Waters公司。

1.2试剂

矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(>98％)、矢车菊素-3-O-芸香苷(>98％)、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷(>98％)、色谱级甲酸铵、醋酸氨、甲酸、醋酸均购于sigma公司；芦丁(>98％)、异槲皮素(>98％)、桑色素(>98％)、槲皮素(>98％)、山奈酚(>98％)购于成都克洛玛生物科技有限公司；色谱级乙腈、甲醇购于美国Thermo Fisher Scientific；色谱级磷酸购于渝北新亚；其他试剂均为国产分析纯。

2色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(1mm×100mm，1.7μm)，柱温40℃。

流动相：按质量分数计，A-0.2％磷酸溶液，B-含0.2％磷酸，40％乙腈的溶液。

梯度模式：0-3min，20-27％B；3-6.5min，27-84％B；6.5-7min，84-20％B。

流速：0.17mL/min。

进样及波长：进样1μL，检测波长520nm和358nm。

3标准溶液制备

标准储备液由矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(C3G)、矢车菊素-3-O-芸香苷(C3R)、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷(Pg3G)、芦丁(Ru)、异槲皮素(Isoq)、桑色素(Mh)、槲皮素(Qu)、山奈酚(Ka)8种类黄酮标准品组成，配各单个标准品母液浓度均为1mg/mL，4℃条件下保存，检测用工作液由母液取特定量混合，进一步稀释得到，所述母液为含0.2％磷酸，40％乙腈的溶液。

4样品制备

采集成熟药桑、鸡桑、珍珠白果实，适当风干，然后置于60℃烘箱，分别烘干至恒重，粉碎为干粉，过60目筛，取干粉按照38％乙醇，60℃，料液比1:10，超声功率500W萃取两次，15min/次，4000×g常温离心15min，合并上清，取部分样过0.22μm PVDF膜待测。

5线性关系考察及结果

取制备好的花青素与黄酮混合标准品溶液依次稀释为8个浓度梯度，按上述色谱方法，连续进样3次检测，测定峰面积，以标准品峰面积(y)对浓度(x)做回归分析。方程及结果见表1所示，结果表明线性关系良好，然后进一步检测药桑、鸡桑、珍珠白桑椹中花青素及黄酮含量，得到如图1所示的UPLC色谱重叠图：

表1药桑、鸡桑、珍珠白桑椹中花青素及黄酮的检测(n＝3)

注：RT，保留时间；ND，未检测到。

由表1可看出，结果表明线性关系良好，并且本方法可同时分离桑椹花青素及黄酮，且快速，灵敏，分离度高，重复性好。

图1表示花青素和黄酮混合标准品及药桑椹样品的UPLC色谱重叠图，其中a表示花青素，b表示黄酮，由图1可表明，此方法能够在7min内同时分离药桑椹中的3种花青素及5种黄酮，且分离度好。

6分析条件的确定

6.1色谱柱的确定

以0.2％磷酸溶液和0.2％磷酸乙腈溶液为流动相，分别选用ACQUITY UPLC BEH C18(1mm×100mm，1.7μm)、BEH C18(2.1mm×100mm，1.7μm)、BEH C18(2.1mm×50mm，1.7μm)、HSS T3(1mm×100mm，1.7μm)、HSS T3(2.1mm×50mm，1.7μm)、CORTECS C18(2.1×100mm,2.7μm)色谱柱，进行梯度洗脱检测。

结果BEH C18(1mm×100mm，1.7μm)柱分离效果较好。

6.2柱温的确定

分别选择柱温为常温、30℃、35℃、40℃进行梯度洗脱检测。

结果40℃分离效果较好。

6.3流动相流速的确定

分别选用洗脱流速0.15、0.17、0.19mL/min，进行恒定流速梯度洗脱检测。

结果洗脱流速为0.17mL/min时分离效果较好。

6.4流动相中缓冲盐或酸性调节剂的确定

分别选用水、磷酸二氢钾、甲酸铵、醋酸氨、甲酸、醋酸、磷酸作为水相或有机相酸碱调节剂，进行梯度洗脱检测。

结果磷酸作为酸性调节剂时分离效果较好。

6.5磷酸比例的确定

分别选用0.1、0.2、0.3、1％磷酸作为水相流动相进行梯度洗脱检测。

结果0.2％磷酸分离效果较好。

6.6洗脱梯度的确定

分别选用5-100％乙腈作为有机相，并在0-15min内进行梯度洗脱检测。

结果有机溶剂在30-50％乙腈作为有机溶剂流动相效果较好，尤以0.2％磷酸溶液和含0.2％磷酸的40％乙腈溶液作为流动相，在洗脱程序为0-3min，20-27％B；3-6.5min，27-84％B；6.5-8min，84-20％B分离效果最好。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。