双吲哚-三肽衍生物,其合成,抗血栓活性和制备抗血栓剂的应用

发明领域

本发明涉及Leu-Asp-Val修饰的双吲哚乙酸，即2，2’-双(1H-吲哚-3-乙酰-Leu-Asp-ValA-2-基)-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-甲烷，涉及它的合成，涉及它的抗血栓活性，因而本发明涉及它作为抗血栓抑制剂的临床应用前景。本发明属于生物医药领域。

背景技术

吲哚乙酸的衍生物吲哚美辛(Indomethacin)除具有抗炎以及解热镇痛作用外，还可以通过抑制血栓素TXA2的合成而抑制血小板的聚集。我们的前期发明披露，通式II的双吲哚衍生物(式中AA为氨基酸残基)在1nml/kg口服剂量下具有抗血栓活性。在急性毒性研究中，发明人发现剂量通式II的双吲哚衍生物的不能溶解。在通式II的双吲哚衍生物的代谢研究中，发明人发现大鼠的粪便中含较高量通式II的双吲哚衍生物。这些发现使发明人认识到，提高双吲哚衍生物的生物利用度至关重要。

经过3年摸索，终于发现将通式II的乙基用3-羟基-4-甲氧基苯基代替，乙酰-AA用乙酰-Leu-Asp-Val替代可以达到改善生物利用度的目标。于是，发明人提出来本发明。

发明内容

本发明的第一个内容是提供下式Leu-Asp-Val修饰的双吲哚乙酸，即2，2’-双(1H-吲哚-3-乙酰-Leu-Asp-ValA-2-基)-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-甲烷。

本发明的第二个内容是提供2，2’-双(1H-吲哚-3-乙酰-Leu-Asp-ValA-2-基)-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-甲烷的合成方法，该方法包括：

(1)吲哚乙酸在乙醇中经浓硫酸催化，与异香草醛进行Pictet-Spengler缩合，生成2，2’-双(1H-吲哚-3-乙酸乙酯-2-基)-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-甲烷；

(2)2，2’-双(1H-吲哚-3-乙酸乙酯-2-基)-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-甲烷在NaOH溶液(4N)中皂化反应生成2，2’-双(1H-吲哚-3-乙酸-2-基)-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-甲烷；

(3)按照标准接肽方法制备Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl；

(4)2，2’-双(1H-吲哚-3-乙酸-2-基)-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-甲烷与Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl偶联得到2，2’-双(1H-吲哚-3-乙酰-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl-2-基)-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-甲烷；

(5)2，2’-双(1H-吲哚-3-乙酰-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl-2-基)-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-甲烷在甲醇中Pd/C催化氢解生成2，2’-双(1H-吲哚-3-乙酰-Leu-Asp-Val-2-基)-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-甲烷。

本发明的第三个内容是评价2，2’-双(1H-吲哚-3-乙酰-Leu-Asp-Val-2-基)-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-甲烷的抗栓活性。

附图说明

图1 2，2’-双(1H-吲哚-3-乙酰-Leu-Asp-Val-2-基)-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-甲烷的合成路线.i)HOBt，DCC，NMM；ii)2N NaOH；iii)4N氯化氢-乙酸乙酯溶液；iv)Pb/c，H₂，甲醇。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备2，2’-双(1H-吲哚-3-乙酸乙酯-2-基)-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-甲烷(1)

1g(5.71mmol)吲哚-3-乙酸溶于40ml无水乙醇，滴加1ml浓硫酸，活化20min。加500mg(3.29mmol)3-羟基4-甲氧基苯基醛，室温反应6h，减压浓缩至干。柱层析纯化(石油醚/丙酮＝9/1-5/1)，得到870mg(57％)标题化合物，为淡黄色糖浆。ESI/MS(m/e)：541[M+H]⁺；¹HNMR(300MHz，CDCl₃)：δ＝8.40(s，2H)，7.55(m，2H)，7.34(m，2H)，7.13(m，4H)，6.78(m，3H)，6.15(m，1H)，4.18(m，4H)，3.83(s，3H)，3.56(m，4H)，1.30(m，6H)。

实施例2制备2，2’-双(1H-吲哚-3-乙酸-2-基)-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-甲烷(2)

200mg(0.37mmol)2，2’-双(1H-吲哚-3-乙酸乙酯-2-基)-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-甲烷(1)溶于5ml丙酮，4N NaOH调pH＝12。室温反应6h。冰浴下用饱和KHSO₄调pH＝7，减压浓缩除去丙酮后，用饱和KHSO₄调pH＝2，水层用50ml乙酸乙酯萃取3遍，合并乙酸乙酯层，用饱和NaCl洗至中性，无水Na₂SO₄干燥。减压过滤，滤液减压浓缩至干，得到172mg(98％)标题化合物，为紫色粉末。ESI/MS(m/e)：483[M-H]^-；¹HNMR(300MHz，DMSO-d6)：δ＝8.40(s，2H)，7.55(m，2H)，7.34(m，2H)，7.13(m，4H)，6.78(m，3H)，6.15(m，1H)，3.83(s，3H)，3.56(m，4H)。

实施例3制备Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl

将808mg(2.5mmol)Boc-Asp(OBzl)溶于20ml无水THF中，冰浴下加入338mg(2.5mmol)HOBt和619mg(3mmol)DCC，活化30min。往里加558mg(2.3mmol)HCl·Val-Obzl，用N-甲基吗啉调节反应液pH至9，室温反应8h，原料点消失。滤除DCU，减压浓缩得到的油状物用乙酸乙酯溶解，依次用40ml饱和NaHCO₃溶液洗3次，40ml饱和NaCl溶液洗3次，40ml饱和KHSO₄洗3次，40ml饱和NaCl溶液洗3次，40ml饱和NaHCO₃洗3次，40ml饱和NaCl溶液洗3次，乙酸乙酯层用Na₂SO₄干燥12h，滤除Na₂SO₄，滤液减压浓缩，得到1.12g(93％)标题化合物，为无色油状液体。ESI-MS(m/z)：512.4[M+H]⁺。

实施例4制备HCl·Asp(OBzl)-Val-OBzl

将1.28g(2.5mmol)Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl溶于少量的干燥乙酸乙酯中，冰浴下加入15ml氯化氢-乙酸乙酯溶液(4N)搅拌3h，原料点消失后减压浓缩，残留物用无水乙醚析晶，得到的目标化合物化合物直接用于下步反应。

实施例5制备Boc-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl

将575mg(2.5mmol)Boc-Leu溶于20mL无水THF中，冰浴下加入338mg(2.5mmol)HOBt和619mg(3mmol)DCC，反应液活化30min。往里加入1.03g(2.3mmol)HCl·Asp(OBzl)-Val-OBzl，用N-甲基吗啉调反应液pH至9，室温搅拌8h。原料点消失后滤除DCU，减压浓缩得到的油状物用100mL乙酸乙酯溶解，依次用40ml饱和NaHCO₃洗3次，40ml饱和NaCl溶液洗3次，40ml饱和KHSO₄洗3次，40ml饱和NaCl溶液洗3次，40ml饱和NaHCO₃洗3次，40ml饱和NaCl溶液洗3次，乙酸乙酯层用Na₂SO₄干燥12h。滤除Na₂SO₄，滤液减压浓缩得到1.24g(83％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：626[M+H]⁺。

实施例6制备HCl·Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl

将1.56g(2.5mmol)Boc-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl溶于少量无水乙酸乙酯中，冰浴下加入20ml氯化氢-乙酸乙酯溶液(4N)搅拌3h，原料点消失后减压浓缩，残留物用无水乙醚析晶，得到的目标化合物化合物直接用于下步反应。

实施例7制备2，2’-双(1H-吲哚-3-乙酰-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl-2-基)-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-甲烷(3)

将1g(2.07mmol)2，2’-双(1H-吲哚-3-乙酸-2-基)-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-甲烷(2)溶于50ml无水THF中，冰浴下加入586mg(4.35mmol)HOBt和937mg(4.55mmol)DCC，反应液活化30min。往里加2.38g(4.55mmol)HCl·Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl，用N-甲基吗啉调反应液pH至9，室温搅拌反应8h。原料点消失后滤除DCU，减压浓缩，得到的油状物用100ml乙酸乙酯溶解。溶液依次用40ml饱和NaHCO₃洗3次，40ml饱和NaCl溶液洗3次，40ml饱和KHSO₄洗3次，40mL饱和NaCl溶液洗3次，40ml饱和NaHCO₃洗3次，40mL饱和NaCl溶液洗3次，乙酸乙酯层用Na₂SO₄干燥12h。滤除Na₂SO₄，滤液减压浓缩，得到1.70g(55％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：1499[M+H]⁺；Mp>(c＝0.08，CH₃OH).¹HNMR(300MHz，CDCl₃)：δ＝10.6(s，1H)，10.09(s，1H)，7.39(m，26H)，7.12(m，6H)，6.58(m，2H)，6.25(m，1H)，6.23(m，2H)，5.96(s，1H)，5.79(s，1H)，5.10(m，8H)，4.89(m，1H)，4.79(m，1H)，4.49(m，4H)，3.85(s，3H)，3.55(m，3H)，3.18(m，1H)，2.88(m，4H)，2.15(m，2H)，1.59(m，6H)，0.83(m，24H)。

实施例8制备2，2’-双(1H-吲哚-3-乙酰-Leu-Asp-Val-2-基)-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-甲烷(4)

将50mg(0.03mmol)2，2’-双(1H-吲哚-3-乙酰-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl-2-基)-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-甲烷(3)溶于20ml甲醇，加10mg Pd/C，通入氢气。TLC(石油醚∶丙酮1.5∶1)检测原料点消失，减压过滤，浓缩至干，得到30mg(79％)标题化合物，为紫色粉末。ESI-MS(m/z)：1138[M+H]⁺；Mp>(c＝0.10，CH₃OH).¹HNMR(300MHz，DMSO-d6)：δ＝12.49(s，2H)，11.57(s，1H)，10.90(m，1H)，8.49(m，2H)，8.42(m，2H)，7.59(m，4H)，7.29(m，1H)，7.20(s，1H)，6.99(s，2H)，6.93(m，2H)，6.79(m，1H)，6.59(s，1H)，6.42(m，1H)，6.19(s，1H)，4.63(m，2H)，4.40(m，2H)，4.13(m，2H)，3.72(s，3H)，3.56(m，4H)，3.13(m，2H)，2.73(dd，J＝16.5，6Hz，2H)，2.04(m，2H)，1.54(m，2H)，1.44(m，4H)，0.79(m，24H)。

实施例9评价4d1抗血栓活性

1)聚乙烯管的组装：将聚乙烯管拉成一端为斜口的细管，定长为10.0cm，分别为右经静脉(管径较粗)及左颈动脉(管径较细)插管；中段聚乙烯管定长为8.0cm，血栓线压在颈动脉插管方向，插管前需在管中充满肝素。

2)SD大鼠以0.1nmol/kg剂量4灌胃，30分钟后腹腔注射20％的乌拉坦进行麻醉。仰卧位将大鼠固定于鼠板上，剪开颈部皮肤，分离右颈总动脉及左颈静脉，血管下压线，结扎远心端，静脉靠远心端处剪一小口，进行静脉端插管，注射肝素，系线固定，再用动脉夹夹住动脉近心端，靠近远心端方向剪一小口，进行动脉端结扎，系线固定后松开动脉夹，建立体外循环旁路。循环15分钟后先剪断静脉端观察血液循环是否正常，若正常从动脉端取出血栓线，在纸上沾干浮血后称量并记录其湿重，大鼠断颈处死。每组大鼠10只，最后进行数据统计并评价化合物活性。以栓重表示化合物的活性。表1的数据表明，4具有优秀的抗血栓活性，有效剂量低达0.1nmol/kg，比发明入先前公开的双吲哚化合物的有效剂量低10倍，获得了显著的技术效果。此外，4的有效剂量是阿司匹林的1/1670000。

表1化合物4对SD大鼠栓重的影响

n＝10；a)与生理盐水比，p＜0.01；b)与生理盐水比p＜0.01，与阿司匹林比，p＞0.05。