一种低分子肝素分子量及分子量分布检测方法

技术领域

本发明涉及一种药物的检测方法，特别涉及一种抗凝血药物低分子肝素的分子量及分子量分布检测方法。

背景技术

低分子肝素是由普通肝素解聚制备而成的一类分子量较低的肝素的总称。平均分子量4000～6000，根据分子量、链末端结构和化合物结合盐类的不同，可以分为不同的商品制剂，目前中国市场上使用的主要有达肝素钠、依诺肝素钠和那曲肝素钙，均为无色或淡黄色的澄明液体。

低分子肝素具有以下药物作用

(1)预防深部静脉血栓形成和肺栓塞。

(2)治疗已形成的急性深部静脉血栓。

(3)在血液透析或血液透过时，防止体外循环系统中发生血栓或血液凝固。

(4)治疗不稳定性心绞痛及非ST段抬高心肌梗死。

低分子肝素(LMWH)的分子量测定有多种方法，如粘度法、高效液相色谱法和梯度聚丙烯醉胺凝胶电泳法等，也有采用采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定低分子肝素分子量及其分布，色谱柱为Shodex Asahipak GF-510HQ(7.6mm×300mm)或TSK G3000SWxl(7.8mm×300mm),理论塔板数以葡萄糖峰计算分别为15 206和15 731；柱温35℃；流速0.5ml.min-1；示差折光检测器和二极管阵列检测器联用，检测波长为234nm。该方法具有简便、快速和重现性好等特点，适合于该类药物的质量控制。

中国药典公开了以下方法：

流动相的配制：称取无水硫酸钠28.4g置于烧杯中，加纯化水约900ml溶解，用稀硫酸调pH至5.0，纯化水定容到1000ml，经0.22um的滤膜过滤，可根据所需的量成比例配制，每天使用时必须观察流动相的外观，并经0.22um的滤膜过滤进行过滤，如发现浑浊应弃去，重新配制。

低分子肝素钠标准品溶液：称取低分子肝素钠标准品约20mg，加入流动相溶解成10mg/ml的标准溶液，一次性0.22um过滤膜过滤到样品瓶中，贴好标识。将标准溶液用封口膜封口，冷冻保存。使用前取出平衡至室温并混匀再使用。

样品溶液的配制：称取样品约20mg，加入流动相溶解成10mg/ml的样品溶液，一次性0.22um过滤膜过滤到样品瓶中，贴好标识。

0.01％叠氮钠溶液的配制：称取叠氮钠10mg置于烧杯中，加纯化水约90ml溶解，用超纯水定容到100ml，使用前用0.22um的滤膜过滤。

分子量校准标准溶液的配制：称取低分子肝素分子量校准标准品10mg，加入已过滤的流动相溶解成10mg/ml的校准溶液。将校准溶液分装到若干个内插管中，每支装入约150ul。将分装好的溶液用封口膜封口，冷冻保存。使用前取出平衡至室温并混匀再使用。

色谱条件：

上述方法操作复杂，周期长，效率低，分辨率低同时准确性和灵敏度有待提高。

发明内容

本发明提供一种低分子肝素分子量及分子量分布检测方法，采用高效液相色谱法，所述方法步骤如下：

步骤1，低分子肝素钠标准品溶液的配制：

步骤2，低分子肝素钠分子量校准标准溶液的配制：

步骤3，供试品溶液的配制：

步骤4，0.01％叠氮钠溶液配制：

步骤5，将上述0.01％叠氮钠溶液，低分子肝素钠标准品溶液，低分子肝素钠分子量校准标准溶液以及供试品溶液分别注入高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图计算供试品的分子量和得出分子量分布结果。

优选的，本发明所述的检测方法，步骤如下：

步骤1，低分子肝素钠标准品溶液的配制：称取低分子肝素钠标准品约18-22mg，加入流动相溶解成8-12mg/ml的标准溶液，一次性0.2-0.24um过滤膜过滤到样品瓶中，贴好标识，将标准溶液用封口膜封口，冷冻保存，使用前取出平衡至室温并混匀再使用，

步骤2，低分子肝素钠分子量校准标准溶液的配制：称取低分子肝素钠分子量校准标准品8-12mg，加入已过滤的流动相溶解成8-12mg/ml的校准溶液，将校准溶液分装到若干个内插管中，每支装入145-155ul，将分装好的溶液用封口膜封口，冷冻保存，使用前取出平衡至室温并混匀再使用，

步骤3，供试品溶液的配制：称取样品18-22mg，加入流动相溶解成8-12mg/ml的样品溶液，一次性0.2-0.24um过滤膜过滤到样品瓶中，贴好标识，

步骤4，0.008-0.012％叠氮钠溶液配制：称取叠氮钠48-52mg于480-520mL容量瓶中，加流动相溶解定容，摇匀即得，

步骤5，将上述0.008-0.012％叠氮钠溶液，低分子肝素钠标准品溶液，低分子肝素钠分子量校准标准溶液以及供试品溶液分别注入高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图计算供试品的分子量和得出分子量分布结果，

其中所述高效液相色谱的色谱条件如下：

流动相：25～75mM醋酸铵溶液

洗脱方式：等度洗脱。

最优选的，本发明所述的检测方法，步骤如下：

步骤1，低分子肝素钠标准品溶液的配制：称取低分子肝素钠标准品约20mg，加入流动相溶解成10mg/ml的标准溶液，一次性0.22um过滤膜过滤到样品瓶中，贴好标识，将标准溶液用封口膜封口，冷冻保存，使用前取出平衡至室温并混匀再使用，

步骤2，低分子肝素钠分子量校准标准溶液的配制：称取低分子肝素钠分子量校准标准品10mg，加入已过滤的流动相溶解成10mg/ml的校准溶液，将校准溶液分装到若干个内插管中，每支装入约150ul，将分装好的溶液用封口膜封口，冷冻保存，使用前取出平衡至室温并混匀再使用，

步骤3，供试品溶液的配制：称取样品约20mg，加入流动相溶解成10mg/ml的样品溶液，一次性0.22um过滤膜过滤到样品瓶中，贴好标识，

步骤4，0.01％叠氮钠溶液配制：称取叠氮钠50mg于500mL容量瓶中，加流动相溶解定容，摇匀即得，

步骤5，将上述0.01％叠氮钠溶液，低分子肝素钠标准品溶液，低分子肝素钠分子量校准标准溶液以及供试品溶液分别注入高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图计算供试品的分子量和得出分子量分布结果，

其中所述高效液相色谱的色谱条件如下：

流动相：25～75mM醋酸铵溶液

洗脱方式：等度洗脱。

本发明的方法是经过筛选获得的，筛选过程如下：

色谱柱选择：仅使用一根Waters Acquity uplc BEH 125SEC,4.6*150mm 1.7um色谱柱运行该方法，能把样品中分子量较小部分很好的分离开，分析时间缩短，但校准曲线的相关性不高，检测结果与药典方法差别较大。若仅使用一根Waters Acquity uplc APC200,4.6*150mm 2.5um色谱柱运行该方法，能把样品中分子量较大部分很好的分离开，分析时间缩短，但同样校准曲线的相关性不高，检测结果与药典方法差别较大。最终采用两根色谱柱联用的方式，可得到较好的分离效果，同时检测结果也准确。

流动相浓度的选择：在方法开发过程中，考察了流动相浓度对方法的影响，分别使用25mM醋酸铵溶液、50mM醋酸铵溶液、75mM醋酸铵溶液作为淋洗液进行低分子肝素分子量及分子量分布方法的检测。发现检测结果没有明显差别，但是色谱峰的分离度随着浓度增加有变好的趋势。

方法学验证:

方法的专属性：空白溶液在分子量校准标准品及低分子肝素钠标准品溶液的保留时间内无色谱峰出现。

准确度：采用本方法检测得到的低分子肝素标准品重均分子量与标示值或药典方法检测值的绝对差值均≤150Da。

重复性：单个检验员做的6针低分子肝素的重均分子量最大与最小的差值≤150Da,分子量大于8000(＞M8000)的组分重量百分比的RSD≤2％，分子量小于2000(＜M2000)的组分重量百分比的RSD≤2％，分子量介于8000到2000(M8000～2000)的组分重量百分比RSD≤2％。

中间精密度：两名检验员12针低分子肝素的重均分子量最大与最小的差值≤150Da,分子量大于8000(＞M8000)的组分重量百分比的RSD≤2％，分子量小于2000(＜M2000)的组分重量百分比的RSD≤2％，分子量介于8000到2000(M8000～2000)的组分重量百分比RSD≤2％。

验证结论：本方法能够准确、稳定、高效的检测出低分子肝素的重均分子量及分子量分布。

本发明的有益效果

本发明采用高效液相色谱法进行测定，高效快速，稳定性好，灵敏度高。

本发明的和现有技术比较，优点是：

附图说明

图1药典方法得到的色谱图

图2本发明方法得到的色谱图

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明。

实施例1

步骤1，低分子肝素钠标准品溶液的配制：称取低分子肝素钠标准品约20mg，加入流动相溶解成10mg/ml的标准溶液，一次性0.22um过滤膜过滤到样品瓶中，贴好标识。将标准溶液用封口膜封口，冷冻保存。使用前取出平衡至室温并混匀再使用。

步骤2，低分子肝素钠分子量校准标准溶液的配制：称取低分子肝素钠分子量校准标准品10mg，加入已过滤的流动相溶解成10mg/ml的校准溶液。将校准溶液分装到若干个内插管中，每支装入约150ul。将分装好的溶液用封口膜封口，冷冻保存。使用前取出平衡至室温并混匀再使用。

步骤3，供试品溶液的配制：称取样品约20mg，加入流动相溶解成10mg/ml的样品溶液，一次性0.22um过滤膜过滤到样品瓶中，贴好标识。

步骤4，将上述低分子肝素钠标准品溶液，低分子肝素钠分子量校准标准溶液以及供试品溶液分别注入高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图计算供试品的分子量和得出分子量分布结果。

结果是：