一种口腔黏膜下纤维化小鼠模型的构建方法

技术领域

本发明涉及一种医学领域，尤其涉及一种通过给药方式以及给药剂量的过程，构建一种口腔黏膜下纤维化小鼠模型的方法。

背景技术

口腔黏膜下纤维化(oral submucous fibrosis，OSF)是一种慢性、隐匿性、具有恶变倾向的口腔黏膜病，可以发生口腔黏膜的任何部分。追踪研究显示，口腔黏膜下纤维化随着槟榔的商业化发展，发病率逐年增加，但是目前临床针对OSF尚无好的治疗方法。因此OSF模型的研究一直受到重视。现今国内外关于OSF的动物模型研究的报道极少，极大的制约了OSF研究的进一步深入。1960年，Sirsat等采用2％的辣椒素在大鼠腭黏膜进行表面涂诱发出了OSF样病变。但其病理表现欠典型，且无明显的临床表现。另有国内外学者都通过在颊黏膜进行注射和表面涂布槟榔提取液的方式诱发了大、小鼠OSF，但是方法繁琐且时间过长，基本都在600天以上，而且均未见明显的后期玻璃样变。因此，现有的OSF动物模型的构建难以模拟人OSF发生发展的病变关系，而且无法满足现今的基础实验要求。从目前文献看，还未能获得令人满意的OSF模型。如果要探索OSF发生发展和疾病转归，现有模型都不具有确实的可行性，可靠性。本模型首次采用高浓度槟榔碱饮水法进行建模，避免了注射和涂布可能造成的混杂因素影响，减少成模时间，提高了成摸成功率，而且诱发的OSF与人OSF具有高度相似性。

发明内容

本发明的目的是提供了一种口腔黏膜下纤维化小鼠模型的构建方法，建立小鼠与人类OSF具有高度相似性的OSF模型，该方法简单，发病率高，诱导时间短，以该模型为基础，为人类OSF的治疗和防治提供有力的支持。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供一种口腔黏膜下纤维化小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：

(1)动物选择及分组：取8周龄雄性Balb/c小鼠40只为实验小鼠，并随机平均分成实验组和对照组；

(2)槟榔碱饮水剂配制：将常温下保存的槟榔碱，用自来水配成浓度500～2000mg/L的槟榔碱饮水剂，将槟榔碱饮水剂置于实验组小鼠饮水瓶内自由饮用；对照组小鼠以自来水自由饮用；

(3)动物喂养及处死：实验组采用槟榔碱饮水剂喂养8～20周，对照组同期给予自来水喂养，每4周随机处死各组4只小鼠，20周剩余小鼠全部处死；

(4)实验观察：对实验组和对照组分别进行一般观察，处死小鼠后，取口腔黏膜组织，采取苏木精—伊红染色法观察、MASSON三色染色和Van Gieson染色法观察，免疫组化谱I/III型胶原蛋白与免疫组化CD34染色观察；

(5)构建小鼠OSF模型：通过步骤(1)至(4)步骤，得出槟榔碱化学诱导法成功建立小鼠OSF模型，并建立档案构成模型。

优选地，所述槟榔碱饮水剂的浓度为2000mg/L。

所述实验小鼠为：8周龄雄性Balb/c小鼠，SPF级，体重(18.52±1.15)g，在室温18～25℃、湿度30％～50％、标准饲料喂养、24h光暗循环条件下饲养。

所述一般观察为：实验过程中每天观察小鼠精神状况、活动度、饮水量等情况，每周记录小鼠饮水量及体重变化。每4周处死小鼠后，观察口腔内变化，记录口腔内黏膜色泽，质地等是否改变，是否有斑块、溃疡或肿物出现，观察纤维条索的范围、张口受限情况。

所述苏木精–伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,简称HE染色)

观察为：处死小鼠后立即取口腔组织黏膜(带部分深部肌肉组织)，食管、胃、肝、脾、肺、肾、小肠、大肠等组织，用10％的中性甲醛溶液固定，常规组织处理，石蜡包埋，4μm切片，苏木素伊红染色，进行组织病理学观察。口腔黏膜病变组织按OSF病理学标准进行分期，即最早期、早期、中期、晚期。

所述MASSON三色染色和Van Gieson染色观察为：处死小鼠取得口腔组织黏膜，用10％的中性甲醛溶液固定，常规组织处理，石蜡包埋，4μm切片，分别按MASSON试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)和Van Gieson试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)染色观察口腔黏膜早期纤维变化情况。

所述免疫组化广谱I/III型胶原蛋白观察胶原情况与免疫组化CD34染色观察上皮下血管数量为：采用免疫组化ABC法，按照常规操作：小鼠口腔黏膜组织蜡块以4μm的厚度切片，经水化，抑制内源性过氧化物酶，消除非特异性染色后,分别滴加一抗CD34(小鼠多克隆抗体，购自武汉博士德生物工程有限公司，按1:100稀释)、I型胶原蛋白(小鼠多克隆抗体，购自武汉博士德生物工程有限公司，按1:250稀释)、III型胶原蛋白(小鼠多克隆抗体，购自武汉博士德生物工程有限公司，按1:180稀释)、同时，阳性对照釆用对照组小鼠口腔黏膜组织,阴性对照釆用PBS代替一抗，4℃过夜；后期显色采用SP试剂盒(羊抗鼠抗兔通用型，北京中杉金桥生物技术有限公司)显色,脱水透明封片。结果判定：CD34阳性反应物为浅棕色至深棕色颗粒，分布于血管内皮细胞。结果判定：I、III型胶原蛋白阳性反应物为浅棕色至深棕色颗粒，分布于黏膜固有层。

本发明口腔黏膜下纤维化小鼠模型的构建方法，使用500～2000mg/L的槟榔碱饮水剂喂养Balb/c小鼠20周，获得小鼠OSF模型与人类OSF具有高度相似性，即病变发生、发展的完整性，可以观察到最早期-早期-中期-晚期OSF各阶段的临床症状和病理学表现。而且采用多种检测方法，相互验证，排除了其它相关口腔纤维病变的干扰，提高了诊断的准确性和可重复性。该动物模型发病率高(100％)、发病部位多样化，口腔内各部位黏膜均可发病，诱导的方法简便自然，通过小鼠自由饮水，防止了物理刺激及其它化学药物刺激的影响，效果理想，诱导时间短，为人类OSF的治疗和防治提供有力的工具。

附图说明

图1：小鼠不同时间段舌部(舌根)黏膜的组织病理学变化(HE×200)图。各时间段实验组(D、E、F)与对照组(A、B、C)对比：可见上皮萎缩、黏膜固有层、黏膜下层胶原堆积和微血管病变，并随给药时间的延长，逐渐加重，最后可见固有层明显的玻璃样变。说明构建模型成功。

图2：不同时间段小鼠舌黏膜的胶原组织病理学变化(Masson×200，V.G×200)。对照组：Masson染色(A)和V.G染色(E)，胶原纤维细长，走向平直，排列疏松(黑色箭头)；实验组:8周Masson染色(A)和V.G染色(E)显示少量蓝染和红染区域，随给药时间延长,12周Masson染色(C)和V.G染色(G)可见较为致密的胶原纤维带，至16周Masson染色(D)和V.G染色(H)，紧贴着上皮下方的胶原排列成明显致密的胶原纤维带，胶原纤维与对照组相比明显增多，胶原纤维染色颜色深且明显，蓝色区域和淡红色区域相呼应。

图3：不同时间段I型胶原蛋白和III胶原蛋白在舌部表现(×200)。I型胶原蛋白(A-D)，III胶原蛋白(E-H)。正常舌黏膜(A，E)；8周(B，F)；16周(C，G)；20周(D，H)。I型胶原与疾病的发展相一致，以呈弥漫的、散在的方式分布在固有层和黏膜下层(B-D)。8周III型胶原(F)在固有层轻微免疫阳性。到16周时，III型胶原明显表达(G)，而在20周(H)表达完全丧失。

图4：不同时间段血管计数。实验组血管数量先缓慢增加，至第12周两组对比有统计学意义，然后实验组血管数量下降，至20周两组对比有统计学意义(配对“t”检验，*<0.05)。

具体实施方式

实施例1

(1)动物选择及分组：取8周龄雄性Balb/c小鼠40只为实验小鼠，并随机平均分成实验组和对照组；

实验小鼠的条件为：所述的实验小鼠为：8周龄雄性Balb/c小鼠，SPF级，体重(18.52±1.15)g，在室温18～25℃、湿度30％～50％、标准饲料喂养、24h光暗循环条件下饲养；

(2)槟榔碱饮水剂配制：将常温下保存的槟榔碱(arecoline)，用自来水配成浓度2000mg/L药物置于实验组小鼠饮水瓶内自由饮用。对照组小鼠以自来水自由饮用；

(3)动物喂养及处死：实验组采用槟榔碱饮水剂喂养20周，对照组同期给予自来水喂养，每4周随机处死各组4只小鼠，20周剩余小鼠全部处死；

(4)实验观察：对实验组和对照组分别进行一般观察，处死小鼠后，取口腔黏膜组织，采取苏木精–伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,简称HE染色)观察、MASSON三色染色和Van Gieson染色法观察，免疫组化谱I/III型胶原蛋白与免疫组化CD34染色观察；

一般观察为：

实验过程中每天观察小鼠精神状况、活动度、饮水量等情况，每周记录小鼠饮水量及体重变化。每4周处死小鼠后，观察口腔内变化，记录口腔内黏膜色泽，质地等是否改变，是否有斑块、溃疡或肿物出现，观察纤维条索的范围、张口受限情况。

HE染色观察为：

处死小鼠后立即取口腔组织黏膜(带部分深部肌肉组织)，食管、胃、肝、脾、肺、肾、小肠、大肠等组织，用10％的中性甲醛溶液固定，常规组织处理，石蜡包埋，4μm切片，苏木素伊红染色，进行组织病理学观察。口腔黏膜病变组织按OSF病理学标准进行分期，即最早期、早期、中期、晚期。

MASSON三色染色和Van Gieson染色观察为：

处死小鼠取得口腔组织黏膜，用10％的中性甲醛溶液固定，常规组织处理，石蜡包埋，4μm切片，分别按MASSON试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)和Van Gieson试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)染色观察口腔黏膜早期纤维变化情况。

免疫组化广谱I/III型胶原蛋白观察胶原情况与免疫组化CD34染色观察上皮下血管数量为：

采用免疫组化ABC法，按照常规操作：小鼠口腔黏膜组织蜡块以4μm的厚度切片,经水化,抑制内源性过氧化物酶,消除非特异性染色后,分别滴加一抗CD34(小鼠多克隆抗体，购自武汉博士德生物工程有限公司，按1:100稀释)、I型胶原蛋白(小鼠多克隆抗体，购自武汉博士德生物工程有限公司，按1：250稀释)、III型胶原蛋白(小鼠多克隆抗体，购自武汉博士德生物工程有限公司，按1:180稀释)、同时，阳性对照釆用对照组小鼠口腔黏膜组织,阴性对照釆用PBS代替一抗，4℃过夜；后期显色采用SP试剂盒(羊抗鼠抗兔通用型，北京中杉金桥生物技术有限公司)显色，脱水透明封片。结果判定：CD34阳性反应物为浅棕色至深棕色颗粒，分布于血管内皮细胞。结果判定：I、III型胶原蛋白阳性反应物为浅棕色至深棕色颗粒，分布于黏膜固有层。

观察结果(如图1、2、3、4)：

实验第2周起发现实验组小鼠出现体重下降，但第4周后发现体重缓慢增加，待实验第8周后，实验组小鼠体重趋于稳定，平均体重为(17.52±1.15)g。对照组小鼠平均体重为(27.52±1.23)g。实验组小鼠后期出现毛色暗哑，活动度降低，不愿进食等。对照组小鼠毛色鲜亮、食欲、活动度良好。实验组小鼠口腔黏膜从实验第8周起开始逐渐出现发白、僵硬，至实验第20周所有小鼠黏膜均不同程度的出现上述变化，但未见明显的纤维条索形成。对照组口腔黏膜颜色、质地变化不明显。随着时间的推移,实验组小鼠张口度逐渐减小，对照组小鼠张口度逐渐增加，从实验第16周开始，两组小鼠的张口度差异显著。实验组小鼠第8周起，舌部组织开始出现了OSF样改变，12周后，颊腭部组织也出现了OSF样改变。实验组小鼠早期口腔黏膜上皮开始呈现异常正角化，角化层萎缩，纤维细胞可见饱满的细胞核，淋巴细胞浸润，固有层增厚，血管数量增加，血管充血明显，管径改变。随用药时间延长，上皮钉突逐渐变浅、小鼠，固有层厚度增厚越加明显，上皮下血管出现先充血扩张后萎缩消失的渐变过程，药物诱导至第20周，上皮厚度持续降低，可见萎缩性外观。固有层胶原呈无序、波状的外形排序纤维致密，细胞数量减少，基底层细胞破坏明显。胶原纤维密度增加区域，可见类玻璃样变。固有层血管缺乏，被纤维组织包绕，黏膜下肌肉可见纤维包裹，大多数情况可见肌层萎缩。Masson染色显示胶原呈蓝紫色分布，对照组少量染色阳性的蓝紫色弹性纤维分布在黏膜固有层，胶原纤维细长，走向平直，排列疏松，较粗的弹性纤维发出许多微细长的纤维延伸至乳头结缔组织内。这些弹性纤维的微细终末支在上皮的基底细胞下方交织成弹性纤维网。实验组颊黏膜固有层厚度变宽，胶原纤维在此处沉积得厚而致密，粗细不等，紧贴着上皮下方的胶原排列成明显致密的胶原纤维带，随着时间增加(8周、12周、16周)，胶原纤维与对照组相比明显增多，胶原纤维染色后颜色亦变的更深。此外，通过Van Gieson染色显示鲜红色的密集胶原与Masson染色相对应，并有类似的胶原变化，相互印证。由以上结果可知，8周时，舌部组织出现OSF早期病变，12周时，颊、腭部组织相继出现OSF早期病变，至16周，舌、腭、颊部组织出现OSF中期病变，诱导致20周，舌、腭部组织出现OSF晚期病变。通过CD34计数上皮下血管数量，在显微镜高倍视野下对实验、对照组小鼠口腔黏膜下血管进行计数后发现：随着时间增加，2组血管数量均逐渐增加，而且实验组增加更为明显，到12周后，2组血管数量差异明显，表现为实验组血管计数明显多于对照组；但是随着给药时间延长，实验组血管数量反而开始出现下降，到20周时2组血管差异具有统计学意义，实验组表现为明显减少。与临床人OSF血管变化相一致。通过I、III型胶原含量半定量分析，发现I型胶原随诱导时间延长，含量明显增加，与对照组差异明显，而III型胶原无明显变化，这与人OSF I、III型病变一致，均表现为胶原堆积增加，降解减少为主的胶原病变情况。

(5)构建小鼠OSF模型：通过步骤(1)至(4)，得出槟榔碱化学诱导法成功建立小鼠OSF模型，并建立档案构成模型。

实施例2

(1)动物选择及分组：取8周龄雄性Balb/c小鼠40只为实验小鼠，并随机平均分成实验组和对照组；

实验小鼠的条件为：所述的实验小鼠为：8周龄雄性Balb/c小鼠，SPF级，体重(18.52±1.15)g，在室温18～25℃、湿度30％～50％、标准饲料喂养、24h光暗循环条件下饲养；

(2)槟榔碱饮水剂配制：将常温下保存的槟榔碱(arecoline)，用自来水配成浓度500mg/L药物置于实验组小鼠饮水瓶内自由饮用。对照组小鼠以自来水自由饮用；

(3)动物喂养及处死：实验组采用槟榔碱饮水剂喂养20周，对照组同期给予自来水喂养，每4周随机处死各组4只小鼠，20周剩余小鼠全部处死；

(4)实验观察：对实验组和对照组分别进行一般观察，处死小鼠后，取口腔黏膜组织，采取苏木精–伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,简称HE染色)观察、MASSON三色染色和Van Gieson染色法观察，免疫组化谱I/III型胶原蛋白与免疫组化CD34染色观察；

一般观察为：

实验过程中每天观察小鼠精神状况、活动度、饮水量等情况，每周记录小鼠饮水量及体重变化。每4周处死小鼠后，观察口腔内变化，记录口腔内黏膜色泽，质地等是否改变，是否有斑块、溃疡或肿物出现，观察纤维条索的范围、张口受限情况。

HE染色观察为：

处死小鼠后立即取口腔组织黏膜(带部分深部肌肉组织)，食管、胃、肝、脾、肺、肾、小肠、大肠等组织，用10％的中性甲醛溶液固定，常规组织处理，石蜡包埋，4μm切片，苏木素伊红染色，进行组织病理学观察。口腔黏膜病变组织按OSF病理学标准进行分期，即最早期、早期、中期、晚期。

MASSON三色染色和Van Gieson染色观察为：

处死小鼠取得口腔组织黏膜，用10％的中性甲醛溶液固定，常规组织处理，石蜡包埋，4μm切片，分别按MASSON试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)和Van Gieson试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)染色观察口腔黏膜早期纤维变化情况。

免疫组化广谱I/III型胶原蛋白观察胶原情况与免疫组化CD34染色观察上皮下血管数量为：

采用免疫组化ABC法，按照常规操作：小鼠口腔黏膜组织蜡块以4μm的厚度切片,经水化,抑制内源性过氧化物酶,消除非特异性染色后,分别滴加一抗CD34(小鼠多克隆抗体，购自武汉博士德生物工程有限公司，按1:100稀释)、I型胶原蛋白(小鼠多克隆抗体，购自武汉博士德生物工程有限公司，按1：250稀释)、III型胶原蛋白(小鼠多克隆抗体，购自武汉博士德生物工程有限公司，按1:180稀释)、同时，阳性对照釆用对照组小鼠口腔黏膜组织,阴性对照釆用PBS代替一抗，4℃过夜；后期显色采用SP试剂盒(羊抗鼠抗兔通用型，北京中杉金桥生物技术有限公司)显色，脱水透明封片。结果判定：CD34阳性反应物为浅棕色至深棕色颗粒，分布于血管内皮细胞。结果判定：I、III型胶原蛋白阳性反应物为浅棕色至深棕色颗粒，分布于黏膜固有层。

观察结果(如图1、2、3、4)：

实验第6周起发现实验组小鼠出现体重下降，但第8周后发现体重缓慢增加，待实验第10周后，实验组小鼠体重趋于稳定，平均体重为(19.31±0.87)g。对照组小鼠平均体重为(26.89±1.57)g。实验组小鼠后期出现毛色暗哑，活动度降低，不愿进食等。对照组小鼠毛色鲜亮、食欲、活动度良好。实验组小鼠口腔黏膜从实验第14周起开始逐渐出现发白、僵硬，至实验第20周所有小鼠黏膜均不同程度的出现上述变化，但未见明显的纤维条索形成。对照组口腔黏膜颜色、质地变化不明显。随着时间的推移,实验组小鼠张口度逐渐减小，对照组小鼠张口度逐渐增加，至实验第20周，两组小鼠的张口度差异显著。实验组小鼠第12周起，舌部组织开始出现了OSF样改变，16周后，颊腭部组织也出现了OSF样改变。实验组小鼠早期口腔黏膜上皮开始呈现异常正角化，角化层萎缩，纤维细胞可见饱满的细胞核，淋巴细胞浸润，固有层增厚，血管数量增加，血管充血明显，管径改变。随用药时间延长，上皮钉突逐渐变浅、小鼠，固有层厚度增厚越加明显，上皮下血管出现先充血扩张后萎缩消失的渐变过程，药物诱导至第20周，上皮厚度持续降低，可见萎缩性外观。固有层胶原呈无序、波状的外形排序纤维致密，细胞数量减少，基底层细胞破坏明显。胶原纤维密度增加区域，但未见明显类玻璃样变。固有层血管缺乏，被纤维组织包绕，黏膜下肌肉可见纤维包裹，大多数情况可见肌层萎缩。Masson染色显示胶原呈蓝紫色分布，对照组少量染色阳性的蓝紫色弹性纤维分布在黏膜固有层，胶原纤维细长，走向平直，排列疏松，较粗的弹性纤维发出许多微细长的纤维延伸至乳头结缔组织内。这些弹性纤维的微细终末支在上皮的基底细胞下方交织成弹性纤维网。实验组颊黏膜固有层厚度变宽，胶原纤维在此处沉积得厚而致密，粗细不等，紧贴着上皮下方的胶原排列成明显致密的胶原纤维带，随着时间增加(12周、16周、20周)，胶原纤维与对照组相比明显增多，胶原纤维染色后颜色亦变的更深。此外，通过Van Gieson染色显示鲜红色的密集胶原与Masson染色相对应，并有类似的胶原变化，相互印证。由以上结果可知，12周时，舌部组织出现OSF早期病变，16周时，颊、腭部组织相继出现OSF早期病变，至20周，舌、腭部组织出现OSF中期病变。通过CD34计数上皮下血管数量，在显微镜高倍视野下对实验、对照组小鼠口腔黏膜下血管进行计数后发现：随着时间增加，2组血管数量均逐渐增加，而且实验组增加更为明显，到16周后，2组血管数量差异明显，表现为实验组血管计数明显多于对照组；但是随着给药时间延长，实验组血管数量反而开始出现下降，到20周时2组血管差异具有统计学意义，实验组表现为明显减少。与临床人OSF血管变化相一致。通过I、III型胶原含量半定量分析，发现I型胶原随诱导时间延长，含量明显增加，与对照组差异明显，而III型胶原无明显变化，这与人OSF I、III型病变一致，均表现为胶原堆积增加，降解减少为主的胶原病变情况。

(5)构建小鼠OSF模型：通过步骤(1)至(4)，得出槟榔碱化学诱导法成功建立小鼠OSF模型，并建立档案构成模型。

实施例3

(1)动物选择及分组：取8周龄雄性Balb/c小鼠40只为实验小鼠，并随机平均分成实验组和对照组；

实验小鼠的条件为：所述的实验小鼠为：8周龄雄性Balb/c小鼠，SPF级，体重(18.52±1.15)g，在室温18～25℃、湿度30％～50％、标准饲料喂养、24h光暗循环条件下饲养；

(2)槟榔碱饮水剂配制：将常温下保存的槟榔碱(arecoline)，用自来水配成浓度1000mg/L药物置于实验组小鼠饮水瓶内自由饮用。对照组小鼠以自来水自由饮用；

(3)动物喂养及处死：实验组采用槟榔碱饮水剂喂养20周，对照组同期给予自来水喂养，每4周随机处死各组4只小鼠，20周剩余小鼠全部处死；

(4)实验观察：对实验组和对照组分别进行一般观察，处死小鼠后，取口腔黏膜组织，采取苏木精–伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,简称HE染色)观察、MASSON三色染色和Van Gieson染色法观察，免疫组化谱I/III型胶原蛋白与免疫组化CD34染色观察；

一般观察为：

实验过程中每天观察小鼠精神状况、活动度、饮水量等情况，每周记录小鼠饮水量及体重变化。每4周处死小鼠后，观察口腔内变化，记录口腔内黏膜色泽，质地等是否改变，是否有斑块、溃疡或肿物出现，观察纤维条索的范围、张口受限情况。

HE染色观察为：

处死小鼠后立即取口腔组织黏膜(带部分深部肌肉组织)，食管、胃、肝、脾、肺、肾、小肠、大肠等组织，用10％的中性甲醛溶液固定，常规组织处理，石蜡包埋，4μm切片，苏木素伊红染色，进行组织病理学观察。口腔黏膜病变组织按OSF病理学标准进行分期，即最早期、早期、中期、晚期。

MASSON三色染色和Van Gieson染色观察为：

处死小鼠取得口腔组织黏膜，用10％的中性甲醛溶液固定，常规组织处理，石蜡包埋，4μm切片，分别按MASSON试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)和Van Gieson试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)染色观察口腔黏膜早期纤维变化情况。

免疫组化广谱I/III型胶原蛋白观察胶原情况与免疫组化CD34染色观察上皮下血管数量为：

采用免疫组化ABC法，按照常规操作：小鼠口腔黏膜组织蜡块以4μm的厚度切片,经水化,抑制内源性过氧化物酶,消除非特异性染色后,分别滴加一抗CD34(小鼠多克隆抗体，购自武汉博士德生物工程有限公司，按1:100稀释)、I型胶原蛋白(小鼠多克隆抗体，购自武汉博士德生物工程有限公司，按1：250稀释)、III型胶原蛋白(小鼠多克隆抗体，购自武汉博士德生物工程有限公司，按1:180稀释)、同时，阳性对照釆用对照组小鼠口腔黏膜组织,阴性对照釆用PBS代替一抗，4℃过夜；后期显色采用SP试剂盒(羊抗鼠抗兔通用型，北京中杉金桥生物技术有限公司)显色，脱水透明封片。结果判定：CD34阳性反应物为浅棕色至深棕色颗粒，分布于血管内皮细胞。结果判定：I、III型胶原蛋白阳性反应物为浅棕色至深棕色颗粒，分布于黏膜固有层。

观察结果(如图1、2、3、4)：

实验第3周起发现实验组小鼠出现体重下降，但第5周后发现体重缓慢增加，待实验第6周后，实验组小鼠体重趋于稳定，平均体重为(18.12±0.32)g。对照组小鼠平均体重为(27.24±1.43)g。实验组小鼠后期出现毛色暗哑，活动度降低，不愿进食等。对照组小鼠毛色鲜亮、食欲、活动度良好。实验组小鼠口腔黏膜从实验第12周起开始逐渐出现发白、僵硬，至实验第20周所有小鼠黏膜均不同程度的出现上述变化，但未见明显的纤维条索形成。对照组口腔黏膜颜色、质地变化不明显。随着时间的推移,实验组小鼠张口度逐渐减小，对照组小鼠张口度逐渐增加，从实验第18周开始，两组小鼠的张口度差异显著。实验组小鼠第8周起，舌部组织开始出现了OSF样改变，12周后，颊腭部组织也出现了OSF样改变。实验组小鼠早期口腔黏膜上皮开始呈现异常正角化，角化层萎缩，纤维细胞可见饱满的细胞核，淋巴细胞浸润，固有层增厚，血管数量增加，血管充血明显，管径改变。随用药时间延长，上皮钉突逐渐变浅、小鼠，固有层厚度增厚越加明显，上皮下血管出现先充血扩张后萎缩消失的渐变过程，药物诱导至第20周，上皮厚度持续降低，可见萎缩性外观。固有层胶原呈无序、波状的外形排序纤维致密，细胞数量减少，基底层细胞破坏明显。胶原纤维密度增加区域，腭部可见类玻璃样变。固有层血管缺乏，被纤维组织包绕，黏膜下肌肉可见纤维包裹，大多数情况可见肌层萎缩。Masson染色显示胶原呈蓝紫色分布，对照组少量染色阳性的蓝紫色弹性纤维分布在黏膜固有层，胶原纤维细长，走向平直，排列疏松，较粗的弹性纤维发出许多微细长的纤维延伸至乳头结缔组织内。这些弹性纤维的微细终末支在上皮的基底细胞下方交织成弹性纤维网。实验组颊黏膜固有层厚度变宽，胶原纤维在此处沉积得厚而致密，粗细不等，紧贴着上皮下方的胶原排列成明显致密的胶原纤维带，随着时间增加(8周、12周、16周)，胶原纤维与对照组相比明显增多，胶原纤维染色后颜色亦变的更深。此外，通过Van Gieson染色显示鲜红色的密集胶原与Masson染色相对应，并有类似的胶原变化，相互印证。由以上结果可知，8周时，舌部组织出现OSF早期病变，12周时，颊、腭部组织相继出现OSF早期病变，至16周，舌、腭部组织出现OSF中期病变，诱导致20周，舌、颊部处于OSF中期病变，腭部组织出现OSF晚期病变。通过CD34计数上皮下血管数量，在显微镜高倍视野下对实验、对照组小鼠口腔黏膜下血管进行计数后发现：随着时间增加，2组血管数量均逐渐增加，而且实验组增加更为明显，到12周后，2组血管数量差异明显，表现为实验组血管计数明显多于对照组；但是随着给药时间延长，实验组血管数量反而开始出现下降，到20周时2组血管差异具有统计学意义，实验组表现为明显减少。与临床人OSF血管变化相一致。通过I、III型胶原含量半定量分析，发现I型胶原随诱导时间延长，含量明显增加，与对照组差异明显，而III型胶原无明显变化，这与人OSF I、III型病变一致，均表现为胶原堆积增加，降解减少为主的胶原病变情况。

(5)构建小鼠OSF模型：通过步骤(1)至(4)，得出槟榔碱化学诱导法成功建立小鼠OSF模型，并建立档案构成模型。

本发明口腔黏膜下纤维化小鼠模型的构建方法分别采用浓度500mg/L、1000mg/L、2000mg/L的槟榔碱饮水剂喂养小鼠，通过三种实施例的结果与常规注射和涂布槟榔提取液诱导小鼠对比，对比数据如表1所示，从表1中可以看出：采用本发明口腔黏膜下纤维化小鼠模型的构建方法成功获得小鼠OSF模型与人类OSF具有高度相似性，即病变发生、发展的完整性，该动物模型发病率高(100％)，且成模时间短。

表1 本发明采用三个实施例与常规诱导数据比较

以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。